Method Article

Выделение и профилирование первичных брыжеечных артериальных эндотелиальных клеток человека на уровне транскриптома

DOI:

10.3791/63307

⸱

March 14th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Diabetes Complications and Metabolism, City of Hope, 2Department of Bioengineering, University of California San Diego, 3Irell and Manella Graduate School of Biological Sciences, City of Hope

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол описывает выделение, культивирование и профилирование эндотелиальных клеток из брыжеечной артерии человека. Дополнительно предусмотрен метод подготовки артерии человека к пространственной транскриптомике. Протеомика, транскриптомика и функциональные анализы могут быть выполнены на изолированных клетках. Этот протокол может быть перепрофилирован для любой артерии среднего или крупного размера.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эндотелиальные клетки (ЭК) имеют решающее значение для сосудистой функции и функции всего организма благодаря их динамической реакции на сигналы окружающей среды. Выяснение транскриптома и эпигенома ЭК имеет первостепенное значение для понимания их роли в развитии, здоровье и болезни, но ограничено в доступности изолированных первичных клеток. Новейшие технологии позволили профилировать транскриптом и эпигеном EC с высокой пропускной способностью, что привело к идентификации ранее неизвестных субпопуляций клеток EC и траекторий развития. В то время как культуры ЕС являются полезным инструментом в исследовании функции и дисфункции ЕС, условия культуры и множественные проходы могут вводить внешние переменные, которые изменяют свойства нативного ЕС, включая морфологию, эпигенетическое состояние и программу экспрессии генов. Чтобы преодолеть это ограничение, в настоящей статье демонстрируется метод изоляции первичных ЭК человека от донорских брыжеечных артерий с целью захвата их родного состояния. ЭК в интимальном слое диссоциируют механически и биохимически с использованием определенных ферментов. Полученные клетки могут быть непосредственно использованы для объемного РНК или одноклеточного секвенирования РНК или покрыты для культивирования. Кроме того, описан рабочий процесс подготовки артериальной ткани человека к пространственной транскриптомике, в частности, для коммерчески доступной платформы, хотя этот метод также подходит для других методов пространственного профилирования транскриптома. Эта методология может быть применена к различным сосудам, собранным у различных доноров в состоянии здоровья или болезненных состояниях, чтобы получить представление о транскрипционной и эпигенетической регуляции EC, ключевом аспекте биологии эндотелиальных клеток.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Выстилая просвет кровеносных сосудов, эндотелиальные клетки (ЭК) являются важнейшими регуляторами сосудистого тонуса и перфузии тканей. ЭК замечательны своей способностью реагировать на внеклеточную среду и приспосабливаться к изменениям динамики и состава кровотока. Эти динамические реакции опосредованы через сеть внутриклеточных сигнальных событий, включая транскрипционные и посттранскрипционные модуляции с пространственно-временным разрешением. Нарушение регуляции этих реакций связано со многими патологиями, включая, но не ограничиваясь сердечно-сосудистыми заболеваниями, диабетом и раком 1,2.

Большая часть исследований использует клеточные линии или животные модели для опроса транскриптома EC. Первый является полезным инструментом, учитывая относительную простоту использования и недороговизну. Тем не менее, последовательное культивирование может вводить фенотипические изменения в EC, такие как фибробластные особенности и отсутствие поляризации, отключая их от состояния in vivo 3. Первичные клетки, например, EC пуповинной вены человека (HUVEC), были популярным выбором с 1980-х годов, но получены из сосудистого русла развития, которое не существует у взрослых, поэтому вряд ли будет полностью представлять зрелые EC. Животные, особенно мышиные модели, лучше представляют физиологическую или патофизиологическую среду ЭК и позволяют опрашивать транскриптомы в результате генетического возмущения. Мышиные ЭК могут быть выделены из различных тканей, включая аорту, легкие и жировую ткань, с помощью ферментных процедур 4,5,6,7. Тем не менее, изолированные клетки не могут быть использованы для нескольких проходов, если они не преобразованы6 и часто ограничены в количестве, что требует объединения из нескольких животных 5,8,9.

Появление новых технологий, исследующих архитектуру сосудов на транскриптомном уровне, особенно с одноклеточным разрешением, позволило открыть новую эру эндотелиальной биологии, выявив новые функции и свойства EC 5,10,11,12,13,14. Богатый ресурс, созданный исследователями Tabula Muris, собрал одноклеточные транскриптомные профили из 100 000 клеток, включая ЭК в 20 различных мышиных органах15, которые выявили как общие гены маркеров EC, так и уникальные транскриптомные сигнатуры с меж- и внутритканевыми различиями 5,13. Тем не менее, существуют четкие различия между мышью и человеком в геноме, эпигеноме и транскриптоме, особенно в некодирующих областях 16,17,18. Эти вышеупомянутые недостатки подчеркивают важность анализа ЭК с использованием человеческих образцов для получения достоверного профиля ЭК в их родном состоянии в области здоровья и болезней.

