Method Article

Дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток человека в предшественники бета-клеток поджелудочной железы в системе 2D-культур

DOI:

10.3791/63298

⸱

December 16th, 2021

 , 
1College of Health and Life Sciences, Hamad Bin Khalifa University (HBKU), Qatar Foundation, 2Diabetes Research Center, Qatar Biomedical Research Institute (QBRI), Hamad Bin Khalifa University (HBKU), Qatar Foundation (QF)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Настоящий протокол описывает усовершенствованный метод увеличения коэкспрессии факторов транскрипции PDX1 и NKX6.1 в предшественниках поджелудочной железы, полученных из плюрипотентных стволовых клеток человека (hPSCs) в планарных монослоях. Это достигается путем пополнения свежей матрицы, манипулирования плотностью клеток и диссоциации эндодермальных клеток.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Человеческие плюрипотентные стволовые клетки (hPSCs) являются отличным инструментом для изучения раннего развития поджелудочной железы и исследования генетических факторов диабета. Клетки, полученные из hPSC инсулина, могут быть получены для клеточной терапии и моделирования заболеваний, однако, с ограниченной эффективностью и функциональными свойствами. hPSC-производные предшественники поджелудочной железы, которые являются предшественниками бета-клеток и других эндокринных клеток, при совместной экспрессии двух факторов транскрипции PDX1 и NKX6.1 указывают предшественников функциональных, инсулин-секретирующих бета-клеток как in vitro , так и in vivo. Предшественники поджелудочной железы, полученные из hPSC, в настоящее время используются для клеточной терапии у пациентов с диабетом 1 типа в рамках клинических испытаний. Однако современные процедуры не генерируют высокую долю NKX6.1 и предшественников поджелудочной железы, что приводит к когенерации нефункциональных эндокринных клеток и нескольких чувствительных к глюкозе, инсулин-секретирующих клеток. Таким образом, эта работа разработала расширенный протокол для генерации прародителей поджелудочной железы, полученных из hPSC, которые максимизируют совместную экспрессию PDX1 и NKX6.1 в 2D-монослое. Такие факторы, как плотность клеток, наличие свежей матрицы и диссоциация эндодермальных клеток, полученных из hPSC, модулируются, что увеличивает уровни PDX1 и NKX6.1 в генерируемых предшественниках поджелудочной железы и сводит к минимуму приверженность альтернативной печеночной линии. Исследование подчеркивает, что манипулирование физической средой клетки во время дифференцировки in vitro может повлиять на спецификацию родословной и экспрессию генов. Таким образом, текущий оптимизированный протокол облегчает масштабируемую генерацию коэкспрессионных предшественников PDX1 и NKX6.1 для клеточной терапии и моделирования заболеваний.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Диабет является сложным метаболическим расстройством, затрагивающим миллионы людей во всем мире. Добавление инсулина считается единственным вариантом лечения диабета. Более продвинутые случаи лечатся бета-клеточной заместительной терапией, достигаемой путем трансплантации либо целой трупной поджелудочной железы, либо островков 1,2. Несколько вопросов связаны с трансплантационной терапией, такие как ограничение доступности и качества ткани, инвазивность процедур трансплантации в дополнение к постоянной потребности в иммунодепрессантах. Это обусловливает необходимость открытия новых и альтернативных вариантов бета-клеточной заместительной терапии 2,3. Человеческие плюрипотентные стволовые клетки (hPSCs) недавно стали многообещающим инструментом для понимания биологии поджелудочной железы человека и неисчерпывающим и потенциально более персонализированным источником для трансплантационной терапии 4,5,6,7. hPSCs, включая человеческие эмбриональные стволовые клетки (hESCs) и индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки (hiPSCs), обладают высокой способностью к самообновлению и дают начало любому типу тканей человеческого тела. hESCs получают из внутренней клеточной массы эмбриона, а hiPSCs перепрограммируются из любой соматической клетки 4,8.

Протоколы направленной дифференцировки оптимизированы для генерации бета-клеток поджелудочной железы из hPSCs, которые последовательно направляют hPSCs через стадии развития поджелудочной железы invitro. Эти протоколы генерируют островковые органоиды, полученные из hPSC. Хотя они значительно улучшились в увеличении доли бета-клеток поджелудочной железы в них, эффективность протоколов сильно варьируется. Он не увеличивается до более чем ~40% NKX6.1+/INSULIN+ или C-PEPTIDE + клеток 5,9,10,11,12,13. Однако генерируемые бета-клетки не полностью идентичны бета-клеткам взрослого человека с точки зрения их транскрипционных и метаболических профилей и их реакции на глюкозу 4,5,14. Бета-клеткам, полученным из hPSC, отсутствует экспрессия генов ключевых маркеров бета-клеток, таких как PCSK2, PAX6, UCN3, MAFA, G6PC2 и KCNK3 по сравнению с островками5 взрослых людей. Кроме того, бета-клетки, полученные из hPSC, уменьшают передачу сигналов кальция в ответ на глюкозу. Они загрязнены совместно генерируемыми полигормональными клетками, которые не секретируют соответствующее количество инсулина в ответ на повышение уровня глюкозы5. С другой стороны, производные от hPSC предшественники поджелудочной железы, которые являются предшественниками островков, могут генерироваться более эффективно in vitro по сравнению с бета-клетками и при трансплантации in vivo могут созревать в функциональные, секретирующие инсулин бета-клетки15,16. Клинические испытания в настоящее время сосредоточены на демонстрации их безопасности и эффективности при трансплантации у субъектов СД1.

