Методическая статья

Сравнение методов выделения энтомопатогенных грибов из образцов почвы

DOI:

10.3791/63353

⸱

6 января 2022 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, Instituto de Veterinária, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, 2Laboratório de Taxonomia Bioquímica e Bioprospecção de Fungos/Coleção de Cultura de Fungos Filamentosos, Instituto Oswaldo Cruz, Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), 3Departamento de Parasitologia Animal, Instituto de Veterinária, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Энтомопатогенные грибковые колонии выделяют из образцов тропической почвы с помощью приманки Tenebrio , приманки Galleria , а также селективной искусственной среды, т. е. агара декстрозы картофеля, обогащенного дрожжевым экстрактом, дополненным хлорамфениколом, тиабендазолом и циклогексимидом (среда CTC).

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Целью настоящего исследования является сравнение эффективности использования приманок от насекомых с искусственной селективной средой для выделения энтомопатогенных грибов (EPF) из образцов почвы. Почва является богатой средой обитания для микроорганизмов, в том числе EPF, особенно принадлежащих к родам Metarhizium и Beauveria, которые могут регулировать вредителей членистоногих. Биопрепараты на основе грибов доступны на рынке в основном для борьбы с вредителями сельскохозяйственных членистоногих. Тем не менее, несмотря на высокое эндемичное биоразнообразие, лишь немногие штаммы используются в коммерческих биопродуктах во всем мире. В настоящем исследовании 524 образца почвы были выращены на агаре декстрозы картофеля, обогащенном дрожжевым экстрактом, дополненным хлорамфениколом, тиабендазолом и циклогексимидом (среда CTC). Рост колоний грибов наблюдался в течение 3 недель. Все Metarhizium и Beauveria EPF были морфологически идентифицированы на уровне рода. Кроме того, некоторые изоляты были молекулярно идентифицированы на уровне видов. Двадцать четыре из этих 524 образцов почвы были также исследованы на предмет появления EPF с использованием метода приманки для насекомых (Galleria mellonella и Tenebrio molitor). В общей сложности 51 штамм EPF был выделен (41 Metarhizium spp. и 10 Beauveria spp.) из 524 образцов почвы. Все грибковые штаммы были выделены либо из пахотных земель, либо из лугов. Из 24 образцов, отобранных для сравнения, 91,7% были положительными на EPF с использованием приманки Galleria , 62,5% с использованием приманки Tenebrio и 41,7% с использованием CTC. Наши результаты показали, что использование приманок для насекомых для изоляции EPF от почвы более эффективно, чем использование среды CTC. Сравнение методов изоляции в дополнение к идентификации и сохранению EPF оказывает положительное влияние на знания о биоразнообразии. Улучшение коллекции EPF поддерживает научное развитие и технологические инновации.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Почва является источником нескольких микроорганизмов, в том числе энтомопатогенных грибов (EPF). Эта конкретная группа грибов признана по их способности колонизировать и часто убивать членистоногих хозяев, особенно насекомых1. После выделения, характеризации, отбора вирулентных штаммов и регистрации EPF массово производятся для борьбы с членистоногими вредителями, что подтверждает их экономическую значимость2. Соответственно, выделение EPF считается первым шагом к разработке биопестицида. Beauveria spp. (Hypocreales: Cordycipitaceae) и Metarhizium spp. (Hypocreales: Clavicipitaceae) являются наиболее распространенными грибами, используемыми для борьбы с членистоногими и вредителями3. EPF были успешно выделены из почвы, членистоногих с видимым микозом, колонизированных растений и растительной ризосферы 4,5.

Выделение EPF также может быть полезно для изучения разнообразия, распространения и экологии этой конкретной группы. В недавней литературе сообщалось, что использование EPF недооценивается, ссылаясь на несколько нетрадиционных применений EPF, таких как их способность улучшать рост растений4, удалять токсичные загрязняющие вещества из почвы и использоваться в медицине6. Настоящее исследование направлено на сравнение эффективности выделения EPF из почвы с использованием приманок насекомых с искусственной питательной средой 7,8,9. Использование Galleria mellonella L. (Lepidoptera: Phyralidae) в качестве приманки для насекомых в контексте изоляции EPF было хорошо принято. Эти личинки используются во всем мире научным сообществом в качестве экспериментальной модели для изучения взаимодействий хозяин-патоген10,11. Личинка Tenebrio molitor L. (Coleoptera: Tenebrionidae) считается еще одной моделью насекомого для исследований, связанных с вирулентностью и выделением EPF, поскольку это насекомое легко редко встречается в лаборатории при низкой стоимости 7,12.

