Быстрая инкапсуляция восстановленного цитоскелета внутри гигантских одноцветных везикул

Липидные двухслойные компартменты используются в качестве модельных синтетических клеток для изучения замкнутых органических реакций и мембранных процессов или в качестве модулей-носителей в приложениях доставки лекарств ^1,2. Биология снизу вверх с очищенными компонентами требует минимальных экспериментальных систем для изучения свойств и взаимодействий между биомолекулами, такими как белки и липиды ^3,4. Однако с развитием этой области возрастает потребность в более сложных экспериментальных системах, которые лучше имитируют условия в биологических клетках. Инкапсуляция в ГУВ является практическим подходом, который может предложить некоторые из этих клеточных свойств, обеспечивая деформируемый и селективно проницаемый липидный бислой и ограниченное реакционное пространство. В частности, восстановление in vitro цитоскелетных систем, как моделей синтетических клеток, может извлечь выгоду из инкапсуляции в мембранных компартментах⁵. Многие цитоскелетные белки связываются и взаимодействуют с клеточной мембраной. Поскольку большинство цитоскелетных сборок образуют структуры, которые охватывают всю клетку, их форма естественным образом определяется удержанием размером с клетку⁶.

Для генерации ГУВ используются различные методы, такие как набухание ^7,8, слияние малых^{пузырьков 9,10}, перенос эмульсии ^11,12, импульсная струя¹³ и другие микрофлюидные подходы ^14,15. Хотя эти методы все еще используются, каждый из них имеет свои ограничения. Таким образом, очень желателен надежный и простой подход с высокой урожайностью инкапсуляции ГУВ. Хотя такие методы, как спонтанное набухание и электросвеличивание, широко распространены для образования ГУВ, эти методы в первую очередь совместимы со специфическими липидными композициями¹⁶, буферами с низкой концентрацией соли¹⁷, меньшим размером молекулы инкапсуланта¹⁸ и требуют большого объема инкапсулянта. Слияние нескольких мелких пузырьков в ГУВ по своей природе энергетически неблагоприятно, что требует специфичности в заряженных липидных композициях⁹ и/или внешних агентах, вызывающих слияние, таких как пептиды¹⁹ или другие химические вещества. С другой стороны, перенос эмульсии и микрофлюидные методы могут потребовать стабилизации капель путем удаления поверхностно-активного вещества и растворителя после образования бислоя, соответственно^18,20. Сложность экспериментальной установки и устройства в микрофлюидных методах, таких как импульсная струйная обработка, создает дополнительную проблему²¹. cDICE представляет собой метод на основе эмульсии, полученный из аналогичных принципов^, регулирующих перенос эмульсии ^22,23. Водный раствор (наружный раствор) и липидно-масляная смесь стратифицируются центробежными силами во вращающейся цилиндрической камере (камере cDICE), образуя насыщенную липидами границу раздела. Перемещение липидных монослойных водных капель во вращающуюся камеру cDICE приводит к застегиванию бислоя, поскольку капли пересекают насыщенную липидами границу в наружный водный раствор ^22,24. Подход cDICE является надежным методом инкапсуляции GUV. При представленном модифицированном способе достигается не только высокий выход пузырьков, характерный для cDICE со значительно более коротким временем инкапсуляции (несколько секунд), но и время генерации ГУВ, позволяющее наблюдать зависимые от времени процессы (например, формирование актиновых цитоскелетных сетей), значительно сокращается. Протокол занимает около 15-20 минут от начала сбора и визуализации GUV. Здесь генерация GUV описывается с использованием модифицированного метода cDICE для инкапсуляции актина и актин-связывающих белков (ABP). Однако представленный способ применим для инкапсуляции широкого спектра биологических реакций и мембранных взаимодействий, от сборки биополимеров до бесклеточной экспрессии белка и переноса груза на основе мембранного слияния.

1. Приготовление масляно-липидной смеси

ПРИМЕЧАНИЕ: Этап должен быть выполнен в вытяжном шкафу в соответствии со всеми рекомендациями по безопасности при обращении с хлороформом.