Примечательно, что экспрессия транскрипционных факторов PDX1 (панкреатический и дуоденальный гомеобокс 1) и NKX6.1 (NKX6 Homeobox 1) в пределах одной и той же клетки-предшественника поджелудочной железы имеет решающее значение для приверженности бета-клеточной линии5. Предшественники поджелудочной железы, которые не экспрессируют NKX6.1, дают начало полигормональным эндокринным клеткам или нефункциональным бета-клеткам17,18. Таким образом, высокая коэкспрессия PDX1 и NKX6.1 на стадии предшественника поджелудочной железы необходима для получения в конечном итоге большого количества функциональных бета-клеток. Исследования показали, что эмбриоидное тело или 3D-культура усиливает PDX1 и NKX6.1 в предшественниках поджелудочной железы, где дифференцирующие клетки агрегируются, варьируясь между 40%-80% PDX1 + / NKX6.1 + популяции12,19. Однако, по сравнению с культурами суспензии, культуры 2D-дифференцировки являются более экономически эффективными, осуществимыми и удобными для применения на нескольких клеточных линиях5. Недавно мы показали, что монослойные дифференцировочные культуры дают более 90% PDX1+/NKX6.1+, коэкспрессирующих hPSC-производных предшественников поджелудочной железы 20,21,22. Сообщенный способ придавал высокую реплицирующую способность генерируемым прародителям поджелудочной железы и предотвращал альтернативные спецификации судьбы, такие как печеночная линия21. Таким образом, в настоящем описании данный протокол демонстрирует высокоэффективный способ дифференцировки гПСК к предшественникам бета-клеток поджелудочной железы, совместно экспрессирующим PDX1 и NKX6.1. Этот метод использует технику диссоциации эндодермы, полученной из hPSC, и манипулирования плотностью клеток с последующей расширенной передачей сигналов FGF и ретиноидов, а также ингибированием Hedgehog для стимулирования коэкспрессии PDX1 и NKX6.1 (рисунок 1). Этот метод может способствовать масштабируемой генерации прекурсоров бета-клеток поджелудочной железы, полученных из hPSC, для трансплантационной терапии и моделирования заболеваний.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Исследование было одобрено соответствующим институциональным комитетом по этике исследований и выполнено в соответствии с этическими стандартами, изложенными в Хельсинкской декларации 1964 года и ее более поздних поправках или сопоставимых этических стандартах. Протокол был одобрен Институциональным наблюдательным советом (IRB) HMC (No 16260/16) и Катарским институтом биомедицинских исследований (QBRI) (No 2016-003). Эта работа оптимизирована для hESCs, таких как H1, H9 и HUES8. Образцы крови были получены от здоровых людей из больницы Hamad Medical Corporation (HMC) с полного информированного согласия. ИПСК генерируются из мононуклеарных клеток периферической крови (ПБМК) контрольного, здорового индивидуума23.