Большинство методов изоляции ЕС основаны на физической диссоциации путем гомогенизации, мелкого разрезания и измельчения ткани перед инкубацией с протеолитическими ферментами в разное время. Ферменты и условия также значительно различаются между типами тканей, от трипсина до коллагеназы, используемой отдельно или в комбинации 19,20,21. Дальнейшее обогащение или очистка на основе антител часто включаются для повышения чистоты ЭК. Как правило, антитела против мембранных маркеров ЕС, например, CD144 и CD31, конъюгируют с магнитными шариками и добавляют в клеточную суспензию22,23. Такая стратегия может быть в целом адаптирована для изоляции ЕС из нескольких тканей человека и мыши, включая методы, введенные в этом протоколе.

В своем родном состоянии ЭК взаимодействуют с несколькими типами клеток и могут существовать в сосудистых нишах, где близость клеток имеет решающее значение для функции. В то время как исследования одноклеточного и одноядерного секвенирования РНК (scRNA и snRNA-seq) имели первостепенное значение для недавних прорывов в описании гетерогенности EC, процесс диссоциации нарушает тканевой контекст и контакт между клетками, которые также важны для понимания биологии EC. Разработанное в 2012 году и названное методом года в 2020 году24, пространственное профилирование транскриптома использовалось для профилирования глобальной экспрессии генов при сохранении пространственных особенностей в различных тканях, включая мозг25, опухоль26 и жировуюткань 27. Технологии могут быть нацелены с использованием специализированных зондов, специфичных для конкретных последовательностей РНК, прикрепленных к аффинным реагентам или флуоресцентным меткам, таким образом, обнаруживая выбранные гены с субклеточным разрешением 28,29,30,31. Они также могут быть нецелевыми 32,33, обычно используя пространственно штрих-кодированные олигонуклеотиды для захвата РНК, которые вместе преобразуются в кДНК для последующей подготовки библиотеки seq и, следовательно, имеют преимущество в выведении экспрессии генов всей ткани непредвзятым образом. Однако пространственное разрешение в настоящее время не достигается на одном клеточном уровне с помощью коммерчески доступных технологий. Это может быть преодолено в некоторой степени с помощью интеграции данных с данными scRNA-seq, что в конечном итоге позволяет отображать одноклеточный транскриптом в сложном тканевом контексте, сохраняя при этом его исходную пространственную информацию34.

Здесь описан рабочий процесс для профилирования транскриптома EC с использованием верхней брыжеечной артерии человека, периферической артерии, которая использовалась для изучения вазодилатации, ремоделирования сосудов, окислительного стресса и воспаления 35,36,37. Описаны два метода: 1) выделение и обогащение ЭК из интимы кровеносных сосудов, сочетающих механическую диссоциацию и ферментативное переваривание, пригодные для секвенирования одноклеточного транскриптома или последующей культивирования in vitro; 2) подготовить артериальные срезы для пространственного профилирования транскриптома (рисунок 1). Эти два метода могут быть выполнены независимо или дополнительно для профилирования EC и окружающих их клеток. Кроме того, этот рабочий процесс может быть адаптирован для использования на любой средней или большой артерии.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Исследования тканей человека были проведены на деидентифицированных образцах, полученных из Ресурсного центра островковых клеток Южной Калифорнии в городе Хоуп. Согласие на исследование на использование посмертных тканей человека было получено от ближайших родственников доноров, а этическое одобрение для этого исследования было предоставлено Институциональным наблюдательным советом города Надежды (IRB No 01046).

