В данной статье описывается новая животная модель, разработанная для изучения анатомии и гистологии роговицы и процессов ее заживления. Эта новая животная модель использует монгольскую песчанку, которая имеет роговицу со многими сходствами с роговицей человека.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Монгольские песчанки как животная модель заживления ран
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Исследования заживления ран роговицы проводились в течение длительного времени и помогли уменьшить страдания и разработать методы лечения, которые способствуют улучшению здоровья глаз пациентов. Исторически сложилось так, что заживление роговицы изучалось у грызунов, таких как мыши и крысы, но эти модели могут не полностью имитировать человеческие расстройства. Тем не менее, информация о других грызунах, таких как монгольские песчанки (Meriones unguiculatus), скудна в исследованиях роговицы.
Здесь мы описываем технику разработки новой животной модели для изучения заживления роговицы после фоторефракционной кератэктомии. Из-за ограниченной литературы, доступной по роговице M. unguiculatus, мы также описываем гистологический анализ нормальной роговицы. Эти методы исследования также могут быть использованы при изучении глазных заболеваний из-за сходства между роговицами монгольских песчанок и людей с точки зрения генетики, анатомии и физиологии.
Введение
Некоторые из наиболее важных аспектов заживления ран роговицы, которые являются ключевыми проблемами для хирургии переднего сегмента, - это целостность архитектуры эпителия, поддержание прозрачности стромы роговицы и, наконец, результат с точки зрения рефракционных свойств роговицы1.
Роговица является самой внешней прозрачной тканью в передней части глазного яблока и, следовательно, восприимчива к травмам, инфекциям и ожогам; нарушение заживления этих ран может поставить под угрозу здоровье зрения2.
В настоящее время для изучения заживления роговицы доступно несколько животных моделей, и некоторые из них лучше, чем другие, в зависимости от вида и типа механизма, подлежащего изучению1. Есть несколько записей предыдущих исследований сетчатки песчанок2. Однако до сих пор нет опубликованной литературы о процессах рубцевания в роговице этих грызунов.
Здесь мы представляем Meriones unguiculatus (монгольскую песчанку) как животную модель заживления ран в роговице. Описаны процедуры для заживления роговицы после фоторефракционной кератэктомии, которые позволяют изучить различные типы процессов рубцевания роговицы, понять заживление ран с точки зрения динамических фаз живой ткани и, наконец,спланировать соответствующие будущие методы лечения 3. Фототерапевтическая кератэктомия является высоковоспроизводимой техникой с возможностью точного контроля таких параметров, как глубина и диаметр повреждения роговицы4. Кроме того, этот метод не требует процедур с хирургическими инструментами или химическими растворами (например, солевым раствором, формалином, спиртом и т. Д.), Которые могут добавлять переменные, специфичные для инструментов или для оператора, выполняющего процедуру5.
Для эксперимента, представленного в этой статье, использовались три 6-месячных самца песчанок схожих размеров и веса (примерно 90 г). Процедуры проводились только в правых глазах. Одна песчанка (называемая песчанкой 1 или контрольной) не подвергалась фототерапевтической кератэктомии и была энуклеирована для оценки всех нормальных глазных структур. Фототерапевтическая кератэктомия включает в себя контролируемую доставку эксимерного лазерного ультрафиолетового света в роговицу и была разработана для выполнения рефракционной хирургии6. Он использовался у других грызунов, таких как мыши7. Две другие песчанки были подвергнуты фототерапевтической кератэктомии. Один из них был энуклеирован через 24 ч (называемый песчанкой 2), а другой через 96 ч после операции (называемый песчанкой 3).
Для выполнения этого эксперимента песчанка, выбранная случайным образом, была снята на видео для каждого изучаемого состояния, но этот эксперимент ранее проводился с 16 песчанками в общей сложности для каждого состояния. По причинам редактирования было решено использовать случайно выбранную песчанку для каждого состояния (всего три песчанки) в качестве примера.