1. Подготовка питательных сред

  1. Подготовка среды культивирования плюрипотентных стволовых клеток человека (hPSC)
    1. Получение питательной среды hPSC из коммерчески доступной среды для поддержания и расширения эмбриональных стволовых клеток человека путем добавления 100 единиц/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (см. Таблицу материалов). Aliquot и хранить весь носитель при -20 °C в течение длительного времени или 4 °C для немедленного использования.
  2. Подготовьте дифференцировочную среду этапа 1 (для окончательной энтодермы (DE)).
    1. Получают базальную среду из среды MCDB 131, добавляя 0,5% не содержащего жирных кислот бычьего сывороточного альбумина (FFA-BSA), 1,5 г/л бикарбоната натрия (NaHCO3), 10 мМ глюкозы, 2 мМ Глутамамакса, 100 единиц/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (см. Таблицу материалов). Отфильтруйте подготовленный материал с помощью фильтра 0,2 мкм и храните при температуре 4 °C.
    2. Готовят среду стадии 1, содержащую CHIR99021, из базальной среды (полученной на стадии 1.2.1) путем нагревания базальной среды при 37 °C и последующего добавления 2 мкМ CHIR99021, 100 нг/мл активина А, 10 мкМ ингибитора породы (Y-27632) и 0,25 мМ витамина С (см. Таблицу материалов). Хорошо смешайте добавленную среду и накройте ее алюминиевой фольгой, чтобы защитить ее от света.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот носитель будет использоваться только в первый день дифференциации.
    3. Подготовьте среду стадии 1 без CHIR99021 из базальной среды, разогрев ее при 37 °C и дополнив ее 100 нг/мл активина А и 0,25 мМ витамина С и хорошо перемешайте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 5 нг/мл базового FGF или FGF2 могут быть дополнительно добавлены к этому носителю. Этот носитель будет использоваться в течение оставшихся дней этапа 1.
  3. Подготовка среды дифференциации стадии 2 (для примитивной кишечной трубки; ПГТ).
    1. Готовят дифференцировочную среду стадии 2, содержащую ингибитор породы из базальной среды, нагревая ее при 37 °C и дополняя 50 нг/мл FGF10, 50 нг/мл NOGGIN, 0,25 мкМ CHIR99021, 10 мкМ Y-27632 (ингибитор породы) и 0,25 мМ витамина С.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта среда используется в день диссоциации эндодермальных клеток.
    2. Подготовка среды дифференцировки стадии 2 без ингибитора породы в соответствии с той же процедурой для среды, приготовленной на стадии 1.3.1, исключая ингибитор породы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот носитель используется во второй день Этапа 2.
  4. Подготовьте 3 стадию дифференциационных сред (для задней передней кишки).
    1. Готовят ДМЭМ-носители, содержащие 4,5 г/л глюкозы, затем добавляют 1% пенициллина-стрептомицина и 2 мМ Глутамакса и используют в качестве базальных сред для стадий 3 и 4.
    2. Согреть среду DMEM (приготовленную на стадии 1.4.1) и дополнить 2 мкМ ретиноевой кислоты, 0,25 мкМ SANT-1, 50 нг/мл FGF10, 50 нг/мл NOGGIN, 0,25 мМ витамина С и 1% добавкой B27 без витамина А (см. Таблицу материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот носитель используется в течение 4 дней Стадии 3 для P2-D (Протокол 2, оптимизированный, диссоциированный) и 2 дней Стадии 3 для P1-ND (Протокол 1, неоптимизированный, недиссоциированный).
  5. Подготовьте 4 стадию дифференциаторной среды (для предшественников поджелудочной железы).
    1. Добавьте DMEM, содержащий 4,5 г/л глюкозы со 100 нг/мл EGF, 10 мМ никотинамида, 50 нг/мл NOGGIN, 0,25 мМ витамина С и 1% добавки B27 без витамина А (см. Таблицу материалов). Используйте этот носитель для всех дней этапа 4.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте все реагенты при соответствующих температурах, и все цитокины и чувствительные реагенты должны быть аликвотированы. Разморозить аликвоцитированные реагенты и добавить в базальные среды в момент изменения дифференцирующих сред. Составы различных дифференцирующих сред приведены в таблице 1.

2. Приготовление посуды с матричным покрытием из базальной мембраны

  1. Оттаивать коммерчески доступную подвальную матрицу (см. Таблицу материалов) и аликвоту на льду; заморозить аликвоты при -20 °C.
  2. Перед нанесением на ткани культуры посуды разморозьте замороженные аликвоты на льду. Добавьте соответствующий объем мембранного матричного раствора в охлажденную среду KO-DMEM/F-12 (KnockOut DMEM/F-12) (см. Таблицу материалов) для достижения желаемой разбавленной концентрации и хорошо перемешайте. Хранить раствор разбавленной матрицы при 4 °C для немедленного использования.
  3. Покрыть поверхность тканевых пластин, обработанных культурой (см. Таблицу материалов), раствором разбавленной мембранной матрицы и поместить пластины при 37 °C в течение не менее 60 мин перед покрытием клеток. Используют разведение 1:50 мембранного матричного раствора в KO-DMEM/F-12 для покрытия клеток для эксперимента по дифференцировке поджелудочной железы и 1:80 для расширения недифференцированных гПСК.

3. Культура недифференцированных HPSC

  1. Прохождение hPSCs, когда колонии достигают слияния 70%-80%.
  2. Для прохождения промыть hPSCs один раз теплым PBS, аспирировать с помощью портативного вакуумного аспиратора внутри вытяжки для культивирования тканей и добавить 0,5 мМ раствора ЭДТА в PBS для покрытия поверхности колонии. Инкубировать при 37 °C, 5% CO2 в течение 1 мин или до тех пор, пока границы колоний не отсоединятся от поверхности плиты.
  3. Удалите раствор ЭДТА и соберите отсоединяющиеся колонии с помощью питательной среды hPSC с помощью микропипетки P1000. Центрифугировать собранные ячейки при 128 х г в течение 4 мин при комнатной температуре. Откажитесь от супернатанта и дополните клетки средой для культивирования hPSC, содержащей 10 мкМ Y-27632 (ингибитор породы)23,24.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пропускайте hPSCs по меньшей мере в соотношении 1:3 на посуде, покрытой мембранной матрицей 1:80. Тем не менее, для экспериментов по дифференциации, нанесите HPSC на посуду с покрытием 1:50.