1. Физическая диссоциация (расчетное время: 1-2 ч)

  1. Поместите свежую артерию на 10-сантиметровую посуду и вымойте стерильным фосфатно-буферным физиологическим раствором Dulbecco (D-PBS).
  2. Стерильными щипцами и рассеченными ножницами удалите жир и наружные соединительные ткани до тех пор, пока сосуд не очистится. Измерьте длину сосуда с помощью линейки, размещенной вне тарелки, и сделайте снимки для записей (рисунок 1А).
  3. Предварительно нагреть соответствующий буфер пищеварения до 37 °C: для scRNA-seq используют фермент клеточной диссоциации; для анализа клеточных культур используют 1-6 мг/мл коллагеназы D, 3 мг/мл протеазы бактериального происхождения, 100 мМ HEPES, 120 мМ NaCl, 50 мМ KCl, 5 мМ глюкозы, с 1 мМ CaCl2 6,38 (рН 7,0, не требует корректировки), добавленной за 5 мин до применения.
  4. Возьмите брыжеечную артерию (обычно диаметром 6-8 мм) и разрежьте ножницами вдоль, чтобы открыть просвет сосуда вертикально.
  5. С помощью игл прикрепите сосуд к черному воску на всех четырех углах, оставив интиму открытой (рисунок 1B).
  6. Добавьте в интиму 1 мл предварительно подогретого буфера пищеварения. Возьмите стерильный скальпель и дважды аккуратно соскоблите просвет сосуда.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Целью этой процедуры является диссоциация интимного слоя, что может потребовать практики. Необходимо приложить достаточно силы, чтобы удалить эндотелий, но не настолько, чтобы были удалены и более глубокие слои ткани, что уменьшит представление ЭК.
  7. Переложите буфер пищеварения в пробирку объемом 5 мл. Добавьте 1 мл буфера пищеварения в интиму и пипетку вверх и вниз осторожно, чтобы собрать оставшиеся клетки и добавить в трубку 5 мл. Инкубировать ячейки при 37 °C, вращаясь со скоростью 150 об/мин в течение 5 мин.
  8. Добавьте 2 мл среды M199 (или D-PBS, если речь идет о scRNA-seq) к клеточной суспензии, чтобы погасить ферментативную реакцию. Аккуратно перемешать и центрифугировать при 4 °C, 600 х г в течение 5 мин.
  9. Удалите супернатант и сохраните супернатант отдельно в культуре в качестве контроля, чтобы наблюдать, все ли клетки захвачены в грануле на этапе 1.8. Повторное суспендирование клеточной гранулы в 1 мл среды M199 (или D-PBS, если речь идет о scRNA-seq).
  10. Оцените жизнеспособность клеток, смешивая 10 мкл трипан-синего с 10 мкл клеточного запаса. Наблюдайте за морфологией клеток и подсчитывайте клетки с помощью гемоцитометра.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе клетки могут быть использованы для количественной оценки белка или РНК или культивированы in vitro с использованием питательных сред EC в соответствии со стандартными протоколами39. В качестве альтернативы они могут быть подготовлены к секвенированию, как описано в следующем разделе.
  11. Для культуры покрывают две скважины 6-луночной пластины путем пипетки 500 мкл реагента для присоединения в скважины в течение 30 мин при комнатной температуре. После снятия реагента крепления и промывки стерильным D-PBS дозируют полный клеточный запас в одну лунку, а супернатант держат в качестве контроля во второй лунке.

2. Подготовка к исследованиям scRNA-seq (расчетное время: 3-4 ч)

  1. Центрифугировать ячейку со стадии 1.11 при 4 °C, 600 x g в течение 5 мин. Удалите супернатант и осторожно повторно суспендируйте гранулу пипеткой P1000 и широкоствольным наконечником в 1 мл 0,04% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в D-PBS. Хорошо перемешайте, чтобы получить одноклеточную суспензию.
  2. Пропустите раствор через ситечко 40 мкм, чтобы удалить клеточный мусор. Если мусор остается, пройдите через второй сетчатый фильтр в 4 мл 0,04% BSA в D-PBS.
  3. Центрифуга при 4 °C, 600 х г в течение 5 мин. Удалите супернатант и повторно суспендируйте гранулу в 500 мкл 0,04% BSA в D-PBS с помощью пипетки P1000 с широким наконечником пипетки. Хорошо перемешайте, чтобы получить одноклеточную суспензию.
  4. Оцените жизнеспособность клеток, смешивая 10 мкл клеточного запаса с 10 мкл трипан-синего. С помощью гемоцитометра понаблюдайте за морфологией, определите, есть ли одноклеточная суспензия без кластеров, проверьте наличие тканевого мусора и рассчитайте количество живых и мертвых клеток.
  5. Если клетки сгруппированы или остается мусор, повторите промывку с 0,04% BSA в D-PBS или снова пройдите через ситечко 40 мкм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя это уменьшит выход, важно, чтобы ячейки существовали в чистой одноэлементной суспензии для оптимального секвенирования.
  6. Одноклеточная суспензия может быть использована для scRNA-seq.

