Протокол позволяет генерировать чистую популяцию адипоцитов из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК). Ретиноевая кислота используется для дифференцировки ИПСК в мезенхимальные стволовые клетки (МСК), которые используются для производства адипоцитов. Затем для получения чистых адипоцитов используется подход сортировки, основанный на окрашивании Нила в красный цвет.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Робастная дифференциация ИПСК человека в чистую популяцию адипоцитов для изучения адипоцит-ассоциированных заболеваний
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Последние достижения в технологии индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) позволили генерировать различные типы клеток, включая адипоциты. Однако современные методы дифференцировки имеют низкую эффективность и не дают однородной популяции адипоцитов. Здесь мы обходим эту проблему, используя полностью транс-ретиноевый метод для получения мезенхимальных стволовых клеток (МСК) с высоким выходом. Регулируя пути, регулирующие пролиферацию, выживание и адгезию клеток, наша стратегия дифференцировки позволяет эффективно генерировать эмбриональные тела (БЭ), которые дифференцируются в чистую популяцию мультипотентных МСК. Большое количество МСК, генерируемых этим методом, является идеальным источником для генерации адипоцитов. Однако гетерогенность образца в результате дифференцировки адипоцитов остается проблемой. Поэтому мы использовали метод очистки липидсодержащих зрелых адипоцитов на основе нильского краса с помощью FACS. Эта стратегия сортировки позволила нам установить надежный способ моделирования метаболических нарушений, связанных с адипоцитами, с использованием пула адипоцитов с уменьшенной гетерогенностью образца и улучшенной функциональностью клеток.
Введение
Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) действуют как эффективный транзиторный ресурс для производства клеток мезодермального происхождения, таких как адипоциты, остеоциты и хондроциты, которые в дальнейшем могут быть использованы для моделирования соответствующих генетических нарушений. Однако предыдущие подходы основывались на получении этих МСК из тканей взрослого человека 1, что создавало проблему получения их в больших количествах от доноров и ограничение их функциональной жизнеспособности в неоптимальных условиях культивирования in vitro 1,2. Эти препятствия породили большо....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Исследование было одобрено соответствующим институциональным комитетом по этике исследований и выполнено в соответствии с этическими стандартами, изложенными в Хельсинкской декларации 1964 года и ее более поздних поправках или сопоставимых этических стандартах. Протокол был одобрен Институциональным наблюдательным советом (IRB) HMC (No 16260/16) и QBRI (No 2016-003). Эта работа также оптимизирована для hESCs, таких как H1 и H9. Образцы крови были получены от здоровых людей с полного информированного согласия. ИПСК генерируются из мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) здоровых людей.
1. Культивирование и поддержание ИПСК
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Схема и морфология клеток во время мезенхимальной дифференцировки: Дифференцировка ИПСК в МСК включает в себя различные стадии развития, охватывающие образование БЭ, дифференцировку МСК и экспансию МСК (рис. 1). На этих стадиях развития клетки приобретают различную морфологию из-за различных стимулирующих химических веществ, которым они подвергаются. После начала дифференцировки клетки покрываются суспензией и, как ожидается, будут круглыми, с определенными границами клеток, но при этом буду.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Этот протокол имеет первостепенное значение из-за его способности обеспечивать высокую производительность и эффективность МСК. Это массовое производство МСК стало возможным благодаря переходной инкубации ЭБ, полученных из ИПСК, с 10 мкМ RA14,15. Транзиторная обработка 10 мкМ РА увеличила выход МСК в 11,2-1542 раза в14,15, причем этот протокол применим как к ИПСК, так и к ЧПСК. При такой дозе и продолжител.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.
Благодарности
Эта работа была профинансирована за счет гранта Катарского национального исследовательского фонда (QNRF) (грант No NPRP10-1221-160041). Марьям Агади получила стипендию GSRA от Катарского национального исследовательского фонда (QNRF).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Адипонектин | Abcam | ab22554 | Маркер созревания адипоцитов |
| анти-CD105 | BD Pharmingen | 560839 | маркер дифференцировки МСК |
| анти-CD14 | BD Pharmingen | 561712 | маркер дифференцировки МСК |
| анти-CD19 | BD Pharmingen | 555415 | маркер дифференцировки МСК |
| анти-CD34 | BD Pharmingen | 555824 | Маркер дифференцировки МСК |
| анти-CD44 | abcam | ab93758 | Маркер дифференцировки МСК |
| анти-CD45 | BD Pharmingen | 560975 | маркер дифференцировки МСК |
| анти-CD73 | BD Фарминген | 550256 | маркер дифференцировки МСК |
| анти-CD90 | BD Фарминген | 555596 | маркер дифференцировки МСК |
| bFGF | НИР D | 233-FP | Пищевая добавка для культуральных сред MSC |
| C/EBPA | Abcam | ab40761 | Маркер созревания адипоцитов |
| Dexamethasone | Torics | 1126 | Добавка для дифференцировки адипоцитов |
| FABP4 | Abcam | ab93945 | Маркер созревания адипоцитов |
| Фетальная бычья сыворотка | ThermoFisher | 10082147 | MSC Питательная среда |
| Glutamax | ThermoFisher | 35050-061 | Пищевая добавка для культуральных сред |
| MSC IBMX | Sigma Aldrich | I5879 | Пищевая добавка для дифференцировки адипоцитов |
| Indomethacin | Sigma Aldrich | I7378 | Добавка для дифференцировки адипоцитов |
| Инсулин | Sigma Aldrich | 91077C | Добавка для дифференцировки адипоцитов |
| Knockout DMEM | ThermoFisher | 12660012 | Базальная среда для приготовления матрицы |
| Низкая глюкоза DMEM | ThermoFisher | 11885084 | МСК питательная среда |
| Matrigel | Corning 354230 | Матрица покрытия | |
| MEM-альфа | ThermoFisher | 12561056 | Среда для дифференцировки адипоцитов |
| Nilered | Sigma Aldrich | 19123 | Сортировочный маркер для адипоцитов |
| Пенициллин | ThermoFisher | 15140122 | МСК/Адипоцитарная медиадобавка |
| Фосфатно-солевой буфер | ThermoFisher | 14190144 | промывочный буфер |
| Pierce™ 20X TBS Buffer | Thermo Fisher | 28358 | промывочный буфер |
| PPARG | Клеточная сигнальная технология | 2443 | маркер созревания адипоцитов |
| ReLeSR | Стволовые клетки Технологии | 5872 | Диссоциационный реагент |
| Ретиноевая кислота | Sigma Aldrich | R2625 | MSC Добавка дифференцировочной среды |
| Ингибитор | породы Tocris | 1254/10 | hPSC Питательная среда |
| Розиглатон | Sigma Aldrich | R2408 | Добавка дифференцировочной среды для адипоцитов |
| StemFlex | ThermoFisher | A334901 | hPSC питательная среда |
| Triton | Thermo Fisher | 28314 | Реактив для пермебеализации |
| Трипсин | ThermoFisher | 25200072 | Реактив диссоциации |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P7942 | Буфер для промывки |
Ссылки
- Hass, R., Kasper, C., Bohm, S., Jacobs, R. Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC. Cell Communication and Signaling: CCS. 9, 12(2011).
- Wagner, W., et al.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