4. Индукция дифференциации окончательной энтодермы (DE) в гПСК (Стадия 1)

  1. Когда колонии hPSC достигнут слияния 70%-80%, дважды промыть их теплым PBS и аспирировать с помощью портативного вакуумного аспиратора внутри вытяжки культуры тканей, чтобы начать дифференциацию стадии 1.
  2. Добавьте к колониям дифференцирующую среду стадии 1, содержащую CHIR99021 (из стадии 1.2.2), по 2 мл на 6-луночную пластину, и инкубируйте при 37 °C в течение 24 ч.
  3. На следующий день замените отработанную среду дифференцировки стадии 1 без CHIR99021 (шаг 1.2.3).
  4. Каждые 24 ч аспирируйте отработанную среду с помощью портативного вакуумного аспиратора внутри вытяжки культуры тканей и заменяйте ее свежей средой дифференцировки Stage 1 без CHIR99021.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этап 1 может быть продлен до 4 дней. Длина этапа 1 зависит от используемой линии hPSC и должна быть соответствующим образом оптимизирована.

5. Иммунофлуоресцентный анализ ДЭ, полученного из hPSC (Стадия 1)

  1. Для иммунофлуоресценции аспирировать отработанную среду с помощью портативного вакуумного аспиратора внутри вытяжки культуры тканей из колодцев и дважды промыть теплым PBS. Закрутите пластину, чтобы избавиться от остатков клеток.
  2. Покрыть поверхность скважин 4% параформальдегида (ПФА) для фиксации DE-клеток; например, добавьте 250 мкЛ ПФА на скважину 24-луночной плиты. Поместите тарелку на 2D шейкер по 20 х г в течение 20 мин.
  3. После фиксации промыть клетки DE трис-буферным физиологическим раствором с 0,5% Tween (TBST) (см. Таблицу материалов) и поместить пластину на шейкер при 20 х г в течение 10 мин. Повторите этот шаг еще раз.
  4. Пермеабилизируют фиксированные клетки, добавляя обильный объем фосфатно-буферного физиологического раствора с 0,5% тритона X-100 (PBST); например, добавьте 1 мл ПБСТ на лунку 24-луночной пластины и поместите пластину обратно на шейкер при 20 х г в течение 20 мин.
  5. Свежеприготовьте 5%-6% BSA в PBST в качестве блокирующего буфера и добавьте его в пермеабилизированные клетки. Инкубировать пластину не менее 1 ч в блокирующем растворе на шейкере.
  6. Разбавляют первичные антитела против SOX17 и FOXA2 вместе (см. Таблицу материалов) в 2%-3% BSA в растворе PBST. Добавьте комбинированные антитела к заблокированным клеткам и поместите пластину на шейкер при 4 °C на ночь на низкой скорости с легким встряхиванием.
    ПРИМЕЧАНИЕ: SOX17 и FOXA2 являются хорошо зарекомендовавшими себя маркерами DE25,26.
  7. На следующий день аспирируйте первичные антитела с помощью портативного вакуумного фильтра и трижды промывайте колодцы TBST, каждый раз промывая в течение 10 минут на шейкере.
  8. Приготовьте разведение 1:500 alexa fluor 488- и 568-конъюгированных вторичных антител (см. Таблицу материалов) против видов, в которых были выращены первичные антитела.
  9. Добавьте комбинацию вторичных антител к окрашенному колодцу и накройте пластину алюминиевой фольгой для защиты от света. Поместите тарелку на шейкер на 1 ч при комнатной температуре.
  10. Аспирировать раствор вторичных антител с помощью портативного вакуумного фильтра и промыть окрашенные колодцы TBST на шейкере в течение 10 мин, покрыв пластину фольгой. Повторите этап стирки в общей сложности три раза.
  11. Приготовьте 1 мкг/мл разведения Hoechst 33342 в PBS для окрашивания ядер. Добавьте раствор Hoechst в лунки и поместите тарелку на шейкер на 2-3 мин.
  12. Аспирируйте раствор Hoechst с помощью портативного вакуумного фильтра и дважды промывайте скважины PBS.
  13. Наконец, добавьте PBS к окрашенным клеткам и визуализируйте их с помощью перевернутого флуоресцентного микроскопа (см. Таблицу материалов) в темноте. Держите пластину покрытой фольгой, когда нет визуализации, чтобы свести к минимуму отбеливание флуорофора.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативно, проточная цитометрия может быть использована для оценки эффективности DE, как описано в шаге 9.2.

6. Генерация примитивной кишечной трубки (PGT) из hPSCs (Стадия 2)

ПРИМЕЧАНИЕ: Если иммунофлуоресцентный анализ на стадии 5.13 определяется как коэкспрессия SOX17-FOXA2 80% и выше, эксперимент переходит к стадии 2. Если эффективность составляет <80%, продлите продолжительность стадии с 1 до 4 дней.