Независимые от культуры методы, такие как использование различных методов ПЦР, могут быть применены для обнаружения и количественной оценки EPF на их субстратах, включая почву13,14. Тем не менее, чтобы правильно изолировать эти колонии грибов, их субстрат следует культивировать на селективной искусственной среде9, или грибы, присутствующие в образцах, могут быть приманены с использованием чувствительных насекомых15. С одной стороны, CTC представляет собой искусственную среду без додина, которая состоит из агара декстрозы картофеля, обогащенного дрожжевым экстрактом, дополненным хлорамфениколом, тиабендазолом и циклогексимидом. Эта среда была разработана Fernandes et al. 9 для максимального извлечения естественных Beauveria spp. и Metarhizium spp. из почвы. С другой стороны, личинки G. mellonella и T. molitor также могут быть успешно использованы в качестве приманок для получения изолятов EPF из почвы. Тем не менее, согласно Sharma et al.15, в меньшем количестве исследований сообщалось о сопутствующем использовании и сравнении этих двух насекомых-приманок. На почвах португальских виноградников наблюдалось значительное восстановление Metarhizium robertsii (Metscn.) Сорокин с использованием Т. личинки молитора по сравнению с личинками G. mellonella; напротив, Beauveria bassiana (Балс. -Крив.) Изоляция Vuill была связана с использованием приманок G. mellonella 15. Поэтому решение о том, какой метод изоляции EPF использовать (например, G. mellonella-bait, T. molitor-bait или CTC medium), следует рассматривать в соответствии с целью исследования и лабораторной инфраструктурой. Целью настоящего исследования является сравнение эффективности использования приманок от насекомых с искусственной селективной средой для выделения EPF из образцов почвы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Поскольку в настоящем исследовании был получен доступ к бразильскому генетическому наследию, исследование было зарегистрировано в Национальной системе управления генетическим наследием и связанными с ним традиционными знаниями (Sisgen) под кодом AA47CB6.

1. Отбор проб почвы

  1. Соберите 800 г почвы (с вторичными корнями растений или без них) на глубину до 10 см с помощью небольшой лопаты. Храните их в полипропиленовых мешках при комнатной температуре до начала эксперимента.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Небольшие корни также могут быть собраны, поскольку СООБЩАЕТСЯ, что EPF обладают компетенцией в ризосфере. Чем быстрее обработка образцов, тем лучше, потому что споры грибов могут быть менее жизнеспособными с течением времени. В настоящем исследовании образцы анализировались не более чем через 7 дней после сбора.
  2. Используйте GPS для определения местоположения собранных образцов по широте и долготе и классифицируйте собранную площадь в соответствии с типом почвы (например, луга, местные тропические леса, берега озер или пахотные земли).

