Определение распределения гликогена по длине глюкановой цепи методом флуорофорного углеводного электрофореза (FACE)

Гликоген, используемый в качестве хранения углерода и энергии, представляет собой гомополимер глюкозы, состоящий из линейных цепочек глюкозильных единиц, связанных (1 → 4)-α связями и присоединенных через (1 → 6)-α гликозидные связи или точки ветвления. Они появляются в виде β и α частиц в цитозоле широкого спектра организмов. β частицы представляют собой крошечные водорастворимые частицы, в основном наблюдаемые у прокариот. Их диаметр колеблется в пределах 20-40 нм, вероятно, продиктованных гликогеном метаболизирующими ферментами и стерическим препятствием ^1,2.

Впервые описанные в клетках животных, более крупные α частицы имеют диаметр до 300 нм с формой, похожей на цветную капусту. Эта конкретная организация может возникать в результате агрегации нескольких β-частиц или может возникать путем почкования из одной^{β-частицы 3}. Интересно, что недавнее исследование сообщило о присутствии α частиц в Escherichia coli⁴. Однако, в отличие от α-частиц из клеток животных, последние быстро разваливаются в процессе экстракции, что может объяснить отсутствие данных в литературе⁴. Появление α-частиц у эукариот и прокариот включает филогенетически не связанные ферменты, метаболизирующие гликоген⁵. Это поднимает вопросы относительно функции таких частиц и природы потенциальных сшивающих агентов между β-частицами⁵.

Хотя были предложены две противоположные математические модели для образования молекул гликогена ^6,7,8,9, общепризнано, что β-частицы эволюционировали в ответ на их метаболическую функцию в качестве высокоэффективного запаса топлива для быстрого высвобождения больших количеств глюкозы. Большое количество доказательств указывает на то, что свойства гликогена, такие как усвояемость и растворимость в воде, коррелируют со средней длиной цепи (ACL), которая затем будет диктовать процент точек ветвления и размер частиц ^{2,6,7,8,10,11} . ACL определяется соотношением между общим количеством остатков глюкозы и количеством точек ветвления. Как правило, значения ACL варьируют от 11-14 и 7-23 остатков глюкозы у эукариот и прокариот соответственно¹⁰. У людей некоторые заболевания гликогенными расстройствами связаны с аномальным накоплением гликогена. Например, болезнь Андерсена связана с недостаточной активностью фермента ветвления гликогена, что приводит к накоплению аномального гликогена¹¹. У прокариот кумулятивные исследования показывают, что ACL является критическим фактором, влияющим на скорость деградации гликогена и способность бактериальной выживаемости^12,13. Сообщалось, что бактерии, синтезирующие β-частицы с низким значением ACL, разлагаются медленнее и, следовательно, дольше выдерживают условия голодания. Таким образом, знание архитектуры β-частиц имеет важное значение для понимания образования аномальных частиц гликогена при заболеваниях хранения гликогена человека и выживания прокариот в среде с дефицитом питательных веществ.

С момента первого выделения гликогена из печени собаки французским физиологом Клодом Бернаром в конце девятнадцатого века¹⁴ века было разработано множество методов для детальной характеристики частиц гликогена. Например, просвечивающая электронная микроскопия для морфологии гликогена (α- или β-частиц)¹⁵, протонно-ЯМР-спектрометрия для определения процента связей α-1,6¹⁶, эксклюзионная хроматография с несколькими детекторами для вывода молекулярной массы, флуорофорный углеводный электрофорез (FACE)¹⁷ или высокоэффективная анионообменная хроматография с импульсным амперометрическим обнаружением (HPAEC-PAD) как для распределения длины цепи (CLD), так и для ACL определение¹⁸.

Эта работа посвящена методу электрофореза углеводов с помощью флуорофора, который опирается на восстановительное аминирование гемиацетальной группы первичной функцией амина. Исторически сложилось так, что 8-амино-1,3,6-нафталин трисульфоновая кислота (ANTS) впервые была использована для маркировки. Позже он был заменен более чувствительным флуорофором, 8-амино 1,3,6 пирентрисульфоновой кислотой (APTS)¹⁹.