  1. На 1-й день этапа 2 диссоциируют эндодермальные клетки, полученные из hPSC, используя TrypLE или Accutase (см. Таблицу материалов) для оптимизированного протокола P2-D. Промыть адгезивные клетки теплым PBS и добавить теплый 1 мл раствора TrypLE или Accutase на лунку 6-луночной пластины в течение 3-5 мин при 37 °C, 5% CO 2 или до тех пор, пока клетки не начнут отделяться друг от друга.
  2. Диссоциируют отслоившиеся листы или монослой клеток в лунках, а затем собирают их вместе в полипропиленовую трубку объемом 15 мл, используя базальную среду стадии 1/2 без цитокинов, содержащих не менее 0,5% фетальной бычьей сыворотки (FBS) или сыворотки KnockOut (KOSR) (см. Таблицу материалов).
  3. Раскрутите ячейки при 800 х г в течение 5 мин при 4 °C и выбросьте супернатант. Добавьте 1 мл стерильного PBS и повторно суспендируйте гранулу в отдельные клетки.
  4. Подсчитайте ячейки с помощью автоматического счетчика (см. Таблицу материалов), загрузив рекомендуемый объем ячеек в слайд камеры. Раскрутите повторно суспендированные ячейки при 800 х г в течение 5 мин при 4 °C и выбросьте супернатант.
  5. Повторно суспендируют гранулу в соответствующем объеме среды дифференцировки стадии 2, содержащей ингибитор породы при плотности 2,5-3,5 х 105 клеток/см2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это число может свестись к соотношению расщепления 1:2 для большинства клеточных линий, в зависимости от скорости пролиферации. Общий объем составит 2 мл среды с повторно суспендированными ячейками в 1 лунке из 6-луночной пластины.
  6. Нанесите повторно суспендированные клетки на пластины с мембранным матричным покрытием 1:50 (приготовленные на стадии 2) и инкубируйте их при 37 °C, 5% CO2 в инкубаторе.
  7. Через 24 ч заменить среду дифференцировочной средой стадии 2 без ингибитора породы (полученную на стадии 1.3.2).

7. Генерация задней передней кишки из гПСК (Стадия 3)

  1. Аспирируйте отработанную среду Стадии 2 с помощью портативного вакуумного аспиратора внутри вытяжки для культивирования тканей и промывайте клетки теплым PBS.
  2. Добавьте к клеткам среду дифференцировки стадии 3 со стадии 1.4 и инкубируйте при 37 °C, 5% CO2.
  3. Через 24 ч замените отработанные носители свежеприготовленными средами дифференциации стадии 3. Повторяйте это в общей сложности 4 дня для протокола P2-D (оптимизированного) и только 2 дня для недиссоциированного P1-ND.

8. Генерация прародителей поджелудочной железы из hPSCs (Стадия 4)

  1. После 4 дней обработки 3-го этапа промыть клетки теплым PBS, аккуратно закрутить пластину и аспирировать с помощью портативного вакуумного аспиратора. Затем добавьте в клетки среду дифференцировки стадии 4 с шага 1.5.
  2. Через 24 часа замените отработанный носитель свежеприготовленным носителем стадии 4. Повторяйте это в течение 4 дней.

9. Оценка эффективности дифференцировки генерации прародителей поджелудочной железы из гПСК

