Method Article

Надежный рабочий процесс обработки криоэлектронной микроскопии с одной частицей (крио-ЭМ) с криоСПАРК, RELION и Scipion

DOI:

10.3791/63387

⸱

January 31st, 2022

 , 
1Institute for Quantitative Biomedicine, Rutgers University, 2Department of Biochemistry & Microbiology, Rutgers University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой статье описывается, как эффективно использовать три платформы обработки крио-ЭМ, т.е. cryoSPARC v3, RELION-3 и Scipion 3, для создания единого и надежного рабочего процесса, применимого к различным наборам данных с одной частицей для определения структуры с высоким разрешением.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Последние достижения в области как приборов, так и программного обеспечения для обработки изображений сделали криоэлектронную микроскопию одной частицы (крио-ЭМ) предпочтительным методом для структурных биологов для определения структур высокого разрешения широкого спектра макромолекул. Для новых и опытных пользователей доступно несколько пакетов программного обеспечения для обработки изображений и расчета структуры, которые оптимизируют один и тот же базовый рабочий процесс: фильмы, полученные детекторами микроскопа, проходят коррекцию для оценки движения и контрастной функции передачи луча (CTF). Затем изображения частиц выбираются и извлекаются из усредненных кадров фильма для итеративной 2D- и 3D-классификации, за которой следует 3D-реконструкция, уточнение и проверка. Поскольку различные программные пакеты используют разные алгоритмы и требуют разного уровня знаний для работы, 3D-карты, которые они генерируют, часто различаются по качеству и разрешению. Таким образом, пользователи регулярно передают данные между различными программами для достижения оптимальных результатов. Этот документ содержит руководство для пользователей по навигации по рабочему процессу в популярных программных пакетах: cryoSPARC v3, RELION-3 и Scipion 3 для получения структуры, близкой к атомному разрешению аденоассоциированного вируса (AAV). Сначала мы подробно описываем конвейер обработки изображений с помощью cryoSPARC v3, поскольку его эффективные алгоритмы и простой в использовании графический интерфейс позволяют пользователям быстро получить 3D-карту. На следующем этапе мы используем PyEM и собственные скрипты для преобразования и передачи координат частиц из 3D-реконструкции наилучшего качества, полученной в cryoSPARC v3, в RELION-3 и Scipion 3 и пересчитывают 3D-карты. Наконец, мы намечаем шаги для дальнейшего уточнения и валидации результирующих структур путем интеграции алгоритмов из RELION-3 и Scipion 3. В этой статье мы расскажем, как эффективно использовать три платформы обработки для создания единого и надежного рабочего процесса, применимого к различным наборам данных для определения структуры с высоким разрешением.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Криоэлектронная микроскопия (крио-ЭМ) и анализ одной частицы (SPA) позволяют определять структуру широкого спектра биомолекулярных сборок в их гидратированном состоянии, помогая осветить роль этих макромолекул в атомных деталях. Усовершенствования в оптике микроскопа, компьютерном оборудовании и программном обеспечении для обработки изображений позволили определить структуры биомолекул с разрешением, превышающим 2 Å1,2,3. Более 2 300 крио-ЭМ-структур были депонированы в Банке данных белка (PDB) в 2020 году по сравнению со 192 структурами в 20144 году, что указывает на то, что крио-ЭМ стал методом выбора для многих структурных биологов. Здесь мы описываем рабочий процесс, объединяющий три различные программы SPA для определения структуры с высоким разрешением (рисунок 1).

Целью SPA является реконструкция 3D-объемов целевого образца из шумных 2D-изображений, записанных детектором микроскопа. Детекторы собирают изображения в виде фильмов с отдельными кадрами одного поля зрения. Чтобы сохранить образец, кадры собираются с низкой дозой электронов и, таким образом, имеют плохое отношение сигнал/шум (SNR). Кроме того, воздействие электронов может индуцировать движение внутри остеклованных крио-ЭМ-сеток, что приводит к размытию изображения. Чтобы преодолеть эти проблемы, кадры выравниваются для корректировки движения, вызванного лучом, и усредняются, чтобы получить микрофотографию с увеличенным SNR. Эти микроснимки затем проходят оценку функции переноса контраста (CTF) для учета эффектов расфокусировки и аберраций, наложенных микроскопом. Из микроснимков, скорректированных CTF, отдельные частицы отбираются, извлекаются и сортируются в средние значения 2D-класса, представляющие различные ориентации, принятые образцом в стекловидном льду. Результирующее однородное множество частиц используется в качестве входных данных для ab initio 3D-реконструкции для создания грубой модели или моделей, которые затем итеративно уточняются для получения одной или нескольких структур с высоким разрешением. После реконструкции выполняются структурные доработки для дальнейшего улучшения качества и разрешения крио-ЭМ карты. Наконец, либо атомная модель непосредственно выводится из карты, либо карта снабжена атомными координатами, полученными в другом месте.

