Method Article

Одновременная визуализация динамики сшитых и одиночных микротрубочек in vitro методом TIRF-микроскопии

DOI:

10.3791/63377

⸱

February 18th, 2022

 ,  , 
1Molecular Biology, Massachusetts General Hospital, 2Department of Genetics, Harvard Medical School

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь представлен анализ восстановления in vitro на основе микроскопии TIRF для одновременной количественной оценки и сравнения динамики двух популяций микротрубочек. Описан способ одновременного просмотра коллективной активности нескольких микротрубочек-ассоциированных белков на сшитых пучках микротрубочек и одиночных микротрубочек.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Микротрубочки представляют собой полимеры гетеродимеров αβ-тубулина, которые организуются в различные структуры в клетках. Архитектуры и сети на основе микротрубочек часто содержат подмножества массивов микротрубочек, которые различаются по своим динамическим свойствам. Например, в делящихся клетках стабильные пучки сшитых микротрубочек сосуществуют в непосредственной близости от динамических несшитых микротрубочек. Исследования восстановления in vitro на основе TIRF-микроскопии позволяют одновременно визуализировать динамику этих различных массивов микротрубочек. В этом анализе камера визуализации собирается с поверхностно-иммобилизованными микротрубочками, которые либо присутствуют в виде одиночных нитей, либо организованы в сшитые пучки. Введение тубулина, нуклеотидов и белковых регуляторов позволяет непосредственно визуализировать ассоциированные белки и динамические свойства одиночных и сшитых микротрубочек. Кроме того, изменения, которые происходят, когда динамические одиночные микротрубочки организуются в пучки, могут отслеживаться в режиме реального времени. Описанный здесь способ позволяет проводить систематическую оценку активности и локализации отдельных белков, а также синергетических эффектов белковых регуляторов на два разных подмножества микротрубочек в идентичных экспериментальных условиях, тем самым обеспечивая механистические идеи, недоступные другим методам.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Микротрубочки представляют собой биополимеры, которые образуют структурные каркасы, необходимые для нескольких клеточных процессов, начиная от внутриклеточного транспорта и позиционирования органелл до деления и удлинения клеток. Для выполнения этих разнообразных функций отдельные микротрубочки организованы в массивы размером с микрон, такие как митотические веретена, цилиарные аксонемы, пучки нейронов, межфазные массивы и растительные корковые массивы. Вездесущим архитектурным мотивом, найденным в этих структурах, является пучок микротрубочек, сшитых по их длине1. Интригующей особенностью нескольких структур на основе микротрубочек является сосуществование пучковых микротрубочек и несшитых одиночных микротрубочек в непосредственной пространственной близости. Эти субпопуляции микротрубочек могут демонстрировать резко отличающуюся динамику полимеризации друг от друга, как это необходимо для их правильного функционирования2,3,4,5. Например, внутри митотического шпинделя стабильные сшитые пучки и динамические одиночные микротрубочки присутствуют в микронной области в центре ячейки6. Таким образом, изучение того, как определяются динамические свойства сосуществующих популяций микротрубочек, имеет решающее значение для понимания сборки и функции структур на основе микротрубочек.

Микротрубочки представляют собой динамические полимеры, которые циклически переключаются между фазами полимеризации и деполимеризации, переключаясь между двумя фазами в событиях, известных как катастрофа и спасение7. Динамика клеточных микротрубочек регулируется мириадами микротрубочек,ассоциированных белков (MAP), которые модулируют скорость полимеризации и деполимеризации микротрубочек и частоты катастроф и спасательных событий. Исследовать активность MAP на пространственно проксимальных массивах в клетках сложно из-за ограничений пространственного разрешения в световой микроскопии, особенно в областях с высокой плотностью микротрубочек. Более того, наличие нескольких MAP в одной и той же клеточной области затрудняет интерпретацию клеточных биологических исследований. Анализы восстановления in vitro, выполняемые в сочетании с микроскопией полной флуоресценции внутреннего отражения (TIRF), обходят проблемы изучения механизмов, с помощью которых конкретные подмножества MAP регулируют динамику проксимальных клеточных микротрубочек. Здесь исследуется динамика собранных in vitro микротрубочек в присутствии одного или нескольких рекомбинантных MAP в контролируемых условиях8,9,10. Однако обычные анализы восстановления обычно выполняются на одиночных микротрубочках или на одном типе массива, что исключает визуализацию сосуществующих популяций.

Здесь мы представляем анализы восстановления in vitro , которые позволяют одновременно визуализировать две популяции микротрубочек в одних и тех же условиях решения11. Описан способ одновременного просмотра коллективной активности нескольких MAP на одиночных микротрубочках и на пучках микротрубочек, сшитых митотическим веретенно-ассоциированным белком PRC1. Белок PRC1 преимущественно связывается при перекрытии между антипараллельными микротрубочками, сшивая их9. Вкратце, этот протокол состоит из следующих этапов: (i) подготовка исходных растворов и реагентов, (ii) очистка и обработка поверхности покровных пластин, используемых для создания камеры визуализации для микроскопических экспериментов, (iii) подготовка стабильных «семян» микротрубочек, из которых полимеризация инициируется в ходе эксперимента, (iv) спецификация настроек микроскопа TIRF для визуализации динамики микротрубочек, (v) иммобилизация семян микротрубочек и генерация сшитых пучков микротрубочек в камере визуализации и (vi) визуализация динамики микротрубочек в камере визуализации с помощью микроскопии TIRF при добавлении растворимого тубулина, MAP и нуклеотидов. Эти анализы позволяют качественно оценить и количественно изучить локализацию MAP и их влияние на динамику двух популяций микротрубочек. Кроме того, они облегчают оценку синергетического воздействия нескольких MAP на эти популяции микротрубочек в широком диапазоне экспериментальных условий.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовьте реагенты