2. Методы выделения энтомопатогенных грибов

  1. Изоляция с использованием селективной искусственной среды СТС.
    1. Для приготовления среды CTC [агар декстрозы картофеля плюс дрожжевой экстракт (PDAY), дополненный 0,5 г/л хлорамфеникола, 0,001 г/л тиабендазола и 0,25 г/л циклогексимида9], взвешивают все реагенты по отдельности, смешивают их в дистиллированной воде и стерилизуют среду в автоклаве. В шкафу биобезопасности пластина 23 мл среды в пластины Петри размером 60 мм х 15 мм.
      ВНИМАНИЕ: При взвешивании реагентов CTC используйте лабораторный халат, маску, перчатки и очки, потому что циклогексимид и хлорамфеникол токсичны.
    2. Взвесьте 0,35 ± 0,05 г каждого образца почвы (с корнями или без них) и поместите его в микропробирку объемом 1,5 мл.
    3. В шкаф биобезопасности добавляют 1 мл стерильной 0,01% (об./об.) водной суспензии моноолеата полиоксиэтиленсорбитана в микротрубку, содержащую почву и вихрь, в течение 30 с.
    4. Удалите 50 мкл супернатанта и нанесите его на центр пластин Петри со средой CTC. Равномерно рассеять суспензии по поверхности среды с помощью стерильного дригальского шпателя (диаметром 6 мм).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого образца почвы должно быть подготовлено не менее трех реплик.
    5. Инкубируют пластины в климатических камерах (25 ± 1 °C, относительная влажность ≥80%) в темноте и наблюдают рост колоний грибов после 7, 14 и 21 дня инкубации.
    6. Наблюдайте за макроморфологией и микроморфологией грибковых колоний, ищущих EPF. Переведите культуры EPF на среду агара декстрозы картофеля плюс 0,05% хлорамфеникола (PDAC) до получения чистых культур.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте ключи описания, представленные ниже на этапе 3, для идентификации колоний EPF.
  2. Изоляция с использованием приманок от насекомых
    1. Используйте поверхностно-дезинфицированные личинки G. mellonella и T. molitor поздней стадии. Погрузить личинки в 0,5% гипохлорит натрия на 1 мин для стерилизации. Промыть личинок дважды стерильной водой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Личинки G. mellonella из четвертой стадии были использованы в настоящем исследовании. Личиночные стадии T. molitor не были стандартизированы.
    2. Используйте пластиковые горшки для сборки приманок. Добавьте 250 г собранной почвы в каждый пластиковый горшок (ширина 98 мм x высота 47 мм x длина 142 мм). Отделите по 15 личинок каждого вида (T. molitor и G. mellonella) и отложите по пять личинок на пластиковый горшок. Хранить кастрюли при температуре 25 ± 1 °C и относительной влажности ≥ 80% в темноте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Просверлите 10 небольших отверстий (диаметром 2 мм) в крышках горшка, чтобы обеспечить вентиляцию. Для сверления отверстий можно использовать острое нагреваемое железное устройство.
    3. Гомогенизируйте почву через день, чтобы обеспечить максимальный контакт личинок с почвой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Влага важна для поддержки грибковой инфекции личинок. Для поддержания влажности почвы распыляйте стерильную дистиллированную воду на поверхность почвы, когда это необходимо. Не замачивайте образец почвы в воде.
    4. Ежедневно анализируйте горшки в поисках мертвых насекомых.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ежедневно наблюдайте за оставшимися личинками в колонии на предмет патологических признаков беспозвоночных, чтобы убедиться, что насекомые не инфицированы. В качестве альтернативы контрольные горшки со стерильной почвой могут быть включены в исследование для проверки состояния здоровья личинок насекомых.
    5. Удалить мертвых насекомых и поверхностно стерилизовать их 0,5% гипохлоритом натрия в течение 1 мин. Поместите стерильных насекомых во влажную камеру (относительная влажность ≥ 80%) при 25 ± 1 °C в течение 7 дней, чтобы способствовать экстериоризации энтомопатогенных грибов (микоз).
    6. При микозе собирают конидии с поверхности насекомого. Используйте микробиологическую петлю для размещения конидий на среде PDAC под стереоскопическим микроскопом. В качестве альтернативы поместите целых инфицированных личинок в среду PDAC. Инкубируют культуральные пластины в климатической камере при температуре 25 ± 1 °C и относительной влажности ≥ 80%.
    7. Понаблюдайте за макроморфологией и микроморфологией грибковых колоний на пластинах, чтобы подтвердить идентичность EPF. Повторное культивирование на PDAC до получения чистых грибковых колоний.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте ключи описания, представленные ниже на этапе 3, для идентификации колоний EPF.

3. Идентификация EPF (Metarhizium spp. и Beauveria spp.)