Для выполнения описанных выше задач доступны различные пакеты программного обеспечения, включая Appion5, cisTEM6, cryoSPARC7, EMAN8, IMAGIC9, RELION10, Scipion11, SPIDER12, Xmipp13 и другие. Хотя эти программы следуют аналогичным этапам обработки, они используют разные алгоритмы, например, для выбора частиц, создания начальных моделей и уточнения реконструкций. Кроме того, эти программы требуют различного уровня пользовательских знаний и вмешательства для работы, так как некоторые из них зависят от тонкой настройки параметров, которые могут выступать в качестве препятствия для новых пользователей. Эти расхождения часто приводят к картам с несогласованным качеством и разрешением на разных платформах14, что побуждает многих исследователей использовать несколько пакетов программного обеспечения для уточнения и проверки результатов. В этой статье мы освещаем использование cryoSPARC v3, RELION-3 и Scipion 3 для получения 3D-реконструкции AAV с высоким разрешением, широко используемого вектора для генной терапии15. Вышеупомянутые пакеты программного обеспечения бесплатны для академических пользователей; cryoSPARC v3 и Scipion 3 требуют лицензий.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Создание нового проекта cryoSPARC v3 и импорт данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Данные были получены в Орегонском университете здоровья и науки (OHSU) в Портленде с использованием электронного микроскопа Titan Krios 300 кВ, оснащенного прямым электронным детектором Falcon 3. Изображения собирались в режиме подсчета с общей дозой 28,38 e−/Å2 , дробленной на 129 кадров, и диапазоном дефокусировки от -0,5 мкм до -2,5 мкм при размере пикселя 1,045 Å с использованием EPU. Образец AAV-DJ предоставили сотрудники OHSU.

  1. Откройте cryoSPARC v3 в веб-браузере и щелкните заголовок Проекты . Выберите + Добавить , чтобы создать новый проект. Назовите проект соответствующим образом и укажите путь к существующему каталогу, в котором будут сохранены задания и данные.
  2. Создайте рабочую область для проекта, открыв проект, щелкнув + Добавить и выбрав Новая рабочая область. Назовите рабочую область и нажмите кнопку Создать.
  3. Перейдите в новую рабочую область и откройте конструктор заданий на правой панели. На этой вкладке отображаются все функции, доступные в cryoSPARC v3. Нажмите «Импорт фильмов» и укажите путь к фильмам, путь к файлу ссылки и задайте параметры получения следующим образом: Размер необработанного пикселя 1,045 Å, Ускоряющее напряжение 300 кВ, Сферическая аберрация 2,7 мм, Общая экспозиционная доза 28,38 e-/Å^2.
  4. Щелкните Очередь, выберите полосу для запуска задания и рабочей области, а затем нажмите кнопку Создать.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры сбора зависят от образца и микроскопа.

2. CryoSPARC v3 - выравнивание ролика и оценка CTF

  1. Откройте исправление движения патча (Multi). Для этого задания в качестве входных данных требуются фильмы, импортированные на шаге 1.3. Откройте карточку заданий импорта фильмов в рабочей области и перетащите выходные данные Imported_movies в заполнитель фильмов в новом задании. Поставьте задание в очередь.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения дополнительной информации о методах cryoSPARC, описанных в этой статье, см. учебник cryoSPARC16.
  2. Для выполнения оценки CTF откройте Patch CTF Estimation (Multi). Введите микроснимки, созданные на шаге 2.1, и поставьте задание в очередь.
  3. Чтобы проверить усредненные и CTF-скорректированные микроснимки и выбрать подмножество для дальнейшей обработки, откройте Curate Exposures и введите экспозиции, полученные на этапе 2.2. Поставьте задание в очередь.
  4. После того, как задание перейдет в режим ожидания , перейдите на вкладку Взаимодействие на карточке задания, настройте пороговые значения параметров и примите или отклоните отдельные микроснимки для дальнейшей обработки. Принимайте микроснимки с хорошо подобранными оценочными и экспериментальными CTF (рисунок 2) и отбрасывайте снимки с высоким астигматизмом, плохой посадкой CTF и толстым льдом.
  5. При обработке текущих данных установите верхний порог астигматизма равным 400 Å, разрешением соответствия CTF 5 Å и относительной толщиной льда 2. Нажмите « Готово», чтобы выбрать микроснимки для последующей обработки.