  1. Подготовьте буферы и реагенты, как показано в таблице 1 и таблице 2. Во время эксперимента держите все растворы на льду, если не указано иное.
РешениеКомпонентыРекомендуемая продолжительность храненияПримечания
5X BRB80400 мМ K-PIPES, 5 мМ MgCl2, 5 мМ EGTA, рН 6,8 с KOH, фильтр стерилизуетсядо 2 летХранить при температуре 4 °C
1X BRB8080 мМ K-PIPES, 1 мМ MgCl2, 1 мМ EGTA, pH 6,8до 2 летХранить при температуре 4 °C
БРБ80-ДТТ1X BRB80, 1 мМ DTTдо 2 дней
Буфер анализа80 мМ K-PIPES, 3 мМ MgCl2, 1 мМ EGTA, рН 6,8, 5% сахарозы (OR 1X BRB80, 5% сахарозы, 2 мМ MgCl2)до 1 годаХранить при температуре 4 °C
Главный буфер (МБ)Буфер анализа, 5 мМ TCEP1 неделяПодготовьтесь в день эксперимента; Разделите на две трубки: MB-теплый при комнатной температуре и MB-холодный на льду; включают 1 мМ DTT при использовании флуоресцентных красителей
Главный буфер с метилцеллюлозой (MBMC)1X BRB80, 0,8% метилцеллюлоза, 5 мМ TCEP, 5 мМ MgCl2 1 неделяПодготовьтесь в день эксперимента; включают 1 мМ DTT при использовании флуоресцентных красителей
Буфер разбавления белка (DB)MB, 1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (BSA), 1 мкМ АТФ1 день, на льдуПодготовьтесь в день эксперимента; включают 1 мМ DTT при использовании флуоресцентных красителей
Кислородопоглощающая смесь (OSM)MB, 389 мкг/мл каталазы, 4,44 мг/мл глюкозооксидазы, 15,9 мМ 2-меркаптоэтанола (BME)1 день, на льдуПодготовьтесь в день эксперимента
Финал очистки кислорода (OSF)MB, 350 мкг/мл каталазы, 4 мг/мл глюкозооксидазы, 14,3 мМ BME, 15 мг/мл глюкозыиспользовать в течение 30 минПодготовьте непосредственно перед использованием, добавив 1 мкл глюкозы к 9 мкл OSM

Таблица 1: Список буферов, используемых в этом протоколе, и их компонентов. В столбце «Рекомендуемая продолжительность хранения» приведены рекомендации о том, насколько заблаговременно можно подготовить каждый буфер.

РеагентКонцентрация при храненииРастворитель для храненияТемпература храненияРабочая концентрацияКонечная концентрацияРекомендуемая продолжительность храненияПримечания
Нейтравидин (NA)5 мг/мл1X BRB80-80°С0,2 мг/мл0,2 мг/млдо 1 годаИспользуется для иммобилизации микротрубочек через связь биотин-нейтравидин-биотин; хранить в небольших аликвотах
Каппа-казеин (KC)5 мг/мл1X BRB80-80°С0,5 мг/мл0,5 мг/млдо 2 летИспользуется для блокировки поверхности камеры визуализации; Хранить в небольших аликвотах; В день эксперимента отложите небольшой объем в сторону при комнатной температуре
Бычий сывороточный альбумин (BSA)50 мг/мл1X BRB80-20°С1 мг/мл (в БД)Н/Ддо 2 летхранить в небольших аликвотах
Каталазы3,5 мг/мл1X BRB80-80°С350 мкг/мл (в OSF)35 мкг/млдо 2 леткомпонент кислородопоглощающей смеси; хранить в небольших аликвотах
Глюкозооксидаза40 мг/мл1X BRB80-80°С4 мг/мл (в OSF)0,4 мг/млдо 2 леткомпонент кислородопоглощающей смеси; хранить в небольших аликвотах
ТубулинЛиофилизированныйН/Д4°С10 мг/мл2,12 мг/мл (в смеси тубулина)до 1 годаКак только тубулин окажется в растворе, держите его холодным, чтобы избежать полимеризации.
Аденозинтрифосфат (АТФ)100 мМсверхчистая вода-20°С10 мМ1 мМ6 месяцевПриготовьте раствор в фильтрованной стерилизованной воде, отрегулируйте рН до ~7,0 и заморозьте небольшими аликвотами.
Гуанозинтрифосфат (ГТФ)100 мМсверхчистая вода-20°С10 мМ1,29 мМ (в тубулиновой смеси)6 месяцевПриготовьте раствор в фильтрованной стерилизованной воде, отрегулируйте рН до ~7,0 и заморозьте небольшими аликвотами.
Гуанозин-5'-[(α,β)-метилено]трифосфат (GMPCPP)10 мМсверхчистая вода-20°С10 мкМ0.5 мкМ6 месяцев
Дитиотрейтол (DTT)1 Мстерильная вода-20°С1 мМН/Ддо 2 лет
Трис(2-карбоксиэтил)фосфин (TCEP)0.5 млнфильтрованно-стерилизованная водаКомнатная температура5 мМН/Ддо 2 лет
Метилцеллюлоза1%стерильная водаКомнатная температура0,8% (в МБМК)0,21% (в смеси тубулина)до 1 годаРастворите метилцеллюлозу, медленно добавляя ее в почти кипящую воду. Дайте остыть, постоянно помешивая.
Бета-меркаптоэтанол (BME)143 мМстерильная водаКомнатная температура14,3 мМ (в OSF)1,43 мМдо 5 лет143 мМ - разбавление запаса BME 1:100
Глюкоза150 мг/мл1X BRB80-80°С15 мг/мл (в OSF)1,5 мг/млдо 2 летДобавление в OSM непосредственно перед использованием
(±)-6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-карбоновая кислота (Тролокс)10мМ1X BRB80-80°С10 мМ1 мМдо 1 годаНе растворяется полностью. Добавьте немного NaOH, перемешайте в течение ~ 4 часов и фильтруйте стерилизовать перед использованием
мПЕГ-Сукцинимидил валерат, МВт 5,000порошокН/Д-20°С333 мг/мл
(в 0,1 М бикарбоната натрия)		324 мг/мл
(в 0,1 М бикарбоната натрия)		6 месяцевПриготовьте ~34 мг аликвоты, пометив каждый тюбик точным весом порошка. Пропустите газообразный азот над твердым веществом, запечатайте трубки с парапленкой и храните при -20°C в контейнере с осушителем.
Биотин-ПЭГ-СВА, МВт 5,000порошокН/Д-20°С111 мг/мл
(в 0,1 М бикарбоната натрия)		3,24 мг/мл (в 0,1 М бикарбоната натрия)6 месяцевПриготовьте ~3 мг аликвот, пометив каждый тюбик точным весом порошка. Пропустите газообразный азот над твердым веществом, запечатайте трубки с парапленкой и храните при -20°C в контейнере с осушителем.