Основной целью этого исследования является изучение наилучшей доступной модели животных. Однако важно отметить, что не все виды имеют характеристики глаз, сходные с характеристиками человеческого глаза8. В данной статье описана методика, используемая для изучения роговицы Meriones unguiculatus и процедура, выполняемая для генерации травмы роговицы, которые позволяют изучить процесс заживления.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все исследовательские процедуры были одобрены «Институциональной комиссией по уходу и использованию лабораторных животных» Католического университета Кордовы и следовали Руководству Национального исследовательского совета по уходу и использованию лабораторных животных. Эти процедуры были также одобрены властями "Факультета санитарии салона" Католического университета Кордовы и Института Висиона Серро.
1. Обращение с песчанками и анестезия
ПРИМЕЧАНИЕ: Все животные были специфическими мужскими монгольскими песчанками без патогенов (SFP) и содержались в Центре исследований и разработок в области иммунологии и инфекционных заболеваний (CIDIE) (Кордова, Аргентина). Они были получены из Университета Ла-Плата (Буэнос-Айрес, Аргентина).
- Разместите песчанок в клетках с полисульфоном, покрытых подстилкой из кукурузного початка. Обеспечьте питание и фильтрованную водопроводную воду в бутылках для воды ad libitum. Убедитесь, что диапазон температур в помещении составляет от 18 ° C до 24 ° C и используется цикл 12: 12 ч светло-темный.
- Взвесьте каждую песчанку отдельно и определите каждую из них, чтобы избежать путаницы. Сделайте отметку несмываемым чернильным маркером на основании хвоста песчанки. Используйте пинцет, чтобы держать ухо песчанки и сделать отметку, используя неизгладимый маркер на ухе грызуна. Если имеется лаборатория и большой биотерий, назначьте уникальную клетку для каждого грызуна с соответствующей идентификацией.
- Продезинфицируйте ламинарную вытяжку 70% раствором этанола. Поместите все хирургические и одноразовые инструменты, включая иглы, шприцы и стойки, в рабочую зону внутри вытяжки. Поместите одноразовую хирургическую пену в капюшон.
- Используйте небольшой открытый пластиковый контейнер, чтобы держать грызуна на прецизионных весах, чтобы облегчить измерение.
- Используйте для этого эксперимента трех 6-месячных самцов монгольских песчанок одинаковых размеров и веса (~80 г). По одному поместите каждую клетку с грызуном внутрь ламинарного вытяжки. Откройте клетки, определите каждую из песчанок и взвесьте их на весах.
ПРИМЕЧАНИЕ: Песчанки – безобидные, но деликатные животные. Надевайте одноразовые перчатки при обращении с песчанками. - Возьмите песчанку недоминирующей рукой, чтобы крепко держать ее за хвост. Используйте доминирующую руку, с большим и указательным пальцами за ушами, чтобы удерживать животное вентральной областью лицом вверх. Используйте мизинец, чтобы держать хвост.
- Наполните шприц иглой 30 г с 1 мл кетамина и ксилазина. Вводят анестезию внутрибрюшинно грызуну (50-100 мг/кг кетамина и 2 мг/кг ксилазина)9 с помощью доминирующей руки. Продолжительность эффекта составит примерно 20-50 мин (возможны вариации).
- Чтобы убедиться, что песчанка полностью обезболена, проверьте с помощью щипки пальца ноги, защемления хвоста и отражения роговицы и т. Д., Прежде чем делать разрезы в роговице.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все процедуры только в правом глазу.
2. Оптическая когерентная томография (ОКТ) роговицы
- Поместите стерильные хирургические шторы для защиты оборудования от выделений или шерсти животных.
- Убедитесь, что один из операторов держит животное, в то время как другой оператор делает снимки. Оператор должен положить руки на оборудование, держа песчанку, чтобы глаз песчанки был как можно более устойчивым и неподвижным для изучения. Положите руку, держащую песчанку на подбородке.