3. Пространственное профилирование транскриптома (расчетное время: 3-4 ч)

  1. Добавьте изопентан (2-метилбутан) в металлический канистру и охладите жидким азотом (LN2) или сухим льдом (LN2 предпочтительнее, так как это приведет к температуре ниже, чем сухой лед). Налейте оптимальный температурный компаунд резки (OCT) в колодцы из меченых пластиковых криомольдов, следя за тем, чтобы не создавать пузырьков и удалять те, которые появляются. Оставьте криомольд на сухом льду, чтобы остыть.
  2. Вырежьте не менее двух корональных сечений, 1 см в длину сосуда. Используя длинные (12") щипцы, погрузите ткань в изопентан до замораживания. Быстро погружайте ткань в ОКТ в ориентации с просветом, видимым в центре. Позаботьтесь об удалении любых пузырьков, особенно тех, которые находятся рядом с тканью.
  3. Используя длинные (12") щипцы, возьмите криомольды и подержите их в металлической канистре. В то время как основание плесени должно быть в жидкости, оно не должно быть слишком глубоким, чтобы позволить изопентану проходить по ткани. Наблюдайте за замерзанием, ОКТ постепенно станет белым снаружи через 1-2 мин.
  4. Храните эти участки в герметичном контейнере при -80 °C в течение 6 месяцев.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда держите образцы на сухом льду и не допускайте более одного цикла замораживания-оттаивания. Эта ткань может быть использована для гистологического анализа, флуоресцентной гибридизации РНК/ДНК in situ (FISH) или пространственной транскриптомики, которая будет описана сейчас.
  5. Установите температуру криостата до -20 °C для камеры и -10 °C для головки образца. Уравновешивайте секции сосудов, ножи, щетки и слайды OCT до -20 °C в криостате в течение примерно 30 минут. Во время уравновешивания очистите машину и все оборудование, которое может касаться секций, включая лезвие, 70% этанолом с последующим раствором для обеззараживания РНКазы.
  6. Прикрепите образец, дозируя небольшое количество ОКТ на круговой блок криостата и помещая образец сверху, прежде чем он замерзнет. Поместите блок в центр головки образца и прикрутите блок на место, используя высокую черную ручку слева. Отрежьте все лишние ОКТ, окружающие сосуд.
  7. Установив толщину резки до 10 мкм на криостате, вырежьте примерно 60 секций и поместите их в предварительно охлажденную трубку объемом 1,5 мл. Эти участки будут использоваться для оценки качества РНК. После удаления из криостата немедленно добавляют 1 мл реагента экстракции РНК и вихря до полного растворения срезов.
  8. Добавьте 200 мкл хлороформа и перемешайте до тех пор, пока раствор не станет похожим на клубничный молочный коктейль. Центрифуга при 11 200 х г в течение 10 мин при 4 °C.
  9. Соберите водную фазу (прозрачная фаза поверх белого и розового слоев) и добавьте в нее 500 мкл изопропанола. Перемешайте, перевернув трубки более 10 раз, и поместите при -80 °C в течение не менее 20 мин.
  10. Центрифуга при 11 200 х г в течение 10 мин при 4 °C. Растворите очищенную гранулу РНК в 5 мкл рваазной воды. Изучите номер целостности РНК (RIN).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы с RIN ≥ 7 являются предпочтительными, но RIN ≥ 6 является приемлемым. Количество участков ткани и объем раствора для растворения РНК могут потребовать оптимизации в зависимости от системы, используемой для обеспечения того, чтобы конечная концентрация РНК находилась в пределах диапазона функций RIN, чтобы обеспечить точную оценку RIN.
  11. Потренируйтесь правильно вырезать и размещать секции в фидуциальных рамках с помощью простых стеклянных слайдов, прежде чем переходить к коммерчески доступной оптимизации тканей или слайдам экспрессии генов. Это может быть достигнуто путем рисования квадратов размером 6,5 мм х 6,5 мм на обычном стеклянном слайде, охлаждения до -20 °C в криостате и размещения секций в этой области захвата.
  12. Вырежьте 10-мкм секции с противокатаной пластиной на месте, переверните и аккуратно сплющивайте, осторожно коснувшись секции через окружающий OCT.
  13. Используя криостатные щетки без РНКазы, поместите участок ткани в квадрат, используя только окружающий OCT. Немедленно поместите один палец (в перчатках) на заднюю сторону области захвата, чтобы расплавить участок до слайда.
  14. После того, как секция прилипнет, поместите слайд на криобар, чтобы секция замерзла. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы избежать складчатости тканей и ткани, покрывающей разграниченные края фидуциального каркаса. При необходимости разрежьте ткань на половинки или четверти вдоль просвета с помощью лезвия, чтобы убедиться, что секция сосуда помещается в раму размером 6,5 мм х 6,5 мм.
  15. Вырежьте 10 мкм участков ткани в соответствии с 3.12-3.14 на слайдах оптимизации ткани или экспрессии генов. Перенесите слайд в скользящую почтовую машину, размещенную на сухом льду. Храните слайды при -80 °C в течение 4 недель, прежде чем приступить к опубликованным пространственным протоколам33,34.