Таблица 2: Список реагентов, используемых в данном протоколе. Включены рекомендуемые условия хранения и концентрации, рабочие концентрации исходных растворов, используемых во время эксперимента, и конечная концентрация в камере визуализации. Дополнительные примечания приведены в крайнем правом столбце.

2. Подготовьте слайды Biotin-PEG

ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте камеры визуализации как можно ближе к началу эксперимента и не более чем за 2 недели.

  1. Чистые крышки
    1. Расположите равное количество крышек размером 24 x 60 мм и 18 x 18 мм #1,5 (рисунок 1F) в банках для окрашивания слайдов и стеллажах для мойки слайдов соответственно (рисунок 1A, B). Поместите стеллажи для стирки для скольжения, содержащие крышки размером 18 x 18 мм, в стакан емкостью 100 мл.
    2. Промывайте все крышки 5-6 раз в сверхчистой воде (удельное сопротивление 18,2 МОм-см) и удаляйте лишнюю жидкость после каждого ополаскивания с помощью наконечника пипетки, прикрепленного к вакуумной трубке (рисунок 1C).
    3. Наполните стаканы и банки для окрашивания слайдов, содержащие крышки, сверхчистой водой, запечатайте парапленкой и обработайте ультразвуком в течение 10 минут.
    4. Наполните два стакана по 150 мл 200-стойким этанолом. Используя пинцет, окуните каждую крышку в один стакан, наполненный этанолом, а затем в другой.
    5. С помощью пинцета переложите крышки в скользящую сушильную стойку (рисунок 1D), высушите их под потоком газообразного азота и инкубируйте при 37 °C до полного высыхания (~15 мин).
    6. Поместите высушенные крышки в один слой внутри плазменного очистителя. Сформируйте вакуумное уплотнение, а затем установите радиочастотный (РЧ) уровень плазменного очистителя на ~8 МГц.
    7. Как только плазма сгенерирована, оставьте крышки в плазмоочистителе на 5 минут. Выключите плазмоочиститель и медленно отпустите вакуум.
    8. Как только вакуумное уплотнение будет освобождено, переверните крышки и повторите плазменную очистку в течение 5 минут для другой стороны обшивки.
    9. Альтернатива плазменной очистке: Вместо шагов 2.1.2-2.1.3, обтекайте ультразвуком обтекайте крышки в теплом растворе 2% моющего средства (в сверхчистой воде) в течение 10 мин. Затем тщательно промыть крышки сверхчистой водой и обработать ультразвуком в сверхчистой воде 2-3 раза (по 10 мин каждая). Далее промыть в этаноле и высушить, как на этапах 2.1.4-2.1.5. Пропустите шаги 2.1.6-2.1.8.
  2. Лечение биотин-ПЭГ
    1. Непосредственно перед применением растворяют 400 мкл 3-аминопропилтриэтоксисилана в 40 мл ацетона. С помощью пинцета переместите очищенные плазмой крышки в стойку для стирки слайдов и банки для окрашивания слайдов. Погружайте покровы в 3-аминопропилтриэтоксисилановый раствор и инкубируйте в течение 5 мин12,13.
    2. Вымойте все крышки 5-6 раз сверхчистой водой.
    3. Переложите крышки в сушильную стойку, высушите их под потоком газообразного азота и высиживаете при 37 °C до полного высыхания (~20 мин).
    4. Положите высушенные крышки на деликатные салфетки и пометьте каждый обложек на одном углу, например, 'p' на каждом чехле 18 x 18 мм и 'b' на каждом чехле 24 x 60 мм (см. Рисунок 2).
    5. В день эксперимента готовят свежий 0,1 М раствор бикарбоната натрия, растворяя 0,84 мг NaHCO3 в 10 мл сверхчистой воды.
