Методическая статья

Новый метод оптокинетических испытаний для измерения зрения крыс

DOI:

10.3791/63357

⸱

27 июля 2022 г.

 ,  , 
1Roski Eye Institute, Department of Ophthalmology, Keck School of Medicine, University of Southern California, 2USC Ginsburg Institute for Biomedical Therapeutics, University of Southern California

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Метод поведенческого тестирования на оптокинетический нистагм (ОКН) используется для оценки остроты зрения у грызунов. Здесь демонстрируется простой метод, который может быть легко использован в исследовательских лабораториях для надежной оценки зрительной функции как у нормальных, так и у экспериментальных крыс.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Оптокинетический нистагм (ОКН) — это рефлекторное движение глаз, инициированное движением зрительных стимулов в поле зрения. Движение по отслеживанию головы, связанное с ОКН, обычно используется в качестве меры зрительной функции у грызунов. Для регистрации ответов OKN у нормальных и экспериментальных крыс был разработан простой и недорогой аппарат. В этой конфигурации используются два экрана планшета для отображения визуального стимула OKN, состоящего из высококонтрастных черных и белых полос, сгенерированных с помощью веб-приложения OKN Stripes Visualization, бесплатного программного обеспечения. Крыса помещена в прозрачный держатель из плексигласа, который ограничивает движения так, что голова крысы постоянно обращена к экрану дисплея OKN. Положение держателя для крыс можно изменить, чтобы отрегулировать расстояние между крысой и экраном дисплея. Микрокамера, расположенная над держателем для крыс, используется для записи визуальной активности крысы. Эти записи могут быть использованы для количественной оценки. На основе наличия или отсутствия четкого отслеживания головы можно определить ответы OKN на разных пространственных частотах. Собранные данные демонстрируют новую методику надежного измерения остроты зрения у крыс с нормальной формой и дегенерацией сетчатки.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Когда глаз подвергается длительному зрительному движению во всем поле, в направлении зрительного движения возникает отчетливая картина быстрых и плавных движений глаз и движений головы с низким ускорением, называемая оптокинетическим нистагмом (ОКН)1,2. Неврологический путь ОКН проходит от сетчатки к латеральному коленчатому телу, затылочной доле и хлопьям мозжечка и соединяется сдвигательными нейронами глаза. Повреждение нейронов в любом месте этих нервных путей может привести к изменениям в ответах OKN. Ответ ОКН используется в качестве инструмента для оценки церебральной симметрии, психогенной слепоты и остроты зрения у пациентов 4,5. Острота зрения оценивается путем количественной оценки функциональных реакций, которые могут быть неотъемлемой частью определения успеха лечения и экспериментов, направленных на восстановление зрения, утраченного из-за нейродегенеративных заболеваний 3,6,7. У животных ответы OKN могут быть использованы для точной оценки остроты зрения, что дает исследователям возможность собирать как количественные, так и качественные данные о зрительной функции. У грызунов можно измерить остроту зрения левого и правого глаза независимо исходя из направления вращения полос как по часовой стрелке, так и против часовой стрелки8. Это движение против часовой стрелки и по часовой стрелке подвергает каждый глаз либо носовременному (N-T), либо темпо-назальному (T-N) движению9 соответственно. Стимул T-N приводит к значительно более высокой реакции по сравнению с N-T-стимулом, поскольку грызуны более чувствительны к опасностям, исходящим сзади или сбоку.

Ранее зрительная функция у нормальных лабораторных крыс и крыс с дегенеративной сетчаткой проверялась с использованием различных методов тестирования OKN 6,10,11,12,13. Тем не менее, наблюдаются определенные различия в оценках остроты зрения между различными исследованиями, в том числе и данными, представленными в настоящем исследовании. Эта вариативность в основном объясняется различиями в используемой испытательной установке. Основными факторами могут быть различия в размере тестовой арены и типе используемых визуальных стимулов ОКН 6,10. Стимулы, использованные в этих экспериментах, включают синусоидальные решетки для появления виртуального цилиндра14, взаимозаменяемые вращающиеся цилиндры15 и высококонтрастные (черно-белые) полосы, отображаемые на четырех компьютерных мониторах10. Основными ограничениями, связанными с этими испытательными аппаратами и методами ОКН, являются большие размеры оборудования, перемещение животных на испытательной арене и частые случаи падения животных с испытательной платформы 7,11,12.