  1. Проанализировать макроморфологические характеристики грибковых культур на пластинах (т.е. поверхность и реверс колоний, их форму, край, скорость роста, цвет, текстуру, диффузионный пигмент, экссудаты и воздушные конидии) через 14 дней при 25 ± 1 °C и относительной влажности ≥ 80%.
  2. Перенос воздушных конидий в скользящие культуры (метод микрокультуры)16 в течение 3 суток при 25 ± 1 °C и относительной влажности ≥ 80% и окрашивание лактофеноловым синим цветом для наблюдения микроскопических особенностей (т.е. расположения конидий, конидиофоров, формы и размера конидий)17,18,19,20.
  3. Наблюдайте за микроскопическими грибковыми структурами в 400 раз с помощью оптического микроскопа для подтверждения идентификации EPF.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Морфологические ключи для EPF описаны в отчетах Bischoff et al., Rehner et al., Seifert et al. и Humber 17,18,19,20. Макро- и микроморфология колоний грибов являются наиболее частыми критериями, используемыми для идентификации нитевидных грибов на уровне рода. В зависимости от рода EPF эти морфологические характеристики будут меняться. Humber20 представляет собой идентификационный ключ к основным родам грибковых энтомопатогенов. Например, колонии Metarhizium spp. обычно круглые, порошкообразные, с различными оттенками зеленого и могут представлять экссудат. Микроскопически эти колонии имеют конидиогенные клетки, апикальные на широко разветвленных, плотно переплетенных конидиофорах, образующих компактный гимений, и цилиндрические к эллипсоидным конидиям в параллельных цепочках, образующих колонны или пластинчатые массы. Колонии Beauveria spp. обычно белые, порошкообразные или хлопкообразные. Они демонстрируют конидиогенные клетки с расширенной базальной частью, простирающейся апикально в зигзагообразном направлении. Конидиофоры Beauveria образуют плотные скопления глобусообразных конидий. Молекулярный анализ необходим для идентификации EPF на видовом уровне.
  4. Выполнение молекулярного анализа изолятов для таксономической идентификации на видовом уровне. Для штаммов EPF, выделенных в этом исследовании, а именно Metarhizium spp. и Beauveria spp., выполняют молекулярный анализ на основе отчетов Bischoff et al.17 и Rehner et al.18.
  5. После подтверждения того, что изоляты являются EPF, поместите изоляты в коллекцию грибковых культур. В настоящем исследовании изоляты были помещены в коллекцию энтомопатогенных грибковых культур из Лаборатории микробного контроля (LCM) Федерального сельского университета Рио-де-Жанейро.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В общей сложности 524 образца почвы были взяты с лугов: пастбищ скота (165 образцов), местных тропических лесов (90 образцов), берега озера (42 образца) и культивируемых / пахотных земель (227 образцов) в период с 2015 по 2018 год в штате Рио-де-Жанейро, Бразилия. Подробная информация о географических координатах проб, положительных на EPF, приведена в дополнительной таблице 1.

Из 524 образцов почвы 500 образцов были проанализированы только с использованием среды CTC, а 24 обр...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Естественные и сельскохозяйственные почвенные среды обитания являются типичными средами для EPF22 и отличным природным резервуаром. В настоящем исследовании рассматривались два метода изоляции EPF с использованием приманок от насекомых по сравнению с селективной средой. Первым шагом для изоляции является сбор образцов почвы. Правильное хранение и идентификация образцов почвы имеют решающее значение. Информация о широте, долготе, типе почвы и биоме имеет важное значение для исследований, связанных ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было частично профинансировано Coordenacão de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) из Бразилии, финансовый код 001, Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) (номер проекта E-26/010.001993/2015), и Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) из Бразилии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
АвтоклавPhoenix Luferco9451
Шкаф биобезопасностиAirstream ESCOAC2-4E3
ХлорамфениколSigma-AldrichC0378
Климатические камерыEletrolabEL212/3
CoverslipRBR3871
ЦиклогексимидSigma-AldrichC7698
Дригальский шпательМариенфельд1800024
GPS приложениеГеолокация приложение2.1.2005
Лактофенол синий растворSigma-Aldrich61335
МикроскопZeiss Axio star plus1169 149
Микроскоп камераZeiss Axiocam 105 цвет426555-0000-000
Микроскоп софтверZen lite Zeiss 3.0
Предметное стекло для микроскопаOlenk5-7105-1
МикротрубкаBRANDZ336769-1PAK
Пластины ПетриKasviK30-6015
Наконечник для пипеткиVattenVT-230-200C/VT-230-1000C
PippetteHTL - LabmateproLMP 200 / LMP 1000
Пластиковые горшкиPrafesta descartá veis8314
Полипропиленовые мешкиExtrusa38034273/5561
Картофельная декстроза агарKasviK25-1022
Prism software 9.1.2Графическая площадка
ЛопатаTramontina77907009
Tenebrio mollitorSafariQP98DLZ36
ТиабендазолSigma-AldrichT8904
Tween 80Vetec60REAVET003662
VortexBiomixerQL-901
Дрожжевой экстрактKasviK25-1702