    6. Доведите аликвоты mPEG-Сукцинимидил валерата (PEG-SVA) и Биотин-PEG-SVA до комнатной температуры непосредственно перед использованием. См. примечания по приготовлению аликвоты полиэтиленгликоля (ПЭГ) в таблице 2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Работайте быстро, потому что период полураспада гидролиза фрагмента сукцинимидила валерата (SVA) составляет ~ 30 мин.
    7. Добавьте 102 мкл 0,1 М NaHCO3 к 34 мг ПЭГ-СВА, вращайте в настольной микроцентрифуге при 2,656 х г в течение 20 с, а затем перемешайте путем пипетки вверх и вниз. Растворить 3 мг биотина-ПЭГ-СВА в 27 мкл 0,1 М NaHCO3 путем пипетирования вверх и вниз. Отрегулируйте объемы разбавления в соответствии с точным весом ПЭГ, указанным на трубах (см. таблицу 2).
    8. Приготовьте смесь 100:1 п/б ПЭГ:биотин-ПЭГ, объединив 75 мкл раствора ПЭГ-СВА и 2,25 мкл раствора Биотин-ПЭГ-СВА для 20 облицовок, 100 мкл и 3 мкл для 30 обшивок или 125 мкл и 3,75 мкл для 40 обложек.
    9. Постройте камеру гидратации, поместив влажные бумажные полотенца под стойку наконечника в нижней части пустого наконечника объемом 10 мкл (рисунок 1E). Это предотвратит испарение растворов ПЭГ.
    10. Пипетка 6 мкл смеси PEG-SVA:biotin-PEG 100:1 на центр одного чехла размером 24 x 60 мм на маркированной стороне. Поместите еще один обшивочный лист размером 24 x 60 мм поверх первого чехлового листа таким образом, чтобы пара образовывала X-образную форму, а стороны с надписью «b» были обращены друг к другу. Поместите пару на пустую стойку наконечника в увлажняющей камере и повторите для оставшихся 24 x 60 мм обшивочных прорезей.
    11. Пипетка 6 мкл PEG-SVA по центру одного чехла размером 18 x 18 мм на маркированной стороне. Поместите еще одну крышку размером 18 x 18 мм поверх первой крышки, с боковыми сторонами с надписью «p» лицом друг к другу. Поместите пару на пустую стойку наконечника в гидратационной камере и повторите для оставшихся 18 x 18 мм крышек.
    12. Закройте гидратационную камеру и инкубируйте в течение 3 ч или на ночь.
    13. Отделите пары чехлов и промойте в сверхчистой воде.
    14. Высушите покровы струей азота и поместите их в инкубатор при температуре 37 °C для полного высыхания.
    15. Чтобы построить камеру визуализации, наклейте три полосы двусторонней ленты на крышку размером 24 x 60 мм с боковой маркировкой «b». К другой стороне ленточных полос прикрепите крышку размером 18 x 18 мм с боковой пометкой «p», обращенную к более крупному чехловому листу. Это образует две проточные камеры для микроскопических экспериментов, с обработанными поверхностями, обращенными друг к другу (рисунок 2 и рисунок 1G).

figure-protocol-1
Рисунок 1: Оборудование для обработки крышки и подготовки камеры визуализации. (A) банки для окрашивания слайдов для 24 x 60 мм обшивки, (B) стойки для стирки для скольжения для 18 x 18 мм чехлов, (C) вакуумная установка, (D) стеллаж для сушки слайдов, (E) гидратационная камера, (F) крышки, (G) камера визуализации, (H) держатель слайдов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-protocol-2
Рисунок 2: Схема подготовки камер визуализации с использованием двусторонней ленты (серого цвета) и покрытых крышек, обработанных ПЭГ/Биотин-ПЭГ. Создано с помощью BioRender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