3. CryoSPARC v3 - ручной и шаблонный отбор частиц

  1. Откройте средство выбора вручную, введите принятые экспозиции из шагов 2.4-2.5 и поставьте задание в очередь. Нажмите на вкладку «Интерактивный », установите размер коробки (px) на 300 и нажмите на несколько сотен частиц на нескольких микрофотографиях и избегайте выбора перекрывающихся частиц. Здесь было отобрано 340 частиц на 29 микроснимках. Когда закончите, нажмите Готово Выбор! Извлеките частицы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол использует ручной отбор частиц для создания шаблонов для автоматического выбора. Однако доступны и другие методы17.
  2. Чтобы сгенерировать шаблоны для автоматического отбора частиц, нажмите на 2D-классификацию и введите выбор частиц, сгенерированные на шаге 3.1. Измените число 2D-классов на 10 и поставьте задание в очередь.
  3. Откройте Выбрать 2D-классы. Введите частицы и средние значения классов, полученные на шаге 3.2, и перейдите на вкладку Интерактивные . Выберите репрезентативные 2D-классы с хорошим SNR и нажмите готово.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Средние значения класса отражают различные представления частиц. Выберите средние значения класса, отражающие каждое представление. Цель состоит в том, чтобы создать четко определенные шаблоны, представляющие различные виды образца для автоматической комплектации.
  4. Откройте средство выбора шаблонов и введите 2D-классы, выбранные на шаге 3.3, и микроснимки из шагов 2.4-2.5. Установите диаметр частицы (Å) равным 220 Å и поставьте задание в очередь.
  5. Чтобы проверить автоматические выборки, откройте Select Particle Picks, введите частицы и микроснимки, созданные на шаге 3.4, и поставьте задание в очередь.
  6. На карточке задания Выбор частиц перейдите на вкладку Интерактивные и установите размер поля (px) равным 300. Нажмите на отдельный микрофотографию, отрегулируйте фильтр нижних частот до тех пор, пока частицы не станут хорошо видны, и установите порог нормализованной перекрестной корреляции (NCC) на 0,41 и порог мощности между 54000 и 227300.
  7. Осмотрите несколько микроснимков и, при необходимости, отрегулируйте пороговые значения таким образом, чтобы большинство частиц было выбрано без включения ложных срабатываний. По завершении нажмите Готово выбор! Извлеките частицы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Истинные частицы обычно имеют высокий показатель NCC и мощности, что указывает на то, что они похожи на шаблон и имеют высокий SNR, соответственно.
  8. Откройте Извлечение из микроснимков и введите микроснимки и частицы из шага 3.7. Установите для параметра Размер извлеченного поля (px) значение 300 и поставьте задание в очередь.

4. КриоСПАРК v3 - 2D классификация

  1. Нажмите на 2D Classification и введите извлеченные частицы из шага 3.8. Установите для параметра Число 2D-классов значение 50 и поставьте задание в очередь.
  2. Чтобы выбрать лучшие 2D-классы для дальнейшей обработки, откройте Выбрать 2D-классы. Введите частицы и средние значения классов, полученные на шаге 4.1. Нажмите на вкладку Interactive и выберите 2D-классы в зависимости от разрешения и количества частиц в классе (рисунок 3). Не выбирайте классы, содержащие артефакты. После выбора нажмите Готово.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно для удаления частиц, которые не сходятся в отдельные, четко определенные классы, требуется несколько раундов 2D-классификации. Выполните столько раундов 2D-классификации, сколько необходимо для удаления таких частиц из набора данных (рисунок 3).

5. CryoSPARC v3 - ab-initio реконструкция и однородная доработка

  1. Чтобы сгенерировать начальный 3D-объем, откройте Ab-initio Reconstruction и введите частицы, полученные на шаге 4.2 или из окончательной 2D-классификации. Настройте симметрию на икосаэдрическую. Поставьте задание в очередь.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Симметрия зависит от выборки и должна быть изменена соответствующим образом. Если неизвестно, используйте симметрию C1.
  2. Открытая однородная очистка. Введите объем из шага 5.1 и частицы из 4.2 или окончательную 2D-классификацию. Измените симметрию и поставьте задание в очередь. По завершении задания проверьте кривую корреляции оболочки Фурье (FSC) и загрузите том для изучения в UCSF Chimera18.