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Roberts, D. W., St. Leger, R. J. Metarhizium spp., cosmopolitan insect-pathogenic fungi: Mycological aspects. Advances in Applied Microbiology. 54, 1-70 (2004).
  2. do Nascimento Silva, J., et al. New cost-effective bioconversion process of palm kernel cake into bioinsecticides based on Beauveria bassiana and Isaria javanica. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (6), 2595-2606 (2018).
  3. Faria, M. R., Wraight, S. P. Mycoinsecticides and Mycoacaricides: A comprehensive list with worldwide coverage and international classification of formulation types. Biological Control. 43 (3), 237-256 (2007).
  4. Vega, F. V. The use of fungal entomopathogens as endophytes in biological control: a review. Applied Mycology. 110 (1), 4-30 (2018).
  5. Sharma, L., et al. Advances in entomopathogen isolation: A case of bacteria and fungi. Microorganisms. 9 (1), 1-28 (2021).
  6. Litwin, A., Nowak, M., Różalska, S. Entomopathogenic fungi: unconventional applications. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology. 19, 23-42 (2020).
  7. Kim, J. C., et al. Tenebrio molitor-mediated entomopathogenic fungal library construction for pest management. Journal of Asia-Pacific Entomology. 21 (1), 196-204 (2018).
  8. Meyling, N., Eilenberg, J. Ocurrence and distribution of soil borne entomopathogenic fungi within a single organic agroecosystem. Agriculture, Ecosystems and Environment. 113 (1), 336-341 (2006).
  9. Fernandes, E. K. K., Keyser, C. A., Rangel, D. E. N., Foster, R. N., Roberts, D. W. CTC medium: A novel dodine-free selective medium for isolating entomopathogenic fungi, especially Metarhizium acridum, from soil. Biological Control. 54 (3), 197-205 (2010).
  10. Ortiz-Urquiza, A., Keyhani, N. O. Molecular genetics of Beuveria bassiana infection of insects. Advantages in Genetics. 94, 165-249 (2016).
  11. Pereira, M. F., Rossi, C. C., Silva, G. C., Rosa, J. N., Bazzolli, M. S. Galleria mellonella as infection model: an in depth look at why it works and practical considerations for successful application. Pathogens and Disease. 78 (8), (2020).
  12. Souza, P. C., et al. Tenebrio molitor (Coleoptera: Tenebrionidae) as an alternative host to study fungal infections. Journal of Microbiological Methods. 118, 182-186 (2015).
  13. Canfora, L., et al. Development of a method for detection and quantification of B. brongniartii and B. bassiana in soil. Scientific Reports. 6, 22933(2016).
  14. Garrido-Jurado, I., et al. Transient endophytic colonization of melon plants by entomopathogenic fungi after foliar application for the control of Bemisia tabaci Gennadius (Hemiptera: Aleyrodidae). Journal of Pest Science. 90, 319-330 (2016).
  15. Sharma, L., Oliveira, I., Torres, L., Marques, G. Entomopathogenic fungi in Portuguese vineyards soils: suggesting a 'Galleria-Tenebrio-bait method' as bait-insects Galleria and Tenebrio significantly underestimate the respective recoveries of Metarhizium (robertsii) and Beauveria (bassiana). MycoKeys. 38, 1-23 (2018).
  16. Riddell, R. W. Permanent stained mycological preparations obtained by slide culture. Mycologia. 42 (2), 265-270 (1950).
  17. Bischoff, J., Rehner, S. A., Humber, R. A. A multilocus phylogeny of the Metarhizium anisopliae lineage. Mycologia. 101 (4), 512-530 (2009).
  18. Rehner, S. A., et al. Phylogeny and systematics of the anamorphic, entomopathogenic genus Beauveria. Mycologia. 103 (5), 1055-1073 (2011).
  19. Seifert, K. A., Gams, W. Anamorphs of Clavicipitaceae, Cordycipitaceae and Ophiocordycipitaceae. The Genera of Hyphomycetes. CBS Biodiversity Series. CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre. Seifert, K. A., Morgan-Jones, G., Gams, W., Kendrick, B. 9, 903-906 (2011).