  1. Провести иммунофлуоресцентный анализ предшественников поджелудочной железы, полученных из hPSC (стадия 4) для экспрессии PDX1 и NKX6.1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: PDX1 и NKX6.1 являются хорошо зарекомендовавшими себя маркерами-предшественниками поджелудочной железы17,18.
    1. Выполняйте фиксацию, пермеабилизацию, блокирование, инкубацию антител и промывку в соответствии с этапом 5.
    2. Окрашивают hPSC-производные предшественники поджелудочной железы комбинацией антител PDX1 и NKX6.1 (см. Таблицу материалов), разведенных в 2%-3% BSA в PBST.
    3. Используйте 1:500 разведения соответствующих alexa fluor 488- и 568-конъюгированных вторичных антител (см. Таблицу материалов).
  2. Выполнение проточно-цитометрического анализа гениаторов поджелудочной железы, полученных из hPSC, для экспрессии PDX1 и NKX6.1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ проточной цитометрии маркеров поджелудочной железы в генерируемых предшественниках поджелудочной железы, полученных из hPSC, обеспечивает способ количественной оценки коэкспрессирующих клеток PDX1 и NKX6.1.
    1. В конце стадии 4 дважды промыть ячейки теплым PBS и добавить достаточное количество TrypLE или Accutase для покрытия поверхности скважин, например, 1 мл TrypLE или Accutase на скважину 6-луночной пластины. Поместите пластину в инкубатор на 5-7 мин или до тех пор, пока клетки не отсоединятся от поверхности.
    2. Диссоциируйте адгезивные листы клеток внутри скважины с помощью микропипетки P1000, прежде чем собирать их в полипропиленовую трубку объемом 15 мл.
    3. Раскрутите клетки в предшественниках поджелудочной железы, полученных из hPSC, при 800 х г в течение 5 мин при 4 °C, затем выбросьте супернатант. Промывайте клетки PBS, диссоциируя их на отдельные клетки. Подсчитайте ячейки с помощью автоматического счетчика (см. Таблицу материалов) и запишите концентрацию в количестве ячеек в мл.
    4. Открутите при 800 х г в течение 5 мин при 4 °C и выбросьте супернатант. Добавьте 200 мкл охлажденного PBS в гранулу и диссоциируют.
    5. Добавьте 2 мл охлажденного 80% этанола по каплям, с трубкой на вихре на низкой средней скорости (400 х г при комнатной температуре). Плотно закройте колпачки и поместите трубки, слегка наклоненные на шейкер при 4 °C на ночь.
    6. Раскрутите клетки при 800 x g в течение 5 мин при 4 °C и промывайте PBS, чтобы диссоциировать любые скопления фиксированных клеток.
    7. Блокируют неподвижные ячейки 5%-6% раствором BSA в ПБСТ в течение не менее 1 ч при комнатной температуре или 4 °C на ночь на шейкере.
    8. Окрашивание для маркеров предшественника поджелудочной железы, следуя приведенным ниже шагам.
      1. Распределите 2 000 000 клеток на каждое состояние, включая соответствующий контроль изотипа, зависящий от подкласса IgG видов хозяев первичного антитела, контроль незапятнанных и вторичных антител в 96-луночной V нижней пластине или 1,5 мл центрифужных трубок.
      2. Открутите пластину при 800 x g в течение 5 минут при 4 °C и переверните пластину быстрым движением, чтобы выбросить супернатант без потери гранул. Готовят первичные разведения антител в 3% растворе БСА (см. Таблицу материалов).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация первичных антител может составлять от 1:50 до 1:200.
      3. Инкубируют окрашенные клетки в течение не менее 2 ч при комнатной температуре или на ночь при 4 °C на шейкере с легким встряхиванием на низкой скорости.
      4. Промывайте окрашенные клетки TBST трижды, пипетируя клетки вверх и вниз в колодцах. Вращайте и отбрасывайте супернатант, как на шаге 9.2.8.2.
      5. Добавьте 1:500 разведения вторичных антител (Alexa fluor 488- и 647-конъюгированных антител), полученных в PBS (см. Таблицу материалов). Инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре.
      6. Промывайте окрашенные клетки TBST, по крайней мере, дважды, пипетируя клетки вверх и вниз. Раскрутите пластину и выбросьте супернатант, как показано на этапе 9.2.8.2.
      7. Соберите окрашенные клетки по меньшей мере в 100 мкл PBS и перенесите их в светозащитные трубки FACS (см. Таблицу материалов). Запустите образцы на машине проточной цитометрии.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Результаты показывают, что оптимизированный протокол P2-D (рис. 1A) повысил эффективность дифференцировки предшественников поджелудочной железы путем повышения регуляции совместной экспрессии PDX1 и NKX6.1 (рисунок 2A, B и рисунок 3A). В частности, результаты показали, что диссоциация эндодермальных клеток и их повторное покрытие на свежей мембранной матрице наряду с большей продолжительностью стадии 3 усиливают экс...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данной работе описан усовершенствованный протокол генерации предшественников поджелудочной железы из гПСК с высокой коэкспрессией PDX1 и NKX6.1. Диссоциация и повторное покрытие эндодермы, полученной из hPSC, при половинной плотности на свежей матрице привели к повышению PDX1 и NKX6.1 у предшественников поджелудочной железы, полученных из hPSC.