4. Анализ данных секвенирования (расчетное время: до 1 недели в зависимости от знакомства с программным обеспечением)

ПРИМЕЧАНИЕ: Только для пространственного транскриптомного анализа перейдите к шагу 4.8. Данные scRNA-seq обрабатываются с использованием стандартизированного конвейера, выровненного с эталонным транскриптомом hg38 человека. Пакет R Seurat (v3.2.2) используется для анализа данных scRNA-seq в соответствии с опубликованными рекомендациями40.

  1. Фильтр с использованием хорошо зарекомендовавших себя показателей контроля качества: редкие клетки с очень большим количеством генов (потенциально мультиплеты) и клетки с высоким процентом митохондрий (низкокачественные или умирающие клетки часто присутствуют митохондриальное загрязнение) удаляются.
  2. Нормализуйте данные с помощью "sctransform", метода улучшения интеграции образцов по сравнению с нормализацией журналов. Эти нормализованные данные используются для уменьшения размерности и кластеризации, в то время как логарифмические нормализованные уровни экспрессии используются для анализа на основе уровней экспрессии генов, таких как классификация типа клеток41.
  3. Выберите маркерные гены для каждого типа клеток, например, молекулу адгезии эндотелиальных клеток тромбоцитов-1 (PECAM1) и фактор фон Виллебранда (VWF) для ECs, люмикан (LUM) и проколлаген C-эндопептидазы Enhancer (PCOLCE) для фибробластов, ген транслокации B-клеток 1 (BTG1) и CD52 для макрофагов, C1QA и C1QB для моноцитов и тяжелую цепь миозина 11 (MYH11) и трансгелин (TAGLN) для гладкомышечных клеток сосудов36.
  4. Вычислите средний уровень экспрессии в отдельных ячейках между каждой парой маркеров, чтобы иметь один маркер со средним уровнем экспрессии, связанным с каждой ячейкой типа42.
  5. Примените модель смеси Гаусса (GMM) с двумя компонентами к данным экспрессии каждого маркера в отдельных клетках, чтобы разделить ячейки на два набора, а именно, высоко экспрессируя маркер и низко экспрессируя маркер. Таким образом, для каждого маркера каждая отдельная ячейка назначается одному из двух компонентов42.
  6. Используйте статистическое обогащение для набора маркерных генов, точный тест Фишера, чтобы назначить тип клеток каждому кластеру. Таким образом, для каждого кластера получается набор p-значений, каждое из которых соответствует типу ячеек. Этому кластеру назначается тип ячейки с наименьшим p-значением.
  7. Обрабатывайте пространственные транскриптомные данные с помощью конвейеров Space Ranger, что приводит к пространственному дебаркодированию и генерации показателей контроля качества (QC), включая общее согласованное считывание с человеческим транскриптомом hg38, медианное число уникальных молекулярных идентификаторов (UMI) или генов напятно 35.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пакет R Seurat (v3.2.2) используется для анализа данных, обрабатываемых Space Ranger, в соответствии с опубликованными руководящими принципами40.
  8. Нормализуйте данные с помощью «sctransform», метода, который, как доказано, улучшает последующий анализ по сравнению с логарифмической нормализацией, учитывая гетерогенность ткани и очень высокую дисперсию в подсчетах по пятнам.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Анализ ЭК из брыжеечной артерии с использованием комбинации механической и ферментативной диссоциации или криоконсервации для использования в различных последующих анализах показан здесь (рисунок 1). ЭК могут быть профилированы в брыжеечных артериях с использованием следующих этапов: А) механическая диссоциация от интимы в сочетании с перевариванием коллагеназы к клеткам культивирования; Б) генерация одноклеточной суспензии для scRNA-seq; или В) поперечные сечения артерии могут быть встроены...