6. Экспорт координат частиц из cryoSPARC v3 и импорт их в RELION-3 с помощью PyEM

ПРИМЕЧАНИЕ: Координаты частиц несут информацию о местоположении отдельных частиц на каждой микроснимке. Передача координат вместо стеков частиц в RELION-3 позволяет выполнять этапы уточнения, которые в противном случае были бы недоступны. Например, для полировки частиц требуется доступ к начальным кадрам фильма. Следовательно, перед экспортом координат частиц из cryoSPARC v3 в RELION-3 импортируйте фильмы и выполняйте коррекцию движения и оценку CTF в RELION-3. Подробности см. в учебнике RELION-319.

  1. Перейдите в каталог проекта RELION-3 и запустите RELION-3.
  2. Откройте импорт из браузера типа задания и укажите путь к фильмам и параметрам получения, как показано на шаге 1.3.
  3. Чтобы выполнить коррекцию движения, используйте UCSF MotionCor220 через графический интерфейс RELION-3, откройте Motion Correction и установите параметры по умолчанию, как в руководстве UCSF MotionCor222. Введите путь к фильмам, импортированным на шаге 6.2. На вкладке Движение укажите путь к исполняемому файлу motioncor2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: MotionCor2 можно запускать параллельно с использованием нескольких графических процессоров.
  4. Выполните оценку CTF с использованием CTFFIND-4.122 через графический интерфейс RELION-3. Откройте оценку CTF и введите micrographs.star, сгенерированный на шаге 6.3. На вкладке CTFFIND-4.1 укажите путь к исполняемому файлу CTFFIND-4.1 и задайте параметры, как в учебнике RELION-3.119.
  5. Чтобы импортировать стеки частиц из cryoSPARC v3 в RELION-3, они сначала должны быть экспортированы из cryoSPARC v3. В cryoSPARC v3 откройте карточку заданий задания Select 2D class из шага 4.2 или окончательной 2D-классификации. На вкладке Сведения нажмите кнопку Экспорт задания. Задание экспорта выводит файл particles_exported.cs.
  6. Перед импортом координат частиц из cryoSPARC v3 в RELION-3 файл particles_exported.cs из шага 6.5 должен быть преобразован в формат .star. Используя PyEM23, преобразуйте particles_exported.cs файл в формат .star, выполнив следующую команду: csparc2star.py particles_exported.cs particles_exported.star
  7. В RELION-3 перейдите на вкладку «Ручной выбор» и на вкладке «Ввод-вывод » введите микроснимки из уточнения CTF, описанного в шаге 6.4. На вкладке Дисплей введите следующие параметры: Диаметр частиц (A): 220, Фильтр нижних частот (A): -1 , Масштаб для изображения CTF: 0,5. Запустите задание. Каталог с именем ManualPick создается в домашней папке RELION-3.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг выполняется для создания структуры папок ручного выбора в RELION-3. При ручном отборе для каждого усредненного микрофотографии, используемого для отбора в графическом интерфейсе RELION-3, создается один файл .star, содержащий координаты выбранных частиц.
  8. Перейдите в папку, содержащую файл particles_exported.star из шага 6.6, и запустите домашний сценарий, создающий один файл manualpick.star для каждого усредненного микрофотографии, используемого для выбора частиц cryo-SPARC v3, что способствовало окончательной 2D-классификации, экспортированной на шаге 6.5. Полученные файлы координат сохраняются в папке ManualPick/Movies.
  9. Вернитесь в RELION-3 и снова откройте задание Ручная комплектация . Нажмите продолжить. Это отобразит частицы, ранее выбранные в cryoSPARC v3, в графическом интерфейсе RELION-3. Осмотрите несколько микроснимков, чтобы убедиться, что передача координат частиц была выполнена и правильно ли выбраны частицы.