- Запустите программное обеспечение, управляющее центром развертывания Office, и нажмите «Принять образ», а затем «Сохранить нужное изображение». Выполняют множественные сагиттальные и корональные ломтики роговицы. Представьте глаз под ОКТ и сделайте несколько срезов, чтобы увидеть передний сегмент роговицы грызуна.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если полученное изображение не является резким и глаз слегка сдвинулся, повторите процедуру несколько раз, чтобы получить достаточное количество изображений. - С помощью программного обеспечения OCT выполните пахиметрические измерения центральной и периферийной областей. На главном экране программного обеспечения нажмите Take Image, а затем нажмите кнопку Сохранить желаемое изображение .
- Выполняйте измерения на нормальном или контрольном глазу и сразу после фототерапевтической кератэктомии на других глазах грызунов.
3. Эксимер-лазерная фототерапевтическая кератэктомия (ПТК)
- Поместите стерильные хирургические шторы на эксимерный лазерный аппарат для защиты оборудования от выделений или шерсти животных.
- Закапывать каплю местного пропаракаина гидрохлорида (0,5%) в глаз для лечения за 5 мин до хирургической процедуры.
- Используйте недоминирующую руку, чтобы крепко держать песчанку. Доминирующей рукой откройте веки животного, чтобы изображения могли быть захвачены должным образом. Чтобы иметь возможность сфокусироваться и получить четкое изображение, убедитесь, что руки человека, держащего песчанку, опираются на голову оборудования. Поместите руки, держащие животное, туда, где пациент поместит шею.
- Выполните абляцию ПТК на правом глазу. Используйте следующие параметры: абляция толщиной от 60 мкм до 62 мкм, оптическая зона 3 мм, длительность 4 с и в общей сложности 1 867 импульсов.
ПРИМЕЧАНИЕ: ПТК проводится только на песчанке 2 и песчанке 3. На этом этапе второй оператор подготавливает и активирует лазер для удаления ткани роговицы. - Сразу после процедуры сделайте фотографии и выполните анализ OCT для записи и документирования изменений поверхности обработанных глаз.
- После завершения процедуры поместите грызуна обратно в клетку, следите за жизненно важными показателями (частота сердечных сокращений: 360 ударов в минуту; ректальная температура: 37-38,5 ° C; частота дыхания: 90 вдохов в минуту) и дайте животному восстановиться после анестезии.
4. Пробуждение песчанок после ПТК роговицы
- Вводят бупренорфин (от 0,1 мг/кг до 0,05 мг/кг) и атипамезол (0,1-1 мг/кг) через внутрибрюшинные инъекции.
- Поместите каждую песчанку в соответствующую домашнюю клетку и следите за жизненными показателями для нормального пробуждения (нормальная температура тела составляет 37-39 ° C).
- Нанесите эритромициновую мазь, чтобы сохранить поверхность чистой и предотвратить инфекцию. Выполняйте эту процедуру два раза в день.
- Вводят бупренорфин (каждые 6-12 ч) подкожно (0,01-0,05 мл) для обезболивания и глазной мази в течение двух последовательных дней после ПТК.
5. Метод эвтаназии
- Выполняйте эвтаназию в домашней клетке, когда это возможно.
- Введите сжатый углекислый газ (CO2) в домашнюю клетку. Скорость заполнения 30%-70% объема камеры в минуту с добавлением CO2 к существующему воздуху в домашней клетке достаточна для получения смеси, отвечающей поставленной цели (для камеры объемом 10 л используйте расход 3-7 л/мин). Используют вывих шейки матки (как вторичный метод эвтаназии) для обеспечения гибели грызуна.
- Через 24 ч и 96 ч после операции для песчанки 2 и песчанки 3, соответственно, извлеките животное из домашней клетки, чтобы выполнить энуклеацию глазного яблока (как нормального глазного яблока, так и того, которое подвергается операции) для наблюдения за заживлением роговицы.