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Представленный рабочий процесс детализирует набор методов для профилирования EC из одного куска человеческой артерии с одноклеточным и пространственным разрешением. В протоколе есть несколько критических шагов и ограничивающих факторов. Одним из ключей к профилированию транскриптома является свежесть ткани и целостность РНК. Важно как можно больше поддерживать ткани на льду перед обработкой, чтобы свести к минимуму деградацию РНК. Как правило, посмертные ткани обрабатываются между 8-14 ч после смерти. Тем не менее, реком...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S.Z. является основателем и членом совета директоров Genemo, Inc.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантами NIH R01HL108735, R01HL145170, R01HL106089 (к Z.B.C.); DP1DK126138 и DP1HD087990 (к S.Z.); грант Фонда Эллы Фицджеральд и проект семьи Ванек (Z.B.C.); и грант на создание семенной сети Атласа клеток человека (для Z.B.C. и S.Z.). Исследования, о которых сообщается в этой публикации, включали работу, выполненную в Интегративном геномическом ядре в Городе Надежды, поддерживаемом Национальным институтом рака Национальных институтов здравоохранения под номером P30CA033572. Авторы хотели бы поблагодарить доктора Исмаила Аль-Абдуллу и доктора Мейригенга Ци из команды по трансплантации островков в Городе Надежды за изоляцию тканей человека, доктора Дунцяна Юаня из Города Надежды за его помощь в анализе scRNA-seq и доктора Марка Халушки из Отделения сердечно-сосудистой патологии Медицинской школы Университета Джона Хопкинса за его бесценную информацию о сосудистой гистологии.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,5 мл микроцентрифужная пробиркаСША Scientific1615-5500
10 см чашкаGenesee Scientific25-202
23G иглыBD305145
2-метилбутаномThermo FisherAC327270010
40 &; m ситечкоFisher14100150
4200 TapeStation SystemAgilent TechnologiesG2991BA
5 мл пробиркаThermo Fisher14282300
6-луночная пластинаGreiner Bio-One07-000-208
Фактор присоединенияCell Applications123-500Присоединение реагента в протоколе
Черный воскЛюбой коммерческий черный воск может быть использован
бычий сывороточный альбумин, обработанный термошокомFisherBP1600-100
CaCl2FisherBP510
CentrifugeEppendorf
ChloroformFisherC607
Collagenase DRoche11088866001
CryostatLeica
Cryostat щетки
D-глюкозаFisherD16-1
ДиметилсульфоксидFisherMT25950CQC
Dispase IIRoche4942078001Протеаза бактериального происхождения в протоколе
Одноразовые безопасные скальпелиMyco Instrumentation6008TR-10
D-PBSThermo Fisher14080055
этанолFisherBP2818-4
Фетальная бычья сывороткаFisher10437028
ГемоцитометрFisher267110
HEPESSigma AldrichH3375-100g
Высокочувствительный буфер для образцов D1000Agilent Technologies5067-5603
Высокочувствительная экранная лента D1000Agilent Technologies5067-5584
ИнкубаторKept at 37 ° C 5% CO2
IsopropanolFisherBP26324
KClFisherP217-3
Среда жидкого азота
199Sigma AldrichM2520-10X
Металлический канистра
Микроскоп LeicaДля оценки морфологии клеток
Микрососудистая эндотелиальная культуральная средаПрименение в клетках111-500
NaClFisherS271-1
Нью-Брансуик Innova 44/44R Орбитальный шейкерEppendorf
Оптимальная температура резки КомпаундFisher4585
Пластиковые криоформыFisher22363553
РНК-лентаAgilent Technologies5067-5576
РНК-скрининг Лента для образцадля образцов Agilent Technologies5067-5577
РНКаза ZAPThermo FisherAM9780
РНКаза без РНКазы вода2) в наборе
Стерильные 12" длинные щипцыF.S.T91100-16
Стерильные тонкие щипцыF.S.T11050-10
Стерильные тонкие ножницыF.S.T14061-11
Superfrost PLUS Gold SlidesFisher1518848
реактив ТРИзолFisher15596018
Trypan BlueCorningMT25900CI
TrypLE Express Enzyme (1X) феноловый красныйThermo Fisher12605010фермент клеточной диссоциации в протокол
Visium Accessory Kit10X GenomicsPN-1000215
Visium Gateway Package, 2rxns10X GenomicsPN-1000316
Visium Spatial Gene Expression Slide & Набор реактивов, 4 rxns10X GenomicsPN-1000184
буфера (