Рисунок 1: Реакция восстановительного аминирования с 8-амино 1,3,6 пирентрисульфоновой кислотой (APTS). Реакция восстановительного аминирования гемиацетальной группы первичной аминной функцией 8-амино-1,3,6 пирентрисульфоновой кислоты (APTS) в восстановительных условиях Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Как показано на рисунке 1, гемиацетальная функция восстановительного конца глюкановой цепи взаимодействует с первичным амином APTS в восстановительных условиях. Сульфонные группы APTS несут отрицательные заряды, которые позволяют разделять глюканные цепи в соответствии со степенью их полимеризации (DP). Восстановительная аминовая реакция обладает высокой воспроизводимостью и эффективностью. Средняя эффективность маркировки составляет 80% для DP3 до DP135 и до 88% и 97% для мальтозы (DP2) и глюкозы соответственно^17,20. Поскольку одна молекула APTS реагирует с редуцирующим концом каждой глюкановой цепи, отдельные цепи могут быть количественно определены и сопоставлены друг с другом на молярной основе.

1. Инкубация с разветривающими ферментами

1. Смешайте 200 мкл очищенного гликогена при 0,5-2 мг/мл с 200 мкл 100 мМ ацетатного буфера (рН 4,8). Добавьте 2 мкл изоамилазы (180 Ед/мг белка) и 1,5 мкл пуллуланазы (30 Ед/мг белка) (см. Таблицу материалов), аккуратно перемешайте путем пипетки вверх и вниз и инкубируйте при 42 °C в течение 16 ч в пробирке объемом 1,5 мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Деградация или загрязнение амилазой может произойти в процессе очистки гликогена. Чтобы оценить наличие свободных мальто-олигосахаридов, образцы могут быть инкубированы без параллельного разветвляющего ферментного коктейля. Стандарт (например, мальтогептаоза) включается в анализ для определения взаимосвязи между временем элюирования и степенью полимеризации.
2. Остановить реакции путем инкубации при 95 °C в течение 5 мин.
3. Центрифугу при 16 100 х г в течение 5 мин при комнатной температуре до гранулируют и удаляют любой нерастворимый материал.
4. Удалите супернатанты с помощью пипетки и перенесите их в новые аннотированные трубки. Обессоливание супернатантов путем добавления эквивалента 100 мкл шариков анионно-катионообменной смолы (AG-501-X8, см. Таблицу материалов) и перемешивания.
   1. Регулярно перемешивайте бусины в течение 5 мин. Соберите образцы путем пипетки и поместите их в новые аннотированные трубки.
5. Сублимационная сушка или использование вакуумного испарителя, установленного (см. Таблицу материалов) при температуре 30 °C для сушки образцов.
6. Храните высушенные образцы при комнатной температуре или при -20 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы могут храниться в течение 1 месяца.

2. Восстановительное аминирование

1. Смешайте высушенные образцы с 2 мкл 1 М цианоборогидрида натрия в тетрагидрофуране (ТГФ) и 2 мкл APTS (5 мг APTS, повторно суспендированных в 48 мкл 15% уксусной кислоты) (см. Таблицу материалов).
2. Инкубировать при 42 °C в течение 16 ч в темноте.
   ВНИМАНИЕ: Цианоборогидрид натрия обрабатывается с помощью адаптированных средств индивидуальной защиты и под химическим капотом. Вдыхание и контакт с кожей очень токсичны и могут привести к летальному исходу, вызывая сильные ожоги кожи и повреждение глаз. Высокотоксичные газы могут образовываться при смешивании цианоборогидрида натрия с уксусной кислотой. При контакте с водой цианоборогидрид натрия выделяет легковоспламеняющиеся газы, которые могут самовоспламениться. Концентрированные образцы обрабатываются под химическим капотом и с использованием адаптированных средств индивидуальной защиты, начиная с этого этапа.

3. Анализ ЛИЦА

1. Добавьте 46 мкл сверхчистой воды к каждому образцу.
2. Разбавляют образцы непосредственно до 1/50 в микропузырьках по 100 мкл путем добавления 1 мкл образца к 49 мкл сверхчистой воды. Держите образцы в темноте во время установки FACE (5-10 мин).
3. Выполнить электрофорез обратной полярности с помощью инструмента капиллярного электрофореза с лазерно-индуцированным флуоресцентным (LIF) детектором (см. Таблицу материалов). Установите полярность в «обратный режим» для разделения, установите LIF на длину волны излучения 488 нм, а детектор на 512 нм.
4. Установите время впрыска на 10 с и давление впрыска на уровне 0,5 фунтов на квадратный дюйм.
5. Проводят разделение глюканов с маркировкой APTS при 30 кВ в голом плавленом капилляре кремнезема длиной 60,2 см с внутренним диаметром 50 мкм (наружный диаметр 375 мкм) в N-связанном буфере разделения углеводов, разведенном до 1/3 в сверхчистой воде (см. Таблицу материалов).
   ПРИМЕЧАНИЕ: N-связанный буфер разделения углеводов заменяется каждые 20 прогонов.