1. Возьмите 0,5 мл хлороформа в стеклянном флаконе объемом 15 мл. Добавьте 88 мкл 25 мг/мл диолеоил-фосфохолина (DOPC), 9,3 мкл холестерина 50 мг/мл и 5 мкл 1 мг/мл диолеоил-фосфоэтаноламина-лизрамина родамина B (родамин ПЭ) (см. Таблицу материалов) в стеклянный флакон объемом 15 мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Конечные молевые фракции DOPC и холестерина в силиконовом масле/минеральном масле составляют 69,9% и 30% соответственно. Установлено, что 20-30 моль% холестерина является оптимизированной концентрацией для мембранной текучести и стабильности ГУВ, генерируемых по представленной методике^25,26. Физиологически эти значения находятся в пределах диапазона концентраций холестерина, обнаруженного в плазматических мембранах клеток млекопитающих⁶. Запасы липидов получают в виде растворов хлороформа и хранят при -20 °C. Флаконы с липидным запасом должны быть акклиматизированы до комнатной температуры перед их открытием.
2. Пипетка 7,2 мл силиконового масла и 1,8 мл минерального масла во втором флаконе объемом 15 мл (см. Таблицу материалов). Как правило, это нужно делать в бардачке с низкой влажностью, в основном, если минеральное масло используется повторно.
3. Смешайте масла путем вихря на максимальной скорости вращения (3200 об/мин) в течение 10 с, добавьте смесь во флакон, содержащий липидно-хлороформную смесь, и немедленно поместите ее на вихревой смеситель. Вихрь на 10-15 с при максимальной скорости вращения (3200 об/мин). Полученная смесь липидов в масле должна быть слегка мутной, так как липиды не полностью растворяются в масле, а скорее диспергируются в виде мелких агрегатов²⁴.
4. Поместите дисперсию липидов в масле в ультразвуковой аппарат ванны (см. Таблицу материалов) с ультразвуковой мощностью 80 Вт и рабочей частотой 40 кГц при комнатной температуре в течение 30 мин. Используйте смесь немедленно или храните при температуре 4 °C в течение максимум 24 ч.