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thorin, E., Shreeve, S. M. Heterogeneity of vascular endothelial cells in normal and disease states. Pharmacology & Therapeutics. 78 (3), 155-166 (1998).
  2. Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction: testing and clinical relevance. Circulation. 115 (10), 1285-1295 (2007).
  3. Hillen, H. F., Melotte, V., van Beijnum, J. R., Griffioen, A. W. Endothelial cell biology. Angiogenesis Assays: A Critical Appraisal of Current Techniques. , John Wiley & Sons. Chichester, West Sussex, UK. 1-38 (2007).
  4. Nam, D., et al. Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 297 (4), 1535-1543 (2009).
  5. Kalucka, J., et al. Single-cell transcriptome atlas of murine endothelial cells. Cell. 180 (4), 764-779 (2020).
  6. Tang, X., et al. Suppression of endothelial AGO1 promotes adipose tissue browning and improves metabolic dysfunction. Circulation. 142 (4), 365-379 (2020).
  7. Ni, C. W., Kumar, S., Ankeny, C. J., Jo, H. Development of immortalized mouse aortic endothelial cell lines. Vascular Cell. 6 (1), 7(2014).
  8. Kalluri, A. S., et al. Single-cell analysis of the normal mouse aorta reveals functionally distinct endothelial cell populations. Circulation. 140 (2), 147-163 (2019).
  9. Wirka, R. C., et al. Atheroprotective roles of smooth muscle cell phenotypic modulation and the TCF21 disease gene as revealed by single-cell analysis. Nature Medicine. 25, 1280-1289 (2019).
  10. Widyantoro, B., et al. Endothelial cell-derived endothelin-1 promotes cardiac fibrosis in diabetic hearts through stimulation of endothelial-to-mesenchymal transition. Circulation. 121 (22), 2407-2418 (2010).
  11. Zeisberg, E. M., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition contributes to cardiac fibrosis. Nature Medicine. 13 (8), 952-961 (2007).
  12. Stuart, T., Satija, R. Integrative single-cell analysis. Nature Reviews Genetics. 20, 257-272 (2019).
  13. Paik, D. T., et al. Single-cell RNA sequencing unveils unique transcriptomic signatures of organ-specific endothelial cells. Circulation. 142 (19), 1848-1862 (2020).
  14. Palikuqi, B., et al. Adaptable haemodynamic endothelial cells for organogenesis and tumorigenesis. Nature. 585 (7825), 426-432 (2020).
  15. The Tabula Muris Consortium. et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).
  16. Hezroni, H., et al. Principles of long noncoding RNA evolution derived from direct comparison of transcriptomes in 17 species. Cell Reports. 11 (7), 1110-1122 (2015).
  17. Washietl, S., Kellis, M., Garber, M. Evolutionary dynamics and tissue specificity of human long noncoding RNAs in six mammals. Genome Research. 24 (4), 616-628 (2014).
  18. Chen, J., et al. Evolutionary analysis across mammals reveals distinct classes of long non-coding RNAs. Genome Biology. 17 (19), 19(2016).
  19. Drake, B. L., Loke, Y. W. Isolation of endothelial cells from first trimester decidua using immunomagnetic beads. Human Reproduction. 6, 1156-1159 (1991).
  20. McDouall, R. M., Yacoub, M., Rose, M. L. Isolation, culture and characterization of MHC class II-positive microvascular endothelial cells from the human heart. Microvascular Research. 51, 137-152 (1996).
  21. Sokol, L., et al. Protocols for endothelial cell isolation from mouse tissues: small intestine, colon, heart, and liver. STAR Protocols. 2 (2), 100489(2021).
  22. Springhorn, J. P., Madri, J. A., Squinto, S. P. Human capillary endothelial cells from abdominal wall adipose tissue: isolation using an anti-pecam antibody. In Vitro Cellular Developmental Biology Animal. 31 (6), 473-481 (1995).
  23. Hewett, P. W., Murray, J. C. Immunomagnetic purification of human microvessel endothelial cells using Dynabeads coated with monoclonal antibodies to PECAM-1. European Journal of Cell Biology. 62 (2), 451-454 (1993).
  24. Marx, V. Method of the Year: spatially resolved transcriptomics. Nature Methods. 18 (1), 9-14 (2021).
  25. Maynard, K. R., et al. Transcriptome-scale spatial gene expression in the human dorsolateral prefrontal cortex. Nature Neuroscience. 24 (3), 425-436 (2021).
  26. Ji, A. L., et al. Multimodal analysis of composition and spatial architecture in human squamous cell carcinoma. Cell. 182 (2), 497-514 (2020).
  27. Bäckdahl, J., et al. Spatial mapping reveals human adipocyte subpopulations with distinct sensitivities to insulin. Cell Metabolism. 33 (9), 1869-1882 (2021).