3. Полимеризуйте микротрубочки

  1. Подготовка семян ГМПЦПП
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте семена GMPCPP в холодном помещении, сохраняя все реагенты, наконечники и трубки при 4 °C. Семена GMPCPP могут быть подготовлены заранее и храниться при -80 °C в течение 1 года. Поместите в ультрацентрифугу ротор ультрацентрифуги с фиксированным углом наклона, содержащий трубки центрифуги объемом 1 мл, и установите температуру до 4 °C.
    1. Повторное суспендирование лиофилизированного тубулина (таблица 2) до ~10 мг/мл в 1X BRB80 непосредственно перед применением.
    2. Смешайте компоненты семян GMPCPP, как описано в таблице 3.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Держите все компоненты тубулина на льду как можно больше, чтобы свести к минимуму полимеризацию растворимого тубулина.
    3. Осветлить смесь в ультрацентрифужном роторе с фиксированным углом при 352 700 х г в течение 5 мин при 4 °C.
    4. Разделите супернатант на 5 мкл аликвот, заморозьте их в жидком азоте и храните при -80 °C.
  2. Полимеризуйте семена в день эксперимента
    1. Теплый 1-2 мл BRB80-DTT (таблица 1) до 37 °C.
    2. Поместите 5 мкл аликвоты семян GMPCPP (-80 °C) со стадии 3.1.4 на лед и немедленно растворите в 20 мкл теплого BRB80-DTT. Открутите при 2 000 х г в течение 5 с при комнатной температуре и постучите для смешивания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Первоначальный объем разбавления может варьироваться от 13 мкл до 21 мкл и определяется эмпирически для каждой партии семян. Если семена не полимеризуются, устраните неполадки, дополнив первоначальный буфер разбавления (этап 3.2.2) 0,5 мкМ GMPCPP.
    3. Беречь от света и инкубировать при 37 °C в течение 30-45 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Длина микротрубочек зависит от продолжительности инкубации. Для коротких микротрубочек время инкубации может составлять всего 15 минут. Для длинных микротрубочек время инкубации может составлять до 2 ч. Биотинилированные микротрубочки, как правило, требуют более длительного времени инкубации, чем небиотинилированные микротрубочки.
    4. Поместите ультрацентрифужный ротор с фиксированным углом наклона, содержащий 500 мкл центрифужных трубок, в ультрацентрифугу и предварительно прогрет до 30 °C.
    5. После инкубации добавляют 50 мкл теплого BRB80-DTT (стадия 3.2.1) к полимеризованным семенам GMPCPP и переносят смесь в центрифужную трубку объемом 500 мкл. Промыть пустую трубку, содержащую семена GMPCPP, еще 50 мкл теплого BRB80-DTT, пипеткой вверх и вниз, и добавить этот буфер в 500-мкл центрифужную трубку, содержащую смесь.
    6. Перед вращением отметьте ободок трубки центрифуги, чтобы указать, где будет находиться гранула (гранула будет слишком мала, чтобы ее можно было увидеть). Отжим в течение 10 мин при 244 900 х г при 30 °C12.
    7. Осторожно выложите супернатант и выбросьте. Повторно суспендировать гранулу в 100 мкл теплого BRB80-DTT. Нажмите, чтобы смешать.
    8. Отжим в течение 10 мин при 244 900 х г при 30 °C, выравнивая маркировку с ротором на гранулу в том же месте.
    9. Удалите супернатант и повторно суспендируйте гранулу в 16 мкл теплого BRB80-DTT. Перенесите раствор микротрубочек в чистую микроцентрифужную трубку объемом 0,6 мл. Защитите от света и храните при комнатной температуре или выше.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После полимеризации держите микротрубочки при комнатной температуре или выше. Если они замерзнут, они деполимеризуются. Инкубировать при температуре 28 °C для дополнительной стабильности.
  3. Проверка микротрубочек с помощью TIRF-микроскопии
    1. Пипетка смесью 4,5 мкл BRB80-DTT и 1 мкл раствора микротрубочек (шаг 3.2.9) на предметное стекло микроскопа. Накройте крышкой размером 18 x 18 мм и запечатайте края либо прозрачным лаком для ногтей, либо смесью вазелина, ланолина и парафина (валапный герметик) 1:1: 1, которая является твердой при комнатной температуре и жидкой при 95 ° C.
    2. Поместите объектив TIRF под крышкой (рекомендуемые настройки микроскопа см. на этапе 4) и визуализируйте вновь полимеризованные микротрубочки на длине волны, соответствующей флуоресцентно меченому тубулину в смеси Bright (таблица 3), чтобы определить, какое разбавление микротрубочек использовать в предстоящих экспериментах.
РеагентЯркая смесь (мкл)Порядок добавленияЯркая смесь + биотин (мкл)Порядок добавления
Флуоресцентный тубулин, 10 мг/мл2627
Биотин-тубулин, 10 мг/мл0Н/Д26
Немаркированный тубулин, 10 мг/мл205185
ГМПКЭС, 10 мМ304304
Диафрагма, 0,2 М0.730.73
5X BRB8026.4226.42
стерильная вода52.9152.91
Общий объем (мкл)132132

Таблица 3: Смесь семян ГМПЦПП. Компоненты семян микротрубочек GMPCPP, включая объем и порядок добавления. Приготовьте 5 мкл аликвот и храните до 1 года при -80 °C.

4. Настройки микроскопа

  1. Температура: Установите температуру микроскопа на 28 °C для просмотра динамических микротрубочек.
  2. Фильтры: Используйте наилучшую комбинацию кубиков фильтров и эмиссионных фильтров, в зависимости от флуоресцентных каналов, которые будут визуализированы. Чтобы визуализировать длины волн 488 нм, 560 нм и 647 нм в том же эксперименте, используйте лазерный четырехдиапазонный набор 405/488/560/647 нм в сочетании с эмиссионными фильтрами для обозначенных длин волн.
  3. Выровнять лазеры: убедитесь, что лазерные лучи, используемые в эксперименте, выровнены. Определите интенсивность лазера для эксперимента эмпирически, чтобы все флуоресцентные белки могли быть визуализированы с максимально возможным отношением сигнал/шум, но не подвергались значительному фотоотбеливанию в течение времени эксперимента.
  4. Цель: Используйте бумагу для линз для очистки 100-кратного объектива с 70% этанолом. Перед визуализацией добавьте каплю погружного масла микроскопа к объективу.
  5. Настройка последовательности изображений
    1. Для эксперимента с 647 нм флуорофор-мечеными биотинилированными микротрубочками, 560 нм флуорофор-мечеными небиотинилированными микротрубочками и растворимым тубулином, и интересующим белком, меченым GFP, изображение в течение 20 мин. Снимайте каналы 560 нм и 488 нм каждые 10 с, а канал 647 нм каждые 30 с.
    2. Чтобы захватить эталонное изображение пучков перед добавлением растворимого тубулина и MAP, настройте последовательность с одним изображением каждый в длинах волн 560 нм и 647 нм.