- Положите животное на операционный стол, и проверьте отсутствие сердцебиения примерно на 1 мин.
6. Хирургия глаза
- Удалите верхние и нижние веки, чтобы получить доступ к глазному яблоку. Используйте хирургические щипцы и ножницы для удаления век. Размер рабочей зоны настолько мал и деликатен, что удаление век позволяет энуклеировать глазное яблоко, не повреждая его.
- Чтобы энуклеировать глазное яблоко, сделайте разрез в наружной кантусе и направьте ножницы в заднее направление. Повторите эту процедуру с внутреннего кантуса, отделив глазное яблоко от орбиты.
- Раздел зрительного нерва в задней части глазного яблока. Следует уточнить, что заднее орбитальное сплетение обычно генерирует незначительное кровотечение при выполнении данной методики, что затрудняет работу.
- Вводят глазное яблоко в микроцентрифужную трубку со стерильным физиологическим раствором в течение 30 с - 1 мин, чтобы вымыть остаточную кровь.
- Поместите глазное яблоко в микроцентрифужную трубку, содержащую 10% формальдегида для последующего анатомопатологического анализа, как описано ниже. Сделайте несколько снимков и фотографий.
7. Анатомо-патологический анализ
- Встраивают весь глаз в 10% буферизованный формалин в течение 6-24 ч.
- Вырежьте ткань с помощью микротома. Убедитесь, что разрезанная ткань имеет толщину 3 мм.
- Замочите ткань в 96% спирте на 30-90 мин, и повторите эту процедуру дважды.
- Поместите ткань в изопропиловый спирт на 30-90 мин, и повторите эту процедуру дважды.
- Поместите ткань в ксилол или заменитель ксилола на 1-3 ч.
- Встраиваем ткань в жидкий керосин минимум на 1 ч.
- Используйте блок, чтобы поместить ткань и встроить ее в жидкий парафин. Дайте ему затвердеть (поместите в холодное место) и нарежьте.
- Подготовьте микротом к разделению в соответствии с инструкциями производителя.
- Впоследствии используют такие пятна, как гематоксилин и эозин.
- Получайте снимки с помощью камеры, добавленной в микроскоп.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
В настоящем исследовании вся структура роговицы была тщательно проанализирована с использованием гистологических методов и дополнительных исследований переднего сегмента, таких как оптическая когерентная томография. Анализ изображения с использованием оптической когерентной томографии структур переднего сегмента показывает нормальный эпителий и строму (рисунок 1), с толщиной центральной и периферической роговицы 160 мкм и 106 мкм ± 2 мкм соответственно. Другие публикации также показали, что ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Физиология заживления ран роговицы – это баланс между регенерацией тканей и поддержанием гомеостаза. Чрезмерное заживление ран может привести к фиброзу и рубцеванию, что в конечном итоге может привести к потере функции органа. С быстрой эволюцией хирургических процедур роговицы важность понимания заживления ран роговицы и физиологических и патологических событий, связанных с этим, невозможно переоценить11.
Многочисленные исследовательские работы утверждают, что песчанк...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Мы хотели бы поблагодарить инженера Родриго де ла Фуэнте за его неоценимую помощь и техническую поддержку. Мы также благодарим Марию Эухению Корбелу за повествование и Присциллу Хазрун за издание рисунков. Уго Лухан разрешил нам использовать помещения Центра исследований и разработок в области иммунологии и инфекционных заболеваний (CIDIE).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Анестезия | Тододрогаз | ||
| Эппендорф трубки | Тододрогаз | ||
| Эксимерный лазер | Технолас | 2022445 | |
| Флуоресцеин | Поэн | ||
| щипцы | Ofcor | 3339 | |
| Формальдегид | Тододрогаз | ||
| Перчатки | Тододрогас | ||
| Кетамин | Sigma-Aldrich | ||
| Оптическая когерентная томография | Optovue | 659007 | |
| Proparacaine | Poen | ||
| Scisors | Ofcor | 3336 | |
| Стерильные простыни | Soporte hospitalario | ||
| Стерильные марли | Soporte hospitalario | ||
| Шприцы и иглы | Tododrogas | ||
| Ксилазин | Сигма-Олдрич |
Ссылки
- Kuo, I. C. Corneal wound healing. Current Opinion in Ophthalmology. 15 (4), 311-315 (2004).