7. RELION-3 - Экстракция частиц и 2D классификация

  1. Нажмите на Извлечение частиц. На вкладке Ввод-вывод введите скорректированные микроснимки CTF из шага 6.4 и координаты из шага 6.9. Перейдите на вкладку «Извлечь» и измените размер ячейки частиц (пикс) на 300. Запустите задание.
  2. Выполните 2D-классификацию для дальнейшей очистки набора частиц, сгенерированного в cryoSPARC v3, для достижения реконструкции с более высоким разрешением. Нажмите на 2D Classification и на вкладке I/O введите файл particles.star, сгенерированный на шаге 7.1. На вкладке Оптимизация установите для параметра Количество классов значение 50, а для параметра Диаметр маски (A) — 280. Запустите задание.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Маска должна охватывать всю частицу.
  3. Чтобы выбрать лучшие 2D-классы, щелкните метод Выбора подмножества , введите файл _model.star из шага 7.2 и запустите задание. Выберите классы, как описано в шаге 4.2.
  4. Повторите шаги 7.2 и 7.3, чтобы удалить несходящиеся частицы.

8. RELION-3 - 3D уточнение, создание маски и постобработка

  1. Используйте карту, сгенерированную в cryoSPARC v3 (шаг 5.2), в качестве исходной модели для 3D-уточнения в RELION-3. Выберите метод Импорт и задайте следующие параметры на вкладке Ввод-вывод : Импорт необработанных фильмов/микрофотографий: Нет, Необработанные входные файлы: Фильмы/*.mrc.
  2. Введите файл MTF и введите параметры получения фильма, как описано в шаге 1.3. На вкладке Другие выберите карту cryoSPARC v3 в качестве входного файла, измените Тип узла на 3D-ссылку (.mrc) и выполните задание.
  3. Выберите 3D Auto-Refine и на вкладке Ввод-вывод установите Входные изображения в качестве файла particles.star из шага 7.3 или последнего задания выбора. Приведите реконструкцию cryoSPARC v3 в качестве справочной карты. Перейдите на вкладку Ссылка и измените начальный фильтр нижних частот (Å) на 50 и симметрию на icosahedral. На вкладке Оптимизация измените диаметр маски (Å) на 280 и выполните задание.
  4. После завершения пробега откройте run_class001.mrc в UCSF Chimera.
  5. В UCSF Chimera щелкните Инструменты и в разделе Данные тома выберите Средство просмотра томов. Откроется новое окно для настройки параметров громкости. Измените шаг на 1 и отрегулируйте ползунок до достижения значения уровня, на котором карта не имеет шума. Запишите это значение, так как оно будет использоваться для создания маски на следующем шаге.
  6. Карта, полученная в результате автоочистки, не отражает истинный FSC, так как шум от окружающего растворителя снижает разрешение. Перед последующей обработкой создайте маску, чтобы отличить образец от области растворителя.
    1. Щелкните Создание маски и введите run_class001.mrc из шага 8.3.
    2. Перейдите на вкладку Маска и настройте параметры следующим образом: Карта фильтров нижних частот (Å): 10, Размер пикселя (Å): 1,045, Начальный порог бинаризации: значение уровня, полученное на шаге 8.5, Расширить двоичную карту на это количество пикселей: 3 и Добавить мягкий край этого количества пикселей: 3. Запустите задание.
  7. Изучите маску в UCSF Chimera. Если маска слишком плотная, увеличьте На столько пикселей увеличить двоичную карту и/или добавьте мягкий край этого количества пикселей. Важно создать маску с мягкими краями, так как острая маска может привести к переподготовке.
  8. Нажмите на Постобработка и на вкладке Ввод-вывод введите полукарты, созданные на шаге 8.3, и маску из 8.6. Установите размер калиброванного пикселя равным 1,045 Å. На вкладке Резкость введите следующее: Оцените B-фактор автоматически?: Да, самое низкое разрешение для автоподгонки B (A): 10, используйте свой собственный B-фактор?: Нет. На вкладке Фильтр установите для параметра Пропустить Fsc-Weighting? значение Нет. Выполните задание.

9. RELION-3 - Обучение полировке и полировке частицами

  1. Перед корректировкой движения, вызванного пучком частицы, сначала используйте режим обучения, чтобы определить оптимальные траектории движения для набора данных. Откройте байесовскую полировку и на вкладке Ввода-вывода введите микроснимки с коррекцией движения из шага 6.3, частицы из шага 8.3 и файл .star постпроцесса из шага 8.8. Перейдите на вкладку Обучение и задайте следующие параметры: Оптимальные параметры тренировки: Да, Доля пикселей Фурье для тестирования: 0,5, Используйте это количество частиц: 5000. Запустите задание.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот скрипт создаст opt_params_all_groups.txt файл в польской папке RELION-3, содержащий оптимизированные параметры полировки, необходимые для выполнения следующего шага.
  2. Как только учебная работа будет завершена, нажмите на Байесовскую полировку. Перейдите на вкладку Обучение и установите для параметра Оптимальные параметры тренировки? значение Нет. Выберите вкладку Польский и в разделе Оптимизированный файл параметров укажите путь к файлу opt_params_all_groups.txt из шага 9.1. Нажмите кнопку Выполнить.
  3. Повторите 3D-уточнение (шаг 8.3) и постобработку (шаг 8.8) с набором полированных частиц.