  28. Wang, J., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).
  29. Codeluppi, S., et al. Spatial organization of the somatosensory cortex revealed by osmFISH. Nature Methods. 15, 932-935 (2018).
  30. Eng, C. H. L., et al. Transcriptome-scale super-resolved imaging in tissues by RNA seqFISH. Nature. 568, 235-239 (2019).
  31. Eng, C. H. L., Shah, S., Thomassie, J., Cai, L. Profiling the transcriptome with RNA SPOTs. Nature Methods. 14, 1153-1155 (2017).
  32. Rodriques, S. G., et al. Slide-seq: a scalable technology for measuring genome-wide expression at high spatial resolution. Science. 363 (6434), 1463-1467 (2019).
  33. Ståhl, P. L., et al. Visualization and analysis of gene expression in tissue sections by spatial transcriptomics. Science. 353 (6294), 78-82 (2016).
  34. Rao, A., et al. Exploring tissue architecture using spatial transcriptomics. Nature. 596 (7871), 211-220 (2021).
  35. Sachidanandam, K., et al. Differential effects of diet-induced dyslipidemia and hyperglycemia on mesenteric resistance artery structure and function in type 2 diabetes. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 328 (1), 123-130 (2009).
  36. Calandrelli, R., et al. Stress-induced RNA-chromatin interactions promote endothelial dysfunction. Nature Communications. 11 (1), 5211(2020).
  37. Souza-Smith, F. M., et al. Mesenteric resistance arteries in Type 2 diabetic db/db mice undergo outward remodeling. PLoS One. 6 (8), 23337(2011).
  38. Asterholm, I., et al. Adipocyte inflammation is essential for healthy adipose tissue expansion and remodeling. Cell Metabolism. 20 (1), 103-118 (2014).
  39. Marin, V., et al. Endothelial cell culture: protocol to obtain and cultivate human umbilical endothelial cells. Journal of Immunological Methods. 254 (1-2), 183-190 (2001).
  40. Stuart, T., et al. Comprehensive integration of single-cell data. Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).
  41. Hafemeister, C., Satija, R. Normalization and variance stabilization of single-cell RNA-seq data using regularized negative binomial regression. Genome Biology. 20 (1), 296(2019).
  42. Bonnycastle, L. L., et al. Single-cell transcriptomics from human pancreatic islets: sample preparation matters. Biology Methods Protocols. 5 (1), (2020).
  43. Espitia, O., et al. Implication of molecular vascular smooth muscle cell heterogeneity among arterial beds in arterial calcification. PLoS One. 13 (1), 0191976(2018).
  44. Engelbrecht, E., et al. Sphingosine 1-phosphate-regulated transcriptomes in heterogenous arterial and lymphatic endothelium of the aorta. eLife. 9, 52690(2020).
  45. Hu, H., et al. Single-cell transcriptomic atlas of different human cardiac arteries identifies cell types associated with vascular physiology. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (4), 1408-1427 (2021).
  46. van Beijnum, J., et al. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nature Protocols. 3 (6), 1085-1091 (2008).
  47. Jin, S., et al. Inference and analysis of cell-cell communication using CellChat. Nature Communications. 12 (1), 1088(2021).
  48. Efremova, M., Vento-Tormo, M., Teichmann, S. A., Vento-Tormo, R. CellPhoneDB: inferring cell-cell communication from combined expression of multi-subunit ligand-receptor complexes. Nature Protocols. 15 (4), 1484-1506 (2020).
  49. Hu, Y., Peng, T., Gao, L., Tan, K. CytoTalk: de novo construction of signal transduction networks using single-cell RNA-Seq data. Science Advances. 7 (16), (2020).
  50. Sanchez-Ferras, O., et al. A coordinated progression of progenitor cell states initiates urinary tract development. Nature Communications. 12 (1), 2627(2021).
  51. Mantri, M., et al. Spatiotemporal single-cell RNA sequencing of developing chicken hearts identifies interplay between cellular differentiation and morphogenesis. Nature Communications. 12 (1), 1771(2021).
  52. Merritt, C. R., et al. Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue. Nature Biotechnology. 38 (5), 586-599 (2020).
  53. Moffit, J. R., et al. High-throughput MERFISH. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (39), 11046-11051 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Human Primary Mesenteric Arterial Endothelial CellsTranscriptomeGene ExpressionEndothelial CellsVascular WallCell cell InteractionsDiabetesObesityTissue ContextScraping TechniqueCryostat SectioningDigestion BufferCell SuspensionIncubationM199 MediumCentrifugation