- Agrawal, V. B., Tsai, R. J. Corneal epithelial wound healing. Indian Journal of Ophthalmology. 51 (1), 5-15 (2003).
- Lu, L., Reinach, P. S., Kao, W. W. Corneal epithelial wound healing. Experimental Biology and Medicine. 226 (7), 653-664 (2001).
- Rathi, V. M., Vyas, S. P., Sangwan, V. S. Phototherapeutic keratectomy. Indian Journal of Ophthalmology. 60 (1), 5-14 (2012).
- Baumeister, M., Bühren, J., Ohrloff, C., Kohnen, T. Corneal re-epithelialization following phototherapeutic keratectomy for recurrent corneal erosion as in vivo model of epithelial wound healing. Ophthalmologica. 223 (6), 414-418 (2009).
- Fagerholm, P. Phototherapeutic keratectomy: 12 years of experience. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 81 (1), 19-32 (2003).
- Mohan, R. R., Stapleton, W. M., Sinha, S., Netto, M. V., Wilson, S. E. A novel method for generating corneal haze in anterior stroma of the mouse eye with the excimer laser. Experimental Eye Research. 86 (2), 235-240 (2008).
- Shah, D., Aakalu, V. K. Murine corneal epithelial wound modeling. Methods in Molecular Biology. 2193, 175-181 (2021).
- Gerbil-Specific Anesthesia Guidance. Animal Resources Center. The University of Texas at Austin. , Available from: research.utexas.edu/wp-content/uploads/sites/7/2020/02/Gerbil_Anesthesia_Guidance_ARC_112519.pdf (2020).
- Zorio, D. A. R., et al. De novo sequencing and initial annotation of the Mongolian gerbil (Meriones unguiculatus) genome. Genomics. 111 (3), 441-449 (2019).
- Kalha, S., Kuony, A., Michon, F. Corneal epithelial abrasion with ocular burr as a model for cornea wound. Journal of Visualized Experiments. (137), e58071(2018).
- Yang, S., et al. The electroretinogram of Mongolian gerbil (Meriones unguiculatus.): Comparison to mouse. Neuroscience Letters. 589, 7-12 (2015).
- Baker, A. G., Emerson, V. F. Grating acuity of the Mongolian gerbil (Meriones unguiculatus). Behavioural Brain Research. 8 (2), 195-209 (1983).
- Govardovskii, V. I., Röhlich, P., Szél, A., Khokhlova, T. V. Cones in the retina of the Mongolian gerbil, Meriones unguiculatus: An immunocytochemical and electrophysiological study. Vision Research. 32 (1), 19-27 (1992).
- Zanandréa, L. I., Oliveira, G. M., Abreu, A. S., Pereira, F. E. Ocular lesions in gerbils (Meriones unguiculatus) infected with low larval burden of Toxocara canis: Observations using indirect binocular ophthalmoscopy. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical. 41 (6), 570-574 (2008).
- Cheng, S., et al. Enhancement of de novo sequencing, assembly and annotation of the Mongolian gerbil genome with transcriptome sequencing and assembly from several different tissues. BMC Genomics. 20 (1), 903(2019).
- Henriksson, J. T., McDermott, A. M., Bergmanson, J. P. Dimensions and morphology of the cornea in three strains of mice. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 50 (8), 3648-3654 (2009).
- Panagiotopoulos, M., Gan, L., Fagerholm, P. Stroma remodelling during healing of corneal surface irregularities induced by PTK. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 85 (4), 387-394 (2007).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