5. Генерация поверхностно-иммобилизованных пучков микротрубочек

ПРИМЕЧАНИЕ: Для следующих этапов перетейте все растворы в проточную камеру путем пипетки в одну открытую сторону, поместив фильтровальную бумагу на другую сторону. Защитите камеру визуализации от света, чтобы уменьшить фотоотбеливание флуоресцентно меченых белков. Прикрепите подготовленную камеру визуализации к держателю слайдов (рисунок 1G,H). Выполните действия, описанные в таблице 4, которые соответствуют шагам протокола 5.2-6.4.

  1. Приготовить растворимую тубулиновую смесь по таблице 5 и держать на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Растворимый тубулин всегда должен быть помещен на лед, чтобы предотвратить полимеризацию. Готовьте свежую растворимую смесь тубулина примерно каждые 2 ч, или когда микротрубочки больше не полимеризуются.
  2. Чтобы обездвижить микротрубочки через связь биотин-нейтравидин-биотин, сначала текут в растворе нейтравидина (NA) до тех пор, пока камера не будет заполнена (~ 7,5 мкл) и инкубирует в течение 5 мин.
  3. Промыть 10 мкл МБ-холода.
  4. Протойте в 7,5 мкл блокирующего белка κ-казеина (KC) и инкубируйте в течение 2 мин.
  5. Промыть 10 мкл МБ-тепла для подготовки камеры к введению микротрубочек.
  6. Разбавляют запас биотинилированных микротрубочек (по наблюдениям на стадии 3.3.2) в 1X BRB80-DTT и добавляют 1 мкл этого разведения к 9 мкл MB-теплого. Протейте смесь в камеру и инкубируйте в течение 10 мин. Используйте более высокую концентрацию микротрубочек для большего количества пучков.
  7. Смойте неиммобилизованные микротрубочки 10 мкл MB-тепла.
  8. Влить в камеру 7,5 мкл теплого KC и инкубировать в течение 2 мин.
  9. Во время инкубации готовят 2 нМ раствора сшивающего белка PRC1 в теплом KC. Перетекают 10 мкл этого раствора в проточную камеру и инкубируют в течение 5 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомбинантный PRC1 экспрессируется и очищается из бактериальных клеток, как описано ранее13.
  10. Чтобы сделать пучки, перетекайте 10 мкл небиотинилированных микротрубочек в камеру и инкубируйте в течение 10 мин. PRC1 будет сшивать небиотинилированные и иммобилизованные биотинилированные микротрубочки15,16 (рисунок 3).
    ПРИМЕЧАНИЕ: См. этап 6.1 для приготовления пробирной смеси во время инкубации.
  11. Дважды промыть камеру 10 мкл в тепле. Прикрепленные микротрубочки стабильны в течение примерно 20 минут с этой точки.
ШагРеагентОбъем (мкл)Время инкубации (минуты)
1Нейтравидин7.55
2МБ-холодный10-
3κ-казеин7.52
4МБ-теплый10-
5Биотинилированная микротрубочка (разведенная в MB-теплой)1010
6МБ-теплый10-
7Теплый κ-казеин7.52
82 нМ PRC1, разбавленный в κ-казеине105
9Небиотинилированная микротрубочка1010
10МБ-теплый x 210-
11Пробирная смесь10-
Прикрепленные семена стабильны в течение примерно 20 минут в этот момент.

Таблица 4: Этапы анализа. Перечень реагентов, добавляемых в камеру визуализации, с указанием времени промывки (-) или инкубации.

РеагентОбъем (мкл)
Переработанный тубулин, 10 мг/мл10
МБ-Холодный10.3
МБМК13.7
БРБ80-ДТТ3.4
ГТП, 10 мМ6.7
СПС, 10 мМ
(При использовании кинезинов)		6.7
Флуоресцентно меченый тубулин,
10 мг/мл		1

(Ресуспенд лиофилизированного меченого тубулина в холодном BRB80-DTT)

Таблица 5: Компоненты смеси растворимых тубулинов. Перемешайте в начале эксперимента и держите на льду.

figure-protocol-3
Рисунок 3: Схема добавления компонентов анализа для изготовления и изображения флуоресцентно меченых пучков и одиночных микротрубочек. Биотинилированные семена показаны в синих, небиотинилированных семенах и растворимый тубулин в красном, PRC1 в черном, а белок, представляющий интерес, в голубом. Номера шагов на рисунке соответствуют номерам, приведенным в таблице 4. Панель, соответствующая шагу 9, показывает предварительно сформированный пучок (внизу слева); на шаге 11 показан вновь образованный пучок (вверху слева). Создано с помощью BioRender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