10. RELION-3 - Уточнения CTF и частиц

  1. Чтобы оценить аберрации более высокого порядка, откройте уточнение CTF и на вкладке Ввод-вывод в разделе Частицы выберите путь к файлу .star, содержащему отполированные частицы из недавнего задания Уточнение 3D (run_data.star).
    1. В разделе Postprocess Star File задайте путь к выходным данным последнего задания постобработки (шаг 9.3).
    2. Выберите вкладку «Подгонка» и задайте следующие параметры: Оценка (анизотропное увеличение): Нет, выполнить подгонку параметров CTF? Нет, оцените Beamtilt: Да, также оцените трилистник? Да, оценка абберации 4-го порядка? Да. Запустите задание.
  2. Повторите шаг 10.1, используя в качестве входных частиц (из Refine3D ), сгенерированных в предыдущем задании (particles_ctf_refine.star). На вкладке Соответствие измените значение параметра Оценка (анизотропное увеличение) на Да и выполните задание.
  3. Повторите шаг 10.2, используя в качестве входных частиц (из Refine3D), полученных в предыдущем задании (particles_ctf_refine.star). На вкладке Fit задайте следующие параметры: Оценка (анизотропное увеличение): Нет, Выполнить подгонку параметров CTF?: Да, Fit Defocus?: Per-particle, Fit Astigmatism? На микрофотографию, Fit B-фактор?: Нет, Fit Phase-Shift: No, Estimate Beamtilt?: No, Estimate 4th Order Aberrations?: No. Запустите его.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Учитывая, что частица имеет достаточную контрастность, вкладку Fit Astigmatism? можно установить в Per-particle. Для этого набора данных уточнение астигматизма на частицу не улучшило качество и разрешение карты.
  4. Повторите 3D-уточнение с частицами из шага 10.3 и на вкладке «Ввод-вывод» установите для параметра Использовать FSC с сглаженными растворителями? значение «Да». По завершении выполнения выполните задание постобработки (шаг 8.8) и изучите карту в UCSF Chimera (шаг 5.2).

11. Передача координат частиц RELION-3 и 3D карты в Сципион 3

  1. Для дальнейшего уточнения и проверки карты RELION-3 сначала импортируйте объем и частицы из последнего задания постобработки (шаг 10.4) в Scipion 3. Запустите Scipion 3 и создайте новый проект.
  2. На левой панели «Протоколы » выберите раскрывающийся список «Импорт» и нажмите « Импортировать частицы». Измените следующие параметры: Импорт из: RELION-3, Star File: postprocess.star и укажите параметры получения, как показано в шаге 1.3. Нажмите кнопку Выполнить.
  3. Щелкните раскрывающийся список Импорт и выберите Импорт томов. В разделе Импорт от укажите путь к карте RELION-3. Измените размер пикселя (частоту дискретизации) Å/px на 1,045 и выполните.

12. Scipion 3 - Уточнение высокого разрешения

  1. Во-первых, выполните глобальное выравнивание. Выберите раскрывающийся список Уточнить на панели Протоколы и нажмите на Xmipp3 - highres24. Введите импортированные частицы и тома из шагов 11.2 и 11.3 в виде полноразмерных изображений и начальных томов соответственно и установите для группы симметрии икосаэдрическое значение. На вкладке Выравнивание изображения в разделе Угловое назначение выберите Глобальный, установите для параметра Максимальное целевое разрешение значение 3 Å и выполните задание.
  2. Когда задание будет завершено, нажмите «Анализировать результаты». В новом окне нажмите на значок UCSF Chimera , чтобы просмотреть уточненный объем. Кроме того, нажмите «Графики разрешения дисплея» (FSC), чтобы увидеть, как изменился FSC после уточнения, а также «График гистограммы с угловыми изменениями», чтобы увидеть, изменились ли назначения угла Эйлера.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от разрешения входной структуры RELION-3 этот шаг может быть повторен несколько раз с различными значениями, установленными для максимального целевого разрешения на вкладке Угловое назначение . Для получения дополнительной информации см. учебник Scipion25.
  3. Повторите шаг 12.1 с локальным выравниванием. Скопируйте предыдущее задание и измените Параметр Выбрать предыдущий запуск на Xmipp3 - highres Global. На вкладке Угловое назначение измените выравнивание изображения на Локальное. Установите для параметра Максимальное целевое разрешение значение 2,1 Å.
  4. Изучите уточненную карту в UCSF Chimera и проанализируйте изменение FSC и угловых присвоений (шаг 12.2). Повторяйте локальное уточнение до тех пор, пока разрешение не улучшится и угловые назначения не сойдутся, при необходимости настраивая максимальное целевое разрешение .
  5. Выходная карта из Scipion 3 может быть дополнительно модифицирована плотностью и заточена в Phenix26.