Хотя коктейль фактора роста для каждой стадии очень похож на P1-ND27, было показано, что более продолжительное лечение стадии...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа финансировалась за счет гранта Катарского национального исследовательского фонда (QNRF) (грант No. НПРП10-1221-160041).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
15 мл, конические, центрифужные пробиркиThermo Scientific339651
20X TBS Tween 20Thermo Scientific28360
24-луночные планшеты для культивирования, плоское дно с крышкойCostar3524
50 мл, конические, центрифужные пробиркиThermo Scientific339652
6-луночные планшеты для культивирования, многолуночные ThermoScientific
Технологии стволовых клетокаккутазы0-7920
активин АR& D338-ACВосстановлен в 4 мМ HCl
антитело Anti NKX6.1, мышиный моноклональныйDSHBF55A12-Cразбавлен до 1:100 для проточной цитометрии и 1:2000 для иммуноокрашивания
Anti-PDX1 антитело, поликлональноеAbcamab47308разведено до 1:100 для проточной цитометрии и 1:1000 для иммуноокрашивания
B27 минус Vit AThermoFisher12587010
Бычий сывороточный альбумин, фракция теплового шока, без жирных кислотSigmaA7030
CHIR 99021Tocris4423Восстановленный в ДМСО
DMEM, высокий уровень глюкозыThermoFisher41965047
Donkey anti-Mouse IgG (H + L) Высокоадсорбированное вторичное антитело, Alexa Fluor 568InvitrogenA10037
Donkey Anti-Rabbit IgG (H + L) Высокоадсорбированное вторичное антитело, Alexa Fluor 488A-21206
DPBS 1XThermoFisher14190144
EGFThermoFisherPHG0313восстановлено в 0,1% BSA в PBS
FGF10R& D345-FGВосстановленная в PBS
глюкозаSigma AldrichG8644
Hoechst 33258Sigma23491-45-4
Инвертированный микроскопOlympusIX73
KnockOut DMEM/F-12 (1X)Gibco12660-012
KnockOut SR замена сывороткиGibco10828-028
L-аскорбиновая кислота (витамин С)SigmaA92902Восстановленная в дистиллированной воде
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Матрица базальной мембраны Corning354230Aliquot размороженный бульон и заморозьте при -20C.
MCDB131ThermoFisher10372019
мышиный анти-SOX17ORIGENECF500096разбавлен до 1:100 для проточной цитометрии и 1:2000 для иммуноокрашивания
mTeSR PlusStem Cell Technologies85850Смешайте базальную среду с добавкой. Аликвоту и хранить при -20°С; С на более длительное время или при 4°С; C для мгновенного использования
фильтрующих установок Nalgene, 0,2 &; m PESThermoFisher566-0020
НикотинамидSigma72340Восстановленный в дистиллированной воде
NOGGINR& D6057-NGВосстановлено в 0,1% BSA в
PBS Раствор параформальдегида 4% в PBSChemCruzsc-281692
Пенициллин-стрептомицин (10 000 ЕД/мл)ThermoFisher15140122
Портативный вакуумный аспиратор
Rabbit Anti-FOXA2Клеточная сигнальная технология3143Разбавлен до 1:100 для проточной цитометрии и 1:500 для иммуноокрашивающая
Ретиноевая кислотаSigma AldrichR2625Восстановлена в
ингибиторе породы ДМСО (Y-27632)ReproCell04-0012-02Восстановлена в ДМСО
Круглое дно Полистирольные трубки FACS с крышками, СТЕРИЛЬНЫЕStellar ScientificFSC-9010
SANT-1Sigma AldrichS4572Восстановлены в ДМСО
Натрий бикарбонатSigmaS5761-500G
StemFlexThermoFisherA3349401Смешайте базальную среду с добавкой. Аликвоту и хранить при -20°С; С на более длительное время или при 4°С; C для мгновенного использования
TALI Cellular Analysis SlideInvitrogenT10794
Tali на основе изображения цитометр автоматизированный счетчик клетокInvitrogenT10796
Triton X-100Sigma9002-93-1
TrypLE 100 млThermoFisher12563011
Tween 20SigmaP2287
UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0Invitrogen15575-038
140685 антитело морской свинки