2. Генерация везикул

1. Установите 3D-печатный вал (дополнительный файл 1), изготовленный из черной смолы (см. Таблицу материалов) на настольной перемешиваемой пластине и установите скорость вращения до 1200 об/мин.
2. Установите на вал 3D-печатную камеру cDICE (Дополнительный файл 2), изготовленную из прозрачной смолы (см. Таблицу материалов) (рисунок 1A,B).
3. Готовят растворы актина и актин-связывающих белков (АБП) по отдельности в общем объеме 20 мкл.
   1. Получают 1-10 мкМ актина в глобулярном актиновом буфере (G-буфере), включая 10% актина ATTO 488 (см. Таблицу материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: 1x G-буфер содержит 5 мМ Tris-HCl, pH 8,0 и 0,2 мМ CaCl₂.
   2. Добавьте нитевидный буфер полимеризации актина (F-буфер), чтобы начать полимеризацию актина на льду. Держите растворы на льду, чтобы замедлить полимеризацию актина перед добавлением сшивателя.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 1x F-буфер содержит 50 мМ KCl, 2 мМ_MgCl2 и 3 мМ АТФ в 10 мМ Tris, рН 7,5.
   3. Подождите 15 минут, чтобы обеспечить начало полимеризации актина на льду, прежде чем добавлять интересующие сшиватели в желаемом молярном соотношении. Держите раствор на льду до инкапсуляции.
   4. Получают актин-связывающие белки (ABP) отдельно в микропробирке (рисунок 1C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап выполняется, когда комбинация ABP (например, миозин, α-актинин, фазцин, комплекс Arp2/3) инкапсулируется с актином 25,26,27. В таких случаях желаемое количество каждого ABP извлекается из его запаса и добавляется в микропробирку, предназначенную для ABP. Поскольку общий раствор должен составлять 20 мкл, запасы АЛКВО должны быть подготовлены таким образом, чтобы желаемое количество общей смеси АВП не превышало 5-6 мкл. Единственным ABP, используемым в репрезентативных результатах здесь, является фасцин, препарат которого упомянут ниже.
      1. Аликвот 1,57 мкл фасцина из 1,75 мг/мл запаса фасцина (см. Таблицу материалов) и непосредственно добавляют в раствор актина на стадии 2.7. Это соответствует 2,5 мкМ фазцина в растворе.
4. Добавьте 7,5% среды градиента плотности (см. Таблицу материалов) в раствор актина для создания градиента плотности между внешней и внутренней водной фазами для облегчения осаждения ГУВ.
5. Дозировать 700 мкл наружного раствора 200 мМ глюкозы в камеру (рисунок 1D, слева).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Осмолярность внутреннего раствора определяет концентрацию глюкозы. Для этих экспериментов осмолярность внутреннего раствора составляет ~200 мОсм, поэтому в качестве наружного раствора используется раствор глюкозы 200 мМ.
6. Добавьте достаточное количество липидно-масляной смеси (>3 мл в зависимости от размера камеры) в камеру до тех пор, пока не будет заполнено 60-80% камеры (рисунок 1D, справа). Между липидно-масляной смесью и наружным раствором образуется интерфейс.
7. Переведите ABP (приготовленные на этапе 2.3.4) в раствор актина. Используя обычную пипетку объемом 100-1000 мкл, немедленно переложите 700 мкл липидно-масляной смеси в смесь актин-АБФ (рисунок 1Е, слева). Пипетка вверх и вниз 8 раз для получения липидно-монослойных капель размером с клетку диаметром в пределах 7-100 мкм (рисунок 1Е, средний).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Шаг 2.7 должен быть выполнен за несколько секунд, чтобы избежать сборки сети актина перед инкапсуляцией. Таким образом, перед выполнением этапа убедитесь, что наконечники пипеток уже вставлены в пипетки и готовы к переносу смеси.
8. Используя ту же пипетку объемом 100-1000 мкл, немедленно дозируйте всю эмульсию во вращающуюся камеру. Капли приобретают второй листок липидов, пересекая монослой липидов на границе раздела масло-внешний раствор, тем самым образуя ГУВ (рисунок 1E, справа).
9. Снимите камеру с перемешиваемой пластины и выбросьте большую часть липидно-масляной смеси, наклонив камеру в контейнере для отходов так, чтобы большая часть липидно-масляной смеси была слита из большого отверстия в центре камеры.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Таким образом, липидно-масляная смесь вытягивается из камеры, избегая смешивания липидно-масляной смеси с наружным раствором на следующей стадии.
10. Держите камеру крышкой лицом к пользователю. Откройте крышку камеры и слегка наклоните камеру в сторону пользователя. Интерфейс между наружным раствором, содержащим ГУВ, и липидно-масляной смесью виден из отверстия камеры (где расположена крышка).
11. Используя пипетку, соберите достаточное количество наружного раствора, содержащего ГУВ, и дозируйте 50-300 мкл наружного раствора в 96-луночную пластину для получения соответствующей плотности ГУВ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следуя этому протоколу, в общей сложности около 2 х 10⁵ ГУВ высвобождаются во внешнем растворе внутри камеры. Дисперсия ГУВ не была количественно определена; однако диаметр около 90% ГУВ находится в пределах 12-30 мкм. ГУВ с любым диаметром в диапазоне 7-50 мкм можно встретить в популяции. В зависимости от инкапсулированной среды градиента плотности, размера ГУВ и глубины раствора в плите скважины, ГУВ оседанию на поверхности требуется 2-15 мин. Выход ГУВ с восстановленными актиновыми пучками составляет около 90%.

3. Визуализация и реконструкция 3D-изображений

1. Установите пластину из 96 скважин на сцене перевернутого микроскопа, оснащенного вращающимся дисковым (или лазерным сканированием) конфокальным блоком, камерой EMCCD или sCMOS и объективом с погружением в масло 60x (см. Таблицу материалов).
2. Сосредоточьтесь на любой интересующей области (ROI) и возьмите последовательность изображений z-стека из ROI с интервалом z-шага 0,5 мкм.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку ГУВ могут быть слегка смещены на поверхности с течением времени, рекомендуется захватывать многоволновый набор изображений в каждой z-плоскости, если визуализируется несколько флуорофоров, т. Е. Делать группу изображений 561 нм и 488 нм на каждой z-полосе за раз, чтобы захватить изображения АКТИНА ATTO 488 и RHOD PE.
3. Сохраните каждую последовательность изображений z-стека в .tiff формате.
4. Откройте интересующую последовательность изображений в программном обеспечении для обработки изображений (ImageJ/Fiji). Определите изображение с наибольшей интенсивностью. Удерживайте «ctrl + shift + c», чтобы открыть окно «Яркость и контрастность», и нажмите « Сброс».
5. В меню ImageJ/Fiji перейдите в раздел Анализ > Установить масштаб и введите известное физическое расстояние и его единицу измерения для каждого пикселя изображения.
6. В меню ImageJ/Fiji перейдите в раздел Image > Stacks > 3D-проект , чтобы реконструировать 3D-изображение из z-стека. Установите «Метод проекции» в качестве точки яркости, «Интервал между срезами (мкм)» в 0,5 и установите флажок Интерполировать. Параметры по умолчанию можно использовать для остальных параметров.
   ПРИМЕЧАНИЕ: z-интервалы в некоторых микроскопах могут не калиброваться, и фактическое движение в z-направлении может незначительно отличаться от введенного z-интервала (т.е. 0,5 мкм). В таких случаях 3D-калибровочный образец, такой как флуоресцентные микросферы с известным диаметром, может быть использован для получения фактического z-интервала. Таким образом, это значение будет использоваться как «Интервал между срезами (мкм)» для 3D-проекции.