13. Scipion 3 - Проверка карты

  1. Изучите локальное разрешение окончательной карты, сгенерированной в Xmipp3 - highres. Откройте Xmipp - локальный MonoRes27 и введите окончательный том из предыдущего задания и маску, сгенерированные на шаге 8.6. Установите диапазон разрешения от 1 до 6 Å с интервалом 0,1 Å и выполните задание.
  2. Когда вы закончите работу, нажмите «Анализировать результаты» и изучите гистограмму разрешения и объемные фрагменты, окрашенные разрешением.
  3. Чтобы увидеть, хорошо ли выровнены частицы, откройте Multireference Alignability28 и введите частицы и объем с шага 12.3. Щелкните Анализ результатов, чтобы отобразить график проверки. В идеале все точки должны быть сгруппированы вокруг (1.0,1.0).
  4. Откройте Xmipp3 - Проверка перенастройки. Введите частицы и объемы из шага 12.3. Когда закончите работу, проанализируйте результаты и осмотрите график перенастройки. Пересечение выровненных кривых гауссовского шума и выровненных частиц указывает на перенастройку.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы представили комплексный конвейер SPA для получения структуры высокого разрешения с использованием трех различных платформ обработки: cryoSPARC v3, RELION-3 и Scipion 3. На рисунках 1 и 4 обобщен общий рабочий процесс обработки, а в таблице 1 подробно описаны протоколы уточнения. Эти протоколы использовались во время уточнения структуры AAV 2.3 Å, достигая разрешения, близкого к Найквисту.

Фильмы были сначала импорт...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой статье мы представляем надежный рабочий процесс SPA для обработки крио-EM данных на различных программных платформах для достижения 3D-реконструкций с высоким разрешением (рисунок 1). Этот рабочий процесс применим к широкому спектру биологических макромолекул. Последующие этапы протокола описаны на рисунке 4, включая предварительную обработку фильма, отбор и классификацию частиц, а также несколько методов уточнения структуры (таблица

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Карлоса Оскара Сорцано за помощь в установке Scipion3 и Килиана Шнелле и Арне Мёллера за помощь в передаче данных между различными платформами обработки. Часть этого исследования была поддержана грантом NIH U24GM129547 и выполнена в PNCC в OHSU и доступна через EMSL (grid.436923.9), Пользовательский объект Управления науки Министерства энергетики США, спонсируемый Управлением биологических и экологических исследований. Это исследование было поддержано грантом стартапа от Ратгерского университета Ареку Кульчику.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
КриосПАРКСтруктурура Биотехнология Инк.https://cryosparc.com/
CTFFIND 4Медицинский институт Говарда Хьюза, Медицинская школа Чана Массачусетского университетаhttps://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4
MotionCorr2Группа высокомолекулярных структур UCSFhttps://msg.ucsf.edu/software
вычислительные инструменты Phenixдля высокомолекулярной нейтронной кристаллографии (MNC)http://www.phenix-online.org/
Калифорнийский университет PyEM, Сан-Францискоhttps://github.com/asarnow/pyem
Лабораторию структурной биологии RELION MRChttps://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php/Main_Page
ScipionInstruct (I2PC), SciLifeLabhttp://scipion.i2pc.es/
UCSF ChimeraUCSF Resource for Biocomputing, Визуализация и информатикаhttps://www.cgl.ucsf.edu/chimera/
Центр обработки изображений