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rickels, M. R., Robertson, R. P. Pancreatic islet transplantation in humans: Recent progress and future directions. Endocrine Reviews. 40 (2), 631-668 (2019).
  2. Latres, E., Finan, D. A., Greenstein, J. L., Kowalski, A., Kieffer, T. J. Navigating two roads to glucose normalization in diabetes: Automated insulin delivery devices and cell therapy. Cell Metabolism. 29 (3), 545-563 (2019).
  3. Vaithilingam, V., Tuch, B. E. Islet transplantation and encapsulation: An update on recent developments. Review of Diabetic Studies. 8 (1), 51-67 (2011).
  4. Abdelalim, E. M. Modeling different types of diabetes using human pluripotent stem cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (6), 2459-2483 (2021).
  5. Memon, B., Abdelalim, E. M. Stem cell therapy for diabetes: Beta cells versus pancreatic progenitors. Cells. 9 (2), 283(2020).
  6. Balboa, D., Iworima, D. G., Kieffer, T. J. Human pluripotent stem cells to model islet defects in diabetes. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 12, 642152(2021).
  7. Gaertner, B., Carrano, A. C., Sander, M. Human stem cell models: Lessons for pancreatic development and disease. Genes & Development. 33 (21-22), 1475-1490 (2019).
  8. Abdelalim, E. M., Bonnefond, A., Bennaceur-Griscelli, A., Froguel, P. Pluripotent stem cells as a potential tool for disease modelling and cell therapy in diabetes. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (3), 327-337 (2014).
  9. Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
  10. Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
  11. Nair, G. G., et al. Recapitulating endocrine cell clustering in culture promotes maturation of human stem-cell-derived β cells. Nature Cell Biology. 21 (2), 263-274 (2019).
  12. Russ, H. A., et al. Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro. EMBO Journal. 34 (13), 1759-1772 (2015).
  13. Veres, A., et al. Charting cellular identity during human in vitro β-cell differentiation. Nature. 569 (7756), 368-373 (2019).
  14. Hrvatin, S., et al. Differentiated human stem cells resemble fetal, not adult, β cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (8), 3038-3043 (2014).
  15. Rezania, A., et al. Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice. Diabetes. 61 (8), 2016-2029 (2012).
  16. Rezania, A., et al. Enrichment of human embryonic stem cell-derived NKX6.1-expressing pancreatic progenitor cells accelerates the maturation of insulin-secreting cells in vivo. Stem Cells Journal. 31 (11), 2432-2442 (2013).
  17. Rezania, A., et al. Enrichment of human embryonic stem cell-derived NKX6.1-expressing pancreatic progenitor cells accelerates the maturation of insulin-secreting cells in vivo. Stem Cells Journal. 31 (11), 2432-2442 (2013).
  18. Bruin, J. E., et al. Characterization of polyhormonal insulin-producing cells derived in vitro from human embryonic stem cells. Stem Cell Research. 12 (1), 194-208 (2014).
  19. Toyoda, T., et al. Cell aggregation optimizes the differentiation of human ESCs and iPSCs into pancreatic bud-like progenitor cells. Stem Cell Research. 14 (2), 185-197 (2015).
  20. Memon, B., Abdelalim, E. M. Highly efficient differentiation of human pluripotent stem cells into pancreatic progenitors co-expressing PDX1 and NKX6.1. Methods in Molecular Biology. , (2020).
  21. Memon, B., Karam, M., Al-Khawaga, S., Abdelalim, E. M. Enhanced differentiation of human pluripotent stem cells into pancreatic progenitors co-expressing PDX1 and NKX6.1. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 15(2018).
  22. Aigha, I. I., Memon, B., Elsayed, A. K., Abdelalim, E. M. Differentiation of human pluripotent stem cells into two distinct NKX6.1 populations of pancreatic progenitors. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 83(2018).
  23. Ali, G., et al. Keratinocytes derived from patient-specific induced pluripotent stem cells recapitulate the genetic signature of psoriasis disease. Stem Cells and Development. 29 (7), 383-400 (2020).
  24. Elsayed, A. K., et al. Generation of a human induced pluripotent stem cell line (QBRIi009-A) from a patient with a heterozygous deletion of FOXA2. Stem Cell Research. 42, 101705(2020).
  25. Davenport, C., Diekmann, U., Budde, I., Detering, N., Naujok, O. Anterior-posterior patterning of definitive endoderm generated from human embryonic stem cells depends on the differential signaling of retinoic acid, Wnt-, and BMP-signaling. Stem Cells. 34 (11), 2635-2647 (2016).
  26. Schroeder, I. S., et al. Induction and selection of Sox17-expressing endoderm cells generated from murine embryonic stem cells. Cells Tissues Organs. 195 (6), 507-523 (2012).
  27. Nostro, M. C., et al. Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines. Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).
  28. Elsayed, A. K., Younis, I., Ali, G., Hussain, K., Abdelalim, E. M. Aberrant development of pancreatic beta cells derived from human iPSCs with FOXA2 deficiency. Cell Death & Disease. 12 (1), 103(2021).
  29. Mfopou, J. K., Chen, B., Mateizel, I., Sermon, K., Bouwens, L. Noggin, retinoids, and fibroblast growth factor regulate hepatic or pancreatic fate of human embryonic stem cells. Gastroenterology. 138 (7), 1-14 (2010).
  30. Mfopou, J. K., De Groote, V., Xu, X., Heimberg, H., Bouwens, L. Sonic hedgehog and other soluble factors from differentiating embryoid bodies inhibit pancreas development. Stem Cells. 25 (5), 1156-1165 (2007).
  31. Gattazzo, F., Urciuolo, A., Bonaldo, P. Extracellular matrix: A dynamic microenvironment for stem cell niche. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (8), 2506-2519 (2014).
  32. Watt, F. M., Huck, W. T. Role of the extracellular matrix in regulating stem cell fate. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (8), 467-473 (2013).
  33. Shih, H. P., Panlasigui, D., Cirulli, V., Sander, M. ECM signaling regulates collective cellular dynamics to control pancreas branching morphogenesis. Cell Reports. 14 (2), 169-179 (2016).
  34. Raza, A., Ki, C. S., Lin, C. C. The influence of matrix properties on growth and morphogenesis of human pancreatic ductal epithelial cells in 3D. Biomaterials. 34 (21), 5117-5127 (2013).
  35. Lin, H. Y., et al. Fibronectin and laminin promote differentiation of human mesenchymal stem cells into insulin producing cells through activating Akt and ERK. Journal of Biomedical Science. 17, 56(2010).
  36. Boretti, M. I., Gooch, K. J. Effect of extracellular matrix and 3D morphogenesis on islet hormone gene expression by Ngn3-infected mouse pancreatic ductal epithelial cells. Tissue Engineering Part A. 14 (12), 1927-1937 (2008).
  37. Boretti, M. I., Gooch, K. J. Induced cell clustering enhances islet beta cell formation from human cultures enriched for pancreatic ductal epithelial cells. Tissue Engineering. 12 (4), 939-948 (2006).
  38. Beattie, G. M., Rubin, J. S., Mally, M. I., Otonkoski, T., Hayek, A. Regulation of proliferation and differentiation of human fetal pancreatic islet cells by extracellular matrix, hepatocyte growth factor, and cell-cell contact. Diabetes. 45 (9), 1223-1228 (1996).
  39. Gage, B. K., Webber, T. D., Kieffer, T. J. Initial cell seeding density influences pancreatic endocrine development during in vitro differentiation of human embryonic stem cells. PLoS One. 8 (12), 82076(2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Human Pluripotent Stem CellsPancreatic Beta cell Precursors2D Culture SystemCell TherapyDiabetes BiogenesisInsulin Secreting Beta CellsHyperglycemia ReversalDifferentiation ProtocolCHIR 99021Tissue CultureDefinitive Endoderm CellsParaformaldehyde FixationPrimary AntibodiesSecondary Antibodies