6. Динамика микротрубочек изображения

  1. В течение 10 мин инкубационного времени на стадии 5.10 готовят 10 мкл пробирной смеси, содержащей интересующие белки, растворимый тубулин, нуклеотиды, поглотители кислорода14 и антиоксиданты согласно таблице 6. Держите смесь на льду.
  2. Загрузите подготовленную камеру визуализации, приклеенную к держателю слайда, на объектив 100x TIRF. Используйте каналы 560 нм и 647 нм, чтобы найти поле зрения, содержащее оптимальное количество и плотность одиночных микротрубочек и пучков.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если как биотинилированные, так и небиотинилированные микротрубочки помечены одним и тем же флуорофором, анализ интенсивности флуоресценции при линейном сканировании может различать отдельные микротрубочки и пучки.
  3. После определения поля зрения сделайте эталонное изображение.
  4. Осторожно течь в пробирную смесь, не нарушая камеру визуализации.
  5. Запечатайте открытые концы камеры валапным герметиком.
  6. Запустите последовательность изображений, как описано в шаге 4.5.1.
РеагентОбъем (мкл)
Растворимая тубулиновая смесь4
ОСФ1
Тролокс (при использовании микротрубочек, помеченных легкоотбеливающим флуорофором)1
СПС, 10 мМ
(При использовании кинезинов)		1
PRC1 (или поперечный по выбору)1
Интересующие белкиX
МБ-холодный2-Х

Таблица 6: Компоненты пробирной смеси. Смешайте, перетейте в камеру визуализации и изобразите динамику микротрубочек в течение 30 минут.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эксперимент, описанный выше, проводили с использованием 647 нм флуорофор-меченых биотинилированных микротрубочек, 560 нм флуорофор-меченых небиотинилированных микротрубочек и 560 нм флуорофор-меченой растворимой тубулиновой смеси. Микротрубочки были сшиты сшиваемым белком PRC1 (меченым GFP). После получения поверхностно-иммобилизованных пучков и одиночных микротрубочек (этап 5.11) камеру визуализации устанавливали на масляный объектив TIRF 100X 1.49 NA и рассматривали в флуоресцентных каналах 560 нм и 647 нм. Одиночные м...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Описанный здесь эксперимент значительно расширяет сферу применения и сложность обычных анализов восстановления микротрубочек, которые традиционно выполняются на одиночных микротрубочках или на одном типе массива. Текущий анализ обеспечивает метод одновременной количественной оценки и сравнения регуляторной активности MAP на двух популяциях, а именно на одиночных микротрубочках и сшитых пучках. Кроме того, этот анализ позволяет исследовать два типа пучков: те, которые предварительно сформированы из стабильных семян до нач...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантом NIH (No 1DP2GM126894-01), а также средствами Pew Charitable Trusts и Smith Family Foundation для R.S. Авторы благодарят доктора Шуо Цзяна за его вклад в разработку и оптимизацию протоколов.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
(±)-6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-карбоновая кислота (Тролокс)Sigma Aldrich238813
1,4-пиперазиндитансульфоновая кислота (PIPES)Sigma AldrichP6757
18x18 мм #1.5 покровные стекла Электронная микроскопия Науки63787
2-меркаптоэтанол (BME)Sigma AldrichM-6250
24x60 мм #1.5 покровные стеклаЭлектронная микроскопия Науки63793
405/488/560/647 нм Лазер Quad Band ChromaTRF89901-NK
АцетонSigma Aldrich320110
Аденозин 5'-трифосфат динатриевой соли гидрат (АТФ)Sigma AldrichA7699-5G
Avidin, NeutrAvidin® Биотин-связывающий белок (молекулярные зонды®)Thermo Fischer ScientificA2666
Ультразвуковой аппарат для ванны: Branson 2800 Cleaner
Beckman Coulter, 11 x 34 ммBeckman-Coulter 
Толстостенные трубки Beckman Coulter из поликарбоната, 8 x 34 ммBeckman-Coulter 
Biotin-PEG-SVA, MW 5,000Laysan Bio#Biotin-PEG-SVA-5000
Бычья сыворотка альбумина (BSA)Sigma Aldrich2905
КаталазаSigma AldrichC40
Corning LSE Мини-микроцентрифуга, AC100-240VCorning6670
Деликатные салфеткиKimtech34120
Дитиотреитол (DTT)GoldBioDTT10
Эмиссионный фильтрChromaET610/75m
Этанол (200-проба)Decon Labs2705
Этиленгликоль тетрауксусная кислота (EGTA)Sigma Aldrich3777
ГлюкозооксидазаSigma AldrichG2133
GMPCPPJena Bioscience NU-405
Гуанозин 5'-трифосфат натрия соль гидрат (ГТФ)Sigma AldrichG8877
Hellmanex III моющее средство Sigma AldrichZ805939
Иммерсионное масло, тип AFisher Scientific77010
Каппа-казеинSigma AldrichC0406
ЛанолинFisherScientific S25376
Салфетка для чистки линзThorLabsMC-5
Хлорид магния (MgCl2)Sigma AldrichM9272
МетилцеллюлозаSigma AldrichM0512
Microfuge 16 настольная центрифугаBeckman-Coulter A46474
Предметные стекла для микроскопа, алмазно-белое стекло, 25 x 75 мм, 90 градусов; Кромки земли, БЕЛЫЙ матовыйглобус Scientific1380-50 Вт
mPEG-сукцинимидил валерат, МВт 5,000 Laysan Bio#NH2-PEG-VA-5K
Оптима&трейд; Настольная ультрацентрифуга Max-XPBeckman-Coulter 
ПарафинFisher ScientificP31-500
PELCO Reverse (самозакрывающийся), тонкий пинцетTed Pella5377-NM
Petrolatum, WhiteFisher Scientific18-605-050
Плазменный очиститель, 115VHarrick PlasmaPDC-001
Гидроксид калия (KOH)Sigma Aldrich221473
Бикарбонат натрияSigma AldrichS6014
сахарозаSigma AldrichS7903
Термолок 1-позиционная сухая тепловая баняСША Scientific2510-1101
Термолок блок для пробирок объемом 1,5 и 2,0 млСША Scientific2520-0000
Thermo Scientific&торговля; Пирс и трейд; Bond-Breaker и торговля; Раствор TCEP, нейтральный pH; 500mMThermo Fischer ScientificPI-77720
TIRF 100X NA 1.49 Масляный объективNikonCFI Apochromat TIRF 100XC Масляный
микроскоп TIRFNikonEclipse Ti
TLA 120.1 роторBeckman-Coulter 
Ротор TLA 120.2Beckman-Coulter 
Белок тубулин (>99% чистоты): свиной мозгЦитоскелетT240
Тубулин Белок (биотин): свиной мозгЦитоскелетT333P Тубулин
белок (флуоресцентный HiLyte 647): свиной мозгЦитоскелетTL670M
Тубулин белок (X-родамин): бычий мозгЦитоскелетTL620M
VECTABOND® Реактив, вектор адгезии тканевого сеченияBiolabsSP-1800-7
VWR® Инкубатор индивидуального размера, 120 В, 50/60 Гц, 0,6 АVWR97025-630
Поликарбонатные толстостенные трубки Branson CPX2800H 343778343776393315362224357656