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bartesaghi, A., et al. Atomic resolution Cryo-EM structure of beta-galactosidase. Structure. 26 (6), 848-856 (2018).
  2. Merk, A., et al. Breaking Cryo-EM resolution barriers to facilitate drug discovery. Cell. 165 (7), 1698-1707 (2016).
  3. Wardell, M., et al. The atomic structure of human methemalbumin at 1.9 A. Biochemical and Biophysical Research Communications. 291 (4), 813-819 (2002).
  4. PDB statistics: Growth of Structures from 3DEM Experiments Released per Year. RCSB PDB. , Available from: https://www.rcsb.org/stats/growth/growth-em (2021).
  5. Lander, G. C., et al. Appion: an integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing. Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).
  6. Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. cisTEM, user-friendly software for single-particle image processing. Elife. 7, 35383(2018).
  7. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  8. Tang, G., et al. EMAN2: an extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).
  9. van Heel, M., Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. A new generation of the IMAGIC image processing system. Journal of Structural Biology. 116 (1), 17-24 (1996).
  10. Scheres, S. H. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  11. de la Rosa-Trevin, J. M., et al. Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy. Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).
  12. Shaikh, T. R., et al. SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs. Nature Protocols. 3 (12), 1941-1974 (2008).
  13. Sorzano, C. O., et al. XMIPP: a new generation of an open-source image processing package for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 148 (2), 194-204 (2004).
  14. Lawson, C. L., Chiu, W. Comparing cryo-EM structures. Journal of Structural Biology. 204 (3), 523-526 (2018).
  15. Naso, M. F., Tomkowicz, B., Perry, W. L., Strohl, W. R. Adeno-associated virus (AAV) as a vector for gene therapy. BioDrugs. 31 (4), 317-334 (2017).
  16. Dawood, S., Punjani, S., Arulthasan, S. Cryo-EM data processing in cryoSPARC: Introductory Tutorial. at. , Available from: https://guide.cryosparc.com/processing-data/cryo-em-data-processing-in-cryosparc-introductory-tutorial (2020).
  17. Bepler, T., Noble, A. J., Berger, B. Topaz-Denoise: general deep denoising models for cryoEM and cryoET. Nature Communications. 11 (5208), (2020).
  18. Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera-a visualization system for exploratory research and analysis. Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).
  19. Scheres, S. Single-particle processing in RELION-3.1. , Available from: https://hpc.nih.gov/apps/RELION/relion31_tutorial.pdf (2019).
  20. Zheng, S. Q., Palovcak, E., Armache, J. P., Verba, K. A., Cheng, Y., Agard, D. A. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
  21. Zheng, S. MotionCor2 User Manual. , Available from: https://hpc.nih.gov/apps/RELION/MotionCor2-UserManual-05-03-2018.pdf (2018).
  22. Rohou, A., Grigorieff, N. CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation from electron micrographs. Journal of Structural Biology. 192 (2), 216-221 (2015).
  23. Asarnow, D., Palovacak, E., Cheng, Y. UCSF PyEM v0.5. , Available from: https://github.com/asarnow/pyem (2019).
  24. Sorzano, C. O. S., et al. A new algorithm for high-resolution reconstruction of single particles by electron microscopy. Journal of Structural Biology. 204 (2), 329-337 (2018).
  25. Jimenez-Moreno, A., et al. Cryo-EM and single-particle analysis with Scipion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62261(2021).
  26. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66, 213-221 (2010).
  27. Vilas, J. L., et al. MonoRes: Automatic and accurate estimation of local resolution for electron microscopy maps. Structure. 26 (2), 337-344 (2018).
  28. Sorzano, C. O., et al. A clustering approach to multireference alignment of single-particle projections in electron microscopy. Journal of Structural Biology. 171 (2), 197-206 (2010).
  29. Penczek, P. A. Resolution measures in molecular electron microscopy. Methods in Enzymology. 482, 73-100 (2010).
  30. Xie, Q., Yoshioka, C. K., Chapman, M. S. Adeno-associated virus (AAV-DJ)-Cryo-EM structure at 1.56 A Resolution. Viruses. 12 (10), 1194(2020).
  31. Zivanov, J., et al. New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3. Elife. 7, 42166(2018).
  32. Kulczyk, A. W., Moeller, A., Meyer, P., Sliz, P., Richardson, C. C. Cryo-EM structure of the replisome reveals multiple interaction coordinating DNA synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1848-1856 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Particle Cryo EMCryoSPARC WorkflowRELION ProcessingScipion Integration3D ReconstructionMotion CorrectionCTF EstimationParticle Picking2D ClassificationAdeno Associated Virus

Related Articles