  20. Humber, R. A. Identification of entomopathogenic fungi. Manual of Techniques in Invertebrate Pathology., 2nd ed. Lacey, L. A. , Academic Press. Washington. 151-187 (2012).
  21. Mesquita, E., et al. Efficacy of a native isolate of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae against larval tick outbreaks under semifield conditions. BioControl. 65 (3), 353-362 (2020).
  22. St Leger, R. J. Studies on adaptations of Metarhizium anisopliae to life in the soil. Journal of Invertebrate Pathology. 98 (3), 271-276 (2008).
  23. Mar, T. T., Suwannarach, N., Lumyong, S. Isolation of entomopathogenic fungi from Nortern Thailand and their production in cereal grains. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 28 (12), 3281-3291 (2012).
  24. Rocha, L. F. N., Inglis, P. W., Humber, R. A., Kipnis, A., Luz, C. Occurrence of Metarhizium spp. in central Brazilian soils. Journal of Basic Microbiology. 53 (3), 251-259 (2013).
  25. Quesada-Moraga, E., Navas-Cortés, J. A., Maranhao, E. A. A., Ortiz-Urquiza, A., Santiago-Álvarez, C. Factors affecting the occurrence and distribution of entomopathogenic fungi in natural and cultivated soils. Mycological Research. 111 (8), 947-966 (2007).
  26. Mora, M. A. E., Rouws, J. R. C., Fraga, M. E. Occurrence of entomopathogenic fungi in atlantic forest soils. Microbiology Discovery. 4 (1), 1-7 (2016).
  27. Goble, T. A., Dames, J. F., Hill, M. P., Moore, S. D.The effects of farming system, habitat type and bait type on the isolation of entomopathogenic fungi from citrus soils in the Eastern Cape Province, South Africa. BioControl. 55 (3), 399-412 (2010).
  28. Medo, J., Cagáň, L. Factors affecting the occurrence of entomopathogenic fungi in soils of Slovakia as revealed using two methods. Biological Control. 59 (2), 200-208 (2011).
  29. Chase, A. R., Osborne, L. S., Ferguson, V. M. Selective isolation of the entomopathogenic fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae from an artificial potting medium. Florida Entomologist. 69, 285-292 (1986).
  30. Liu, Z. Y., Milner, R. J., McRae, C. F., Lutton, G. G. The use of dodine in selective media for the isolation of Metarhizium spp. from soil. Journal of Invertebrate Pathology. 62, 248-251 (1993).
  31. Rangel, D. E. N., Dettenmaier, S. J., Fernandes, E. K. K., Roberts, D. W. Susceptibility of Metarhizium spp. and other entomopathogenic fungi to dodine-based selective media. Biocontrol Science and Technology. 20 (4), 375-389 (2010).
  32. Keller, S., Kessler, P., Schweizer, C. Distribution of insect pathogenic soil fungi in Switzerland with special reference to Beauveria brongniartii and Metharhizium anisopliae. BioControl. 48 (3), 307-319 (2003).
  33. Enkerli, J., Widmer, F., Keller, S. Long-term field persistence of Beauveria brongniartii strains applied as biocontrol agents against European cockchafer larvae in Switzerland. Biological Control. 29 (1), 115-123 (2004).
  34. Imoulan, A., Alaoui, A., El Meziane, A. Natural occurrence of soil-borne entomopathogenic fungi in the Moroccan endemic forest of Argania spinosa and their pathogenicity to Ceratitis capitata. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 27 (11), 2619-2628 (2011).
  35. Keyser, C. A., De Fine Licht, H. H., Steinwender, B. M., Meyling, N. V. Diversity within the entomopathogenic fungal species Metarhizium flavoviride associated with agricultural crops in Denmark. BMC Microbiology. 15 (1), 1-11 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

MetarhiziumBeauveriaCTC

Похожие статьи