4. Обработка ДАННЫХ

1. Экспортируйте ". ИСС" и ". CDF" файлы, содержащие профиль электроферограммы и данные интеграции соответственно.
2. Откройте платформу . ASC файл и нарисуйте относительную флуоресцентную единицу в соответствии с временной диаграммой.
3. Откройте платформу . CDF файл, продолжайте первую автоматическую интеграцию и настройте следующие параметры: ширина; интеграция между долинами; минимальная площадь.
4. Проверяйте и исправляйте любые неправильные события интеграции вручную.

Определение средней длины цепи гликогена
На рисунке 2 представлен рабочий процесс, необходимый для вывода распределения длины цепи и средней длины цепи (ACL) гликогена.

Рисунок 2: Рабочий процесс для определения распределения длины цепи (CLD) и средней длины цепи. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

На фиг.3 показаны электроферограммы коммерческой мальтогексаозы и разветвленного гликогена печени крупного рогатого скота. Флуоресцентные сигналы, наблюдаемые между 4,13-4,67 мин во всех экспериментах, исходили от нереактированного APTS. Время элюирования меченой мальтогексаозы (DP6) оценивали в 8,49 мин (рисунок 3А). Маркированные APTS глюканы бычьего гликогена были идентифицированы на основе времени элюирования DP6 (рисунок 3B). В контрольном образце (гликоген, не инкубированный с ферментами деветривания) не было обнаружено следов свободного мальто-олигосахарида (рисунок 3С).

Рисунок 3: Электроферограммы стандартного и гликогена печени крупного рогатого скота. (A) Время элюирования (8,49 мин) стандарта глюкана, мальтогексаозы (DP6), использовалось в качестве эталона для определения степени полимеризации (DP) меченых APTS глюканов, высвобождаемых из гликогена печени крупного рогатого скота после действия деветвирующих ферментных активностей (B ). На врезной панели показано разделение глюканных цепей до 44 DP. Параллельно необработанный бычий гликоген маркировали APTS для обнаружения возможных следов свободных мальто-олигосахаридов в образце (C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Можно сделать вывод, что высвобождение глюкана, меченого APTS, обусловлено расщеплением точек ветвления как изоамилазой, так и пуллулазой. Следует отметить, что профиль капиллярного электрофореза может быть перерисован в более подходящем формате для создания мозаичной фигуры, содержащей несколько профилей. Для этого файлы DATA, содержащие значения флуоресценции, генерируются с расширением "asc" и открываются в программе электронных таблиц путем выбора формата CSV (значение, разделенное запятыми). К сожалению, экспортируемые значения флуоресценции не связаны с соответствующим временем элюирования. Следовательно, они должны быть добавлены вручную в соответствии с настройкой частоты сбора на устройстве FACE (4 Гц означает одно получение значения каждые 0,25 с).

Пиковые области затем выводились с помощью собственного приложения инструмента FACE или экспортировались в виде файла DATA с расширением «cdf» для использования другого приложения. Значения площадей экспортируются в программу электронных таблиц и нормализуются путем выражения DP в процентах от общей площади поверхности (рисунок 4).

Рисунок 4: Нормализация данных, распределение длины цепи и среднее значение длины цепи. Области пика флуоресценции были импортированы и нормализованы в электронной таблице. Распределение длины цепи отображается в процентах DP для каждого DP. Средняя длина цепи (ACL) рассчитывается путем суммирования каждой процентной цепи на соответствующую степень полимеризации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Наконец, средняя длина цепи (ACL) выводится путем вычисления суммы каждой процентной цепи, умноженной на соответствующую степень полимеризации. Аналогичные эксперименты проводились в трех экземплярах на гликогене печени кролика (рисунок 5А), на гликогене печени крупного рогатого скота (рисунок 5В) и гликогене устриц (рисунок 5С).