Чтобы продемонстрировать успешную генерацию цитоскелетных ГУВ с использованием текущего протокола, были восстановлены структуры пучков фасцин-актин в ГУВ. Фасцин представляет собой короткий сшиватель актиновых нитей, который образует жесткие параллельно выровненные пучки актина и очищается от кишечной палочки в виде белка слияния глутатион-S-трансферазы (GST)26. Сначала было восстановлено 5 мкМ актина, включая 0,53 мкМ актина ATTO488 в буфере полимеризации актина и 7,5% среды градиента плотности. При добавлении фасцина в концентрации 2,5 мкМ и инкапсулировании смеси фасцин-актин в ГУВ образовывались структуры актиновых пучков. Конфокальные последовательности изображений Z-стека инкапсулированных структур актиновых пучков в ГУВ, меченных родамином PE, были захвачены через 1 ч после инкапсуляции (рисунок 2A). Использование этого протокола, присущая конкуренция и сортировка инкапсулированных актиновых сшивающих агентов, α-актинина и фасцина, которые вместе образуют различные паттерны актиновых пучков в зависимости от размера GUV, были ранее продемонстрированы26.

Как и модифицированный инвертированный эмульсионный подход, представленный здесь, традиционный процесс cDICE генерирует цитоскелетные ГУВ с высоким выходом, но требует шприцевого насоса и установки трубки для контролируемой инъекции белкового раствора во вращающуюся камеру при низких скоростях потока в порядке нанолитров в секунду22,28. При таком подходе эмульсия непосредственно генерируется во вращающейся камере cDICE; тонкий капилляр вводится в масляную фазу. Белковый раствор вводят через шприцевой насос. Капли образуются и срезаются на кончике капилляра, прежде чем они перемещаются в водную внешнюю фазу, где они превращаются в ГУВ, подобно способу, описанному выше. На рисунке 2B показаны везикулы, которые инкапсулируют реакционную смесь с использованием этого подхода. Реакционная смесь содержит 6 мкМ актина, который связывается с 0,9 мкМ фасцина. Здесь эти два метода и их результаты не сравниваются, но отмечают, что оба они генерируют высокий выход GUV.

Рисунок 1: Экспериментальная установка для генерации ГУВ. (A) Вид сверху и вид бокового сечения камеры cDICE. (B) Фотографии установки для прядильной камеры. (С-Е) Схематические иллюстрации пошаговых процедур генерации ГУВ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Инкапсуляция структур актиновых пучков. (A) Изображения показывают репрезентативные флуоресцентные конфокальные срезы GUV (слева) и максимальные проекции конфокального z-стека актиновых и липидных каналов (справа). Фасцин, 2,5 мкМ; актин, 5 мкМ (в т.ч. 10% АТТО 488 актина). Шкала стержня = 10 мкм. (B) Инкапсуляция структур актиновых пучков с использованием обычного cDICE. На изображении показана репрезентативная максимальная проекция конфокальных флуоресцентных изображений инкапсулированных актиновых пучков, образующихся в присутствии фасцина. Фасцин, 0,9 мкМ; Актин, 6 мкМ. Шкала = 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный файл 1: 3D-печатная конструкция вала. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 2: Дизайн для 3D-печатной камеры cDICE. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.