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Subramanian, R., Kapoor, T. M. Building complexity: insights into self-organized assembly of microtubule-based architectures. Developmental Cell. 23 (5), 874-885 (2012).
  2. Baas, P. W., Rao, A. N., Matamoros, A. J., Leo, L. Stability properties of neuronal microtubules. Cytoskeleton (Hoboken). 73 (9), 442-460 (2016).
  3. Bitan, A., Rosenbaum, I., Abdu, U. Stable and dynamic microtubules coordinately determine and maintain Drosophila bristle shape. Development. 139 (11), 1987-1996 (2012).
  4. Foe, V. E., von Dassow, G. Stable and dynamic microtubules coordinately shape the myosin activation zone during cytokinetic furrow formation. The Journal of Cell Biology. 183 (3), 457-470 (2008).
  5. Pous, C., et al. Functional specialization of stable and dynamic microtubules in protein traffic in WIF-B cells. The Journal of Cell Biology. 142 (1), 153-165 (1998).
  6. Uehara, R., Goshima, G. Functional central spindle assembly requires de novo microtubule generation in the interchromosomal region during anaphase. The Journal of Cell Biology. 191 (2), 259-267 (2010).
  7. Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).
  8. Bieling, P., et al. Reconstitution of a microtubule plus-end tracking system in vitro. Nature. 450 (7172), 1100-1105 (2007).
  9. Bieling, P., Telley, I. A., Surrey, T. A minimal midzone protein module controls formation and length of antiparallel microtubule overlaps. Cell. 142 (3), 420-432 (2010).
  10. Shimamoto, Y., Forth, S., Kapoor, T. M. Measuring pushing and braking forces generated by ensembles of Kinesin-5 crosslinking two microtubules. Developmental Cell. 34 (6), 669-681 (2015).
  11. Mani, N., Jiang, S., Neary, A. E., Wijeratne, S. S., Subramanian, R. Differential regulation of single microtubules and bundles by a three-protein module. Nature Chemical Biology. 17 (9), 964-974 (2021).
  12. Hyman, A. A., Salser, S., Drechsel, D., Unwin, N., Mitchison, T. J. Role of GTP hydrolysis in microtubule dynamics: information from a slowly hydrolyzable analogue, GMPCPP. Molecular Biology of the Cell. 3 (10), 1155-1167 (1992).
  13. Subramanian, R., et al. Insights into antiparallel microtubule crosslinking by PRC1, a conserved nonmotor microtubule binding protein. Cell. 142 (3), 433-443 (2010).
  14. Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
  15. Wijeratne, S., Subramanian, R. Geometry of antiparallel microtubule bundles regulates relative sliding and stalling by PRC1 and Kif4A. eLife. 7, 32595(2018).
  16. Mani, N., Wijeratne, S. S., Subramanian, R. Micron-scale geometrical features of microtubules as regulators of microtubule organization. eLife. 10, 63880(2021).
  17. Freal, A., et al. Feedback-driven assembly of the axon initial segment. Neuron. 104 (2), 305-321 (2019).
  18. Ledbetter, M., Porter, K. A "microtubule" in plant cell fine structure. The Journal of Cell Biology. 19 (1), 239-250 (1963).
  19. Wijeratne, S. S., Marchan, M. F., Tresback, J. S., Subramanian, R. Atomic force microscopy reveals distinct protofilament-scale structural dynamics in depolymerizing microtubule arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 119(2022).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

TIRF MicroscopyMicrotubule DynamicsCrosslinked MicrotubulesSingle MicrotubulesIn Vitro ReconstitutionFluorescence ImagingMicrotubule BundlesProtein RegulatorsSurface ImmobilizationMicrotubule Organization

Related Articles