Для минимизации вышеуказанных ограничений был разработан новый аппарат для тестирования ОКН на крысах. Этот аппарат сравнительно недорог, доказал свою эффективность, прост в эксплуатации и позволяет оценить зрительную функцию (рис. 1). Аппарат использует два экрана планшета для отображения визуальных стимулов OKN (программное обеспечение для визуализации) на разных пространственных частотах. Микрокамера используется для записи действий животного во время тестирования для последующего анализа данных. С целью создания простого в настройке аппарата OKN в исследовательских лабораториях, эта новая установка представляет собой критически важные изменения в существующем испытательном оборудовании OKN. Используемые здесь стимулы OKN состоят из черных и белых полос с разными пространственными частотами и разными направлениями вращения (слева направо или справа налево). Основным компонентом испытательного оборудования OKN являются два сенсорных экрана планшета (7,9 дюйма), используемые для отображения стимулов OKN (рис. 2). Два регулируемых держателя используются для удержания экранов планшетов в нужном положении. Держатели надежно прикреплены к краю процедурного стола, что позволяет регулировать его высоту и угол. Крысы помещаются в держатель для крыс, который обращен к экранам дисплея. Держатели для крыс изготовлены из прозрачного пластика (полиметилметакрилата) трубки. Держатель крепится к тумбе и металлической подставке для обеспечения устойчивого размещения на процедурном столе. Размер удерживающих трубок варьируется от 4 до 6 дюймов в длину и от 2,5 до 3 дюймов в диаметре, в зависимости от размера используемых крыс. Расстояние между крысой и экраном дисплея регулируется путем изменения положения держателя крысы. Держатель для крыс помогает поддерживать непрерывное нахождение головы крысы по направлению к экранам дисплея и уменьшает ее движения во время испытаний. Микрокамера используется для записи реакции отслеживания головы. К недостаткам этой новой настройки можно отнести разную частоту обновления экрана и возможность оптических иллюзий при использовании узких полос. Тем не менее, их можно рассматривать как распространенные проблемы, связанные с настройкой OKN на компьютере. В дополнение к вышеуказанным проблемам, в текущей конфигурации крысы не тестируются с использованием виртуального цилиндра14 , который влияет на оптимальную реакцию OKN. Новизна этого метода заключается в технике и аппарате, в которых он используется. Этот метод может быть легко установлен в исследовательских лабораториях для надежного измерения остроты зрения у грызунов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры с животными были выполнены в соответствии с экспериментальными рекомендациями, утвержденными региональными властями и принятыми Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Университете Южной Калифорнии (USC), а также в соответствии с Заявлением Ассоциации исследований в области зрения и офтальмологии (ARVO) об использовании животных в офтальмологических исследованиях и Европейской директивой 2010/63/ЕС о защите животных, используемых в научных целях.

Примечание: Крысы, использованные в этом исследовании, являются крысами с пигментной дегенерацией сетчатки Королевского колледжа хирургов (RCS) и крысы Лонг Эванса (LE). На рисунке 3 показана схематическая иллюстрация, показывающая различные этапы тестирования и анализа OKN.

1. Порядок действий

  1. Подготовка к настройке
    1. Держать крысу в клетке и в течение 30 минут в испытательном помещении с выключенным светом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это помогает свести к минимуму напряжение, возникающее при транспортировке, и обеспечивает равномерное освещение для всех экспериментов.
    2. Установите положение экранов планшетов друг к другу под углом 155°, чтобы отобразить веб-приложение визуализации OKN Stripes.
    3. Поместите держатель для крыс в центре двух экранов планшетов на расстоянии 4,5 дюйма от центра.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом положении голова крысы будет находиться примерно в 3,5 дюймах от экрана дисплея.
    4. Нажмите на веб-приложение OKN Stripes Visualization на рабочем столе планшета, чтобы отобразить визуальные стимулы (черные и белые полосы), начиная с наименьшей пространственной частоты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используются пространственные частоты 0,08, 0,15, 0,2, 0,24, 0,28, 0,33, 0,38 циклов на градус (c/d), начиная с самой низкой пространственной частоты (0,08c/d) и переходя к более высоким пространственным частотам (до 0,38 c/d). На каждой пространственной частоте крыс проверяют как по часовой стрелке, так и против часовой стрелки при вращении полос (по 1 мин каждая).
  2. Методика тестирования ОКН
    1. Выберите держатель для крыс подходящего размера.
    2. Поднесите крысу к отверстию держателя для крыс и осторожно направьте крысу внутрь.
    3. Дайте крысе осесть внутри держателя (1-2 минуты) перед тестированием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При правильном обращении в большинстве случаев можно поддерживать крысу внутри держателя; При необходимости держатель для крыс держат высоко (до 2 футов над столом) в течение нескольких секунд, пока крыса не сядет. Установлено, что боязнь высоты снижает склонность крысы спускаться вниз с крысодержателя. Дополнительное время (1-2 минуты) дается на то, чтобы крыса успокоилась, если это необходимо.
    4. Вставьте тумбу крысодержателя в металлическую подставку для ее устойчивого размещения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта настройка позволяет изменять расстояние обзора крысы от экрана планшета.
    5. Включите камеру, чтобы начать запись видео.
    6. Нажмите на веб-приложение OKN Stripes Visualization с рабочего стола или экрана планшета и запустите программу.
    7. Запустите стимулы OKN слева направо или справа налево.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вращение полос по часовой стрелке активирует левый глаз, тогда как вращение против часовой стрелки активирует правый глаз. Начальное направление вращения было выбрано случайным образом, чтобы избежать потенциального привыкания.
    8. Понаблюдайте за поведением крысы по отслеживанию головы.
    9. Начните тестирование с наименьшей пространственной частоты (0,08 c/d), а затем увеличивайте пространственную частоту в ступенчатом (по возрастанию) порядке.
    10. Обратите внимание на наличие или отсутствие ответов OKN.
    11. Продолжайте тестирование, период покоя между различными пространственными частотами не дается.
    12. Остановите видеозапись после завершения всех пространственных частот и сохраните данные, используя идентификационный номер крысы.
    13. Выньте крысу из держателя и поместите ее в клетку примерно на 30 минут отдыха между последовательными испытаниями.
    14. Повторите тесты три раза для каждой крысы.

2. Анализ данных

  1. Просмотрите записанное видео и определите остроту зрения каждой крысы, найдя пространственные частоты, на которых крыса реагировала.
  2. Записывайте все ответы (наличие или отсутствие четкого отслеживания головы) в таблицу.
  3. Найдите наивысшую пространственную частоту, на которую крыса реагировала на три теста. Это считается конечной остротой зрения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку измерение остроты зрения является субъективным, данные будут оцениваться двумя независимыми сотрудниками исследования для подтверждения оценки остроты зрения для каждой крысы12. Результаты перепроверяются до тех пор, пока не будет согласован окончательный счет. Положительный ответ OKN определяется как наличие четкой и устойчивой активности по отслеживанию головы. Случайное отслеживание движения головы (не связанное с визуальными стимулами OKN) или отсутствие каких-либо движений головой считается негативной реакцией OKN.
  4. Проведите статистический анализ для сравнения групп или между двумя глазами (левый глаз против правого глаза).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Просмотрите видеозаписи, чтобы уточнить, какие положительные или отрицательные ответы даются по мере необходимости.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Тестирование OKN проводилось с использованием крыс Королевского колледжа хирургов (RCS) с дегенеративной сетчаткой (RD) и нормальных крыс Long Evans (LE) соответствующего возраста. Крысы LE (n = 4) были использованы для установления исходных данных для определения показателей остроты зрения у нормальных крыс с использованием новой установки. Статистический анализ проводили с использованием Microsoft excel (среднее ± стандартное отклонение). Крысы LE продемонстрировали надежное отслеживание головы на пространственных част...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ОКН — это рефлекторное движение зуба пилы глаз в ответ на дрейфующий стимул, который используется в качестве инструмента для оценки остроты зрения у людей3. У животных, включая приматов и грызунов, тестирование ОКН используется в качестве количественного измерения зрительной функции. В настоящем исследовании описывается новый, недорогой аппарат OKN, который может быть легко установлен в исследовательских лабораториях для поведенческого тестирования OKN на крысах. ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы сообщить.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано грантами CIRM (Калифорнийский институт регенеративной медицины) (DISC1-09912 PI-Thomas, DR3-07438-PI-Humayun), неограниченным грантом для отделения офтальмологии от Research to Prevent Blindness, Нью-Йорк, штат Нью-Йорк, и поддержкой Bright Focus Foundation (M2016186, Thomas, PI). Исследование, представленное в этой публикации, было поддержано Национальным институтом глаза Национальных институтов здравоохранения в рамках премии No P30EY029220.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
iPad MiniAppleA1489Два iPad Mini используются для отображения программного обеспечения для визуализации OKN Stripes.
Микрокамера/микрокамера LanonB097H6WWDSМикрокамера используется для записи эксперимента. Крепление для микрокамеры подключается к столу и удерживает камеру лицом к крысе. Реакция отслеживания головы записывается и оценивается на различных расстояниях, пространственных частотах и направлениях.
Трубка из плексигласа / держатель для крысЛучшие акриловые B07KMF31MCТрубка из плексигласа используется для удержания крысы с открытой головой на время эксперимента. Трубка прикрепляется к другой вертикальной трубке из плексигласа для стабилизации держателя крысы во время эксперимента. Весь аппарат был спроектирован и изготовлен в лаборатории.
Насадка для трубки из плексигласаЛучшие акриловые B07KMF31MCЭта насадка удерживает держатель для крысы перед экранами iPad и позволяет манипулировать расстоянием между крысой и iPad.
Держатели для экранаKabconB08JLRPKQ1Два держателя экрана используются для удержания iPad для отображения программного обеспечения для визуализации OKN Stripes для крысы.
Веб-приложение для визуализации OKNStripes Лицензия MIT (MIT) Copyright (c) 2016 Антон Якушинhttps://antonyakushin.github.io/okn-stripes-visualization/Это приложение представляет собой свободно доступное программное приложение для отображения визуальных стимулов (черных и белых полос) на разных частотах

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mustari, M. J., Ono, S. Optokinetic eye movements. Encyclopedia of Neuroscience. , Academic Press. 285-293 (2009).
  2. Gottlob, I. Ups and downs of optokinetic nystagmus. British Journal of Ophthalmology. 84, 445-447 (2000).
  3. Wester, S. T., Rizzo, J. F., Balkwill, M. D., Wall, C. Optokinetic nystagmus as a measure of visual function in severely visually impaired patients. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (10), 4542-4548 (2007).
  4. Daroff, R., Aminoff, M. Encyclopedia of the Neurological Sciences. , Elsevier, Academic Press. (2014).
  5. Squire, L., et al. Fundamental Neuroscience. , Elsevier, Academic Press. Amsterdam, Boston. (2008).
  6. Thomas, B. B., Seiler, M. J., Sadda, S. R., Coffey, P. J., Aramant, R. B. Optokinetic test to evaluate visual acuity of each eye independently. Journal of Neuroscience Methods. 138 (1-2), 7-13 (2004).
  7. Cahill, H., Nathans, J. The optokinetic reflex as a tool for quantitative analyses of nervous system function in mice: Application to genetic and drug-induced variation. PLOS One. 3 (4), 2055(2008).
  8. Segura, F., et al. Development of optokinetic tracking software for objective evaluation of visual function in rodents. Scientific Reports. 8, 10009(2018).
  9. Lev-Ari, T., Katz, H., Lustig, A., Katzir, G. Visual acuity and optokinetic directionality in the common chameleon (Chamaeleo chamaeleon). , Available from: https://www.semanticscholar.org/paper/Visual-Acuity-and-Optokinetic-Directionality-in-the-Lev-Ari-Katz/7bae131729f31f005cf64516ad7285904363c2e9 (2017).
  10. Thomas, B. B., Shi, D., Khine, K., Kim, L. A., Sadda, S. R. Modulatory influence of stimulus parameters on optokinetic head-tracking response. Neuroscience Letters. 479 (2), 92-96 (2010).
  11. Shi, D. S., et al. Characterization of optokinetic response in normal and retinal degenerate rats and mice using a computer-based testing apparatus. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (13), 4422(2008).
  12. Thomas, B. B., et al. Co-grafts of human embryonic stem cell derived retina organoids and retinal pigment epithelium for retinal reconstruction in immunodeficient retinal degenerate royal college of surgeons rats. Frontiers in Neuroscience. 15, 752958(2021).
  13. Thomas, B. B., et al. A new immunodeficient retinal dystrophic rat model for transplantation studies using human-derived cells. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 256 (11), 2113-2125 (2018).
  14. Prusky, G. T., Alam, N. M., Beekman, S., Douglas, R. M. Rapid quantification of adult and developing mouse spatial vision using a virtual optomotor system. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (12), 4611-4616 (2004).
  15. Cameron, D., et al. The optokinetic response as a quantitative measure of visual acuity in zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (80), e50832(2013).
  16. Tabata, H., Shimizu, N., Wada, Y., Miura, K., Kawano, K. Initiation of the optokinetic response (OKR) in mice. Journal of Vision. 10 (1), 13(2010).
  17. Huang, Y. -Y., Neuhauss, S. C. F. The optokinetic response in zebrafish and its applications. Frontiers in Bioscience: A Journal and Virtual Library. 13, 1899-1916 (2008).
  18. Sirkin, D. W., Hess, B. J., Precht, W. Optokinetic nystagmus in albino rats depends on stimulus pattern. Experimental Brain Research. 61 (1), 218-221 (1985).
  19. Dietrich, M., et al. Using optical coherence tomography and optokinetic response as structural and functional visual system readouts in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (143), e58571(2019).
  20. Rajendran Nair, D. S., et al. Long-term transplant effects of iPSC-RPE monolayer in immunodeficient RCS rats. Cells. 10 (11), 2951(2021).
  21. Kretschmer, F., Sajgo, S., Kretschmer, V., Badea, T. C. A system to measure the Optokinetic and optomotor response in mice. Journal of Neuroscience Methods. 256, 91-105 (2015).
  22. Lin, T. -C., et al. Assessment of safety and functional efficacy of stem cell-based therapeutic approaches using retinal degenerative animal models. Stem Cells International. 2017, 9428176(2017).
  23. Ryals, R. C., et al. Long-term characterization of retinal degeneration in Royal College of Surgeons Rats using spectral-domain optical coherence tomography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (3), 1378-1386 (2017).
  24. Di Pierdomenico, J., et al. Early events in retinal degeneration caused by rhodopsin mutation or pigment epithelium malfunction: Differences and similarities. Frontiers in Neuroanatomy. 11, 14(2017).
  25. McGill, T. J., Douglas, R. M., Lund, R. D., Prusky, G. T. Quantification of spatial vision in the Royal College of Surgeons Rat. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (3), 932-936 (2004).
  26. Hetherington, L., Benn, M., Coffey, P., Lund, R. Sensory capacity of the Royal College of Surgeons rat. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41, 3979-3983 (2000).
  27. Sauvé, Y., Pinilla, I., Lund, R. D. Partial preservation of rod and cone ERG function following subretinal injection of ARPE-19 cells in RCS rats. Vision Research. 46 (8), 1459-1472 (2006).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Видео скоро будет доступно

Похожие статьи