Рисунок 5: Распределение коммерческого гликогена по длине цепи. Печень кролика (А), печень крупного рогатого скота (В) и устричный гликоген (С) инкубировали в присутствии разветвляющихся ферментов (изоамилазы и пуллулазы). Затем глюканы, меченные APTS, были разделены в соответствии со степенью их полимеризации (DP) с использованием анализа FACE. Мальтоза (DP2), мальтогексаоза (DP6), мальтогептаоза (DP7) представляют собой наиболее распространенные глюканы в печени кролика, устрице и гликогене печени крупного рогатого скота соответственно. Стандартная погрешность среднего значения (SEM) была выведена из трех независимых экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Распределение гликогена печени кролика по длине цепи ясно показало более высокое содержание короткого мальто-олигосахарида (DP2), чем гликогена печени крупного рогатого скота (DP 7) или устричного гликогена (DP6). В результате гликоген печени кролика обладает самой низкой средней длиной цепи (ACL = 9,8) по сравнению с гликогеном печени крупного рогатого скота (ACL = 11,9) и устричным гликогеном (ACL = 12,6). Следует отметить, что эти коммерческие гликогены обычно используются для анализа активности гликогенфосфорилазы или гликогенсинтазы. Это говорит о том, что определение кинетических параметров (Vmax и Km) активности метаболизирующего фермента гликогена будет варьироваться в зависимости от источника гликогена.

Субтрактивный анализ
Субтрактивный анализ представляет собой простой метод сравнения распределения глюканных цепей двух образцов. Например, были определены CLD гликогена, продуцируемого штаммом Synechocystis PCC6803 дикого типа (WT) и одиночными изогенными мутантными штаммами glgA1 и glgA2 (рисунок 6A).

Рисунок 6: Сравнение распределений длины цепи с использованием субтрактивного анализа. (A) Распределение гликогена по длине цепи, очищенного от цианобактериальных штаммов: Дикого типа (WT) Synechocystis PCC6803 и одиночных изогенных мутантных штаммов glgA1 и glgA2 определяли с помощью анализа FACE. Стандартная погрешность среднего значения (SEM) была выведена из трех независимых экспериментов. (B) Субтрактивный анализ проводился путем вычитания % каждого DP WT в % каждого DP ΔglgA1 и вычитания % каждого DP WT в % каждого DP DP DP ΔglgA2. Эта простая математическая манипуляция отображает изменение цепочек глюканов в мутантных штаммах (черных линиях). (C) Среднее распределение гликогена по длине цепи из дикого типа и мутантов Synechocystis было нормализовано в соответствии с максимальным пиком, наблюдаемым для каждого CLD (DP6 для всех образцов). О двух компонентах свидетельствует построение нормализованного CLD на логарифмической шкале (Nde (DP)). Каждый компонент указывает на различный механизм остановки роста (для получения дополнительной информации см. Ссылку2). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Напомним, что большинство штаммов цианобактерий обладают двумя генами, кодирующими активность гликогенсинтазы: GlgA1 и GlgA221. Оба фермента переносят остаток глюкозы АДФ-глюкозы на невосстанавливающие концы линейных глюканных цепей. Как показано на рисунке 6A, сравнивать образцы сложно, глядя только на профили распределения длины цепи. Субтрактивный анализ состоит из вычитания процента каждого DP между выборками (рисунок 6B). Субтрактивный анализ %DP МАСС минус % мутанта DP ΔglgA1 выявляет избыток DP3, 4 и 5 (отрицательные значения) и пониженное содержание DP 10-20. Напротив, субтрактивный анализ между %DP wt и % DP ΔglgA2 мутанта указывает на противоположный эффект. Поскольку профили субтрактивного анализа различаются между GlgA1 и GlgA2, это говорит о специфической функции каждой изоформы гликогенсинтазы в биосинтезе гликогена21.

Важно отметить, что субтрактивный анализ применим только к экспериментам, которые включают эталонный образец, выполняемый параллельно с образцами. В противном случае субтрактивный анализ может быть эмпирическим, поскольку он лежит на нормализованной CLD ссылки. В 2015 году Дэн и его коллеги, которые исследовали механизмы остановки роста гликогена у мышей и людей, предложили альтернативное построение и интерпретацию Гликогенных CLD для решения этой проблемы. Этот график использует максимальную пиковую область для нормализации