Одновременная визуализация динамики сшитых и одиночных микротрубочек in vitro методом TIRF-микроскопии

Nandini Mani; Michelle F. Marchan; Radhika Subramanian

doi:10.3791/63377

Методическая статья

Одновременная визуализация динамики сшитых и одиночных микротрубочек in vitro методом TIRF-микроскопии

DOI:

10.3791/63377

⸱

18 февраля 2022 г.

Nandini Mani^*¹^,² , Michelle F. Marchan^*¹ , Radhika Subramanian¹^,²

¹Molecular Biology, Massachusetts General Hospital, ²Department of Genetics, Harvard Medical School

^* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь представлен анализ восстановления in vitro на основе микроскопии TIRF для одновременной количественной оценки и сравнения динамики двух популяций микротрубочек. Описан способ одновременного просмотра коллективной активности нескольких микротрубочек-ассоциированных белков на сшитых пучках микротрубочек и одиночных микротрубочек.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Микротрубочки представляют собой полимеры гетеродимеров αβ-тубулина, которые организуются в различные структуры в клетках. Архитектуры и сети на основе микротрубочек часто содержат подмножества массивов микротрубочек, которые различаются по своим динамическим свойствам. Например, в делящихся клетках стабильные пучки сшитых микротрубочек сосуществуют в непосредственной близости от динамических несшитых микротрубочек. Исследования восстановления in vitro на основе TIRF-микроскопии позволяют одновременно визуализировать динамику этих различных массивов микротрубочек. В этом анализе камера визуализации собирается с поверхностно-иммобилизованными микротрубочками, которые либо присутствуют в виде одиночных нитей, либо организованы в сшитые пучки. Введение тубулина, нуклеотидов и белковых регуляторов позволяет непосредственно визуализировать ассоциированные белки и динамические свойства одиночных и сшитых микротрубочек. Кроме того, изменения, которые происходят, когда динамические одиночные микротрубочки организуются в пучки, могут отслеживаться в режиме реального времени. Описанный здесь способ позволяет проводить систематическую оценку активности и локализации отдельных белков, а также синергетических эффектов белковых регуляторов на два разных подмножества микротрубочек в идентичных экспериментальных условиях, тем самым обеспечивая механистические идеи, недоступные другим методам.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Микротрубочки представляют собой биополимеры, которые образуют структурные каркасы, необходимые для нескольких клеточных процессов, начиная от внутриклеточного транспорта и позиционирования органелл до деления и удлинения клеток. Для выполнения этих разнообразных функций отдельные микротрубочки организованы в массивы размером с микрон, такие как митотические веретена, цилиарные аксонемы, пучки нейронов, межфазные массивы и растительные корковые массивы. Вездесущим архитектурным мотивом, найденным в этих структурах, является пучок микротрубочек, сшитых по их ^длине1. Интригующей особенностью нескольких структур на основе микротрубочек является со....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовьте реагенты

Подготовьте буферы и реагенты, как показано в таблице 1 и таблице 2. Во время эксперимента держите все растворы на льду, если не указано иное.

Решение	Компоненты		Рекомендуемая продолжительность хранения	Примечания
5X BRB80	400 мМ K-PIPES, 5 мМ _MgCl2, 5 мМ EGTA, рН 6,8 с KOH, фильтр стерил....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эксперимент, описанный выше, проводили с использованием 647 нм флуорофор-меченых биотинилированных микротрубочек, 560 нм флуорофор-меченых небиотинилированных микротрубочек и 560 нм флуорофор-меченой растворимой тубулиновой смеси. Микротрубочки были сшиты сшиваемым белком PRC1 (меченым GFP). После получения поверхностно-иммобилизованных пучков и одиночных микротрубочек (этап 5.11) камеру визуализации устанавливали на масляный объектив TIRF 100X 1.49 NA и рассматривали в флуоресцентных каналах 560 нм и 647 нм. Одиночные м.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Описанный здесь эксперимент значительно расширяет сферу применения и сложность обычных анализов восстановления микротрубочек, которые традиционно выполняются на одиночных микротрубочках или на одном типе массива. Текущий анализ обеспечивает метод одновременной количественной оценки и сравнения регуляторной активности MAP на двух популяциях, а именно на одиночных микротрубочках и сшитых пучках. Кроме того, этот анализ позволяет исследовать два типа пучков: те, которые предварительно сформированы из стабильных семян до нач.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантом NIH (No 1DP2GM126894-01), а также средствами Pew Charitable Trusts и Smith Family Foundation для R.S. Авторы благодарят доктора Шуо Цзяна за его вклад в разработку и оптимизацию протоколов.

....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
Имя	Компания	Каталожный номер
(±)-6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-карбоновая кислота (Тролокс)	Sigma Aldrich	238813
1,4-пиперазиндитансульфоновая кислота (PIPES)	Sigma Aldrich	P6757
18x18 мм #1.5 покровные стекла	Электронная микроскопия Науки	63787
2-меркаптоэтанол (BME)	Sigma Aldrich	M-6250
24x60 мм #1.5 покровные стекла	Электронная микроскопия Науки	63793
405/488/560/647 нм Лазер Quad Band	Chroma	TRF89901-NK
Ацетон	Sigma Aldrich	320110
Аденозин 5'-трифосфат динатриевой соли гидрат (АТФ)	Sigma Aldrich	A7699-5G
Avidin, NeutrAvidin® Биотин-связывающий белок (молекулярные зонды®)	Thermo Fischer Scientific	A2666
Ультразвуковой аппарат для ванны: Branson 2800 Cleaner
Beckman Coulter, 11 x 34 мм	Beckman-Coulter
Толстостенные трубки Beckman Coulter из поликарбоната, 8 x 34 мм	Beckman-Coulter
Biotin-PEG-SVA, MW 5,000	Laysan Bio	#Biotin-PEG-SVA-5000
Бычья сыворотка альбумина (BSA)	Sigma Aldrich	2905
Каталаза	Sigma Aldrich	C40
Corning LSE Мини-микроцентрифуга, AC100-240V	Corning	6670
Деликатные салфетки	Kimtech	34120
Дитиотреитол (DTT)	GoldBio	DTT10
Эмиссионный фильтр	Chroma	ET610/75m
Этанол (200-проба)	Decon Labs	2705
Этиленгликоль тетрауксусная кислота (EGTA)	Sigma Aldrich	3777
Глюкозооксидаза	Sigma Aldrich	G2133
GMPCPP	Jena Bioscience	NU-405
Гуанозин 5'-трифосфат натрия соль гидрат (ГТФ)	Sigma Aldrich	G8877
Hellmanex III моющее средство	Sigma Aldrich	Z805939
Иммерсионное масло, тип A	Fisher Scientific	77010
Каппа-казеин	Sigma Aldrich	C0406
Ланолин	Fisher	Scientific S25376
Салфетка для чистки линз	ThorLabs	MC-5
Хлорид магния (MgCl₂)	Sigma Aldrich	M9272
Метилцеллюлоза	Sigma Aldrich	M0512
Microfuge 16 настольная центрифуга	Beckman-Coulter	A46474
Предметные стекла для микроскопа, алмазно-белое стекло, 25 x 75 мм, 90 градусов; Кромки земли, БЕЛЫЙ матовый	глобус Scientific	1380-50 Вт
mPEG-сукцинимидил валерат, МВт 5,000	Laysan Bio	#NH2-PEG-VA-5K
Оптима&трейд; Настольная ультрацентрифуга Max-XP	Beckman-Coulter
Парафин	Fisher Scientific	P31-500
PELCO Reverse (самозакрывающийся), тонкий пинцет	Ted Pella	5377-NM
Petrolatum, White	Fisher Scientific	18-605-050
Плазменный очиститель, 115V	Harrick Plasma	PDC-001
Гидроксид калия (KOH)	Sigma Aldrich	221473
Бикарбонат натрия	Sigma Aldrich	S6014
сахароза	Sigma Aldrich	S7903
Термолок 1-позиционная сухая тепловая баня	США Scientific	2510-1101
Термолок блок для пробирок объемом 1,5 и 2,0 мл	США Scientific	2520-0000
Thermo Scientific&торговля; Пирс и трейд; Bond-Breaker и торговля; Раствор TCEP, нейтральный pH; 500mM	Thermo Fischer Scientific	PI-77720
TIRF 100X NA 1.49 Масляный объектив	Nikon	CFI Apochromat TIRF 100XC Масляный
микроскоп TIRF	Nikon	Eclipse Ti
TLA 120.1 ротор	Beckman-Coulter
Ротор TLA 120.2	Beckman-Coulter
Белок тубулин (>99% чистоты): свиной мозг	Цитоскелет	T240
Тубулин Белок (биотин): свиной мозг	Цитоскелет	T333P Тубулин
белок (флуоресцентный HiLyte 647): свиной мозг	Цитоскелет	TL670M
Тубулин белок (X-родамин): бычий мозг	Цитоскелет	TL620M
VECTABOND® Реактив, вектор адгезии тканевого сечения	Biolabs	SP-1800-7
VWR® Инкубатор индивидуального размера, 120 В, 50/60 Гц, 0,6 А	VWR	97025-630

Поликарбонатные толстостенные трубки Branson CPX2800H 343778343776393315362224357656

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Subramanian, R., Kapoor, T. M. Building complexity: insights into self-organized assembly of microtubule-based architectures. Developmental Cell. 23 (5), 874-885 (2012).
Baas, P. W., Rao, A. N., Matamoros, A. J., Leo, L. Stability properties of neuronal mic....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Одновременная визуализация динамики сшитых и одиночных микротрубочек in vitro методом TIRF-микроскопии

В этой статье

Краткое содержание

Аннотация

Введение

Протокол

Результаты

Обсуждение

Раскрытие информации

Благодарности

Материалы

Ссылки

Перепечатки и разрешения

Теги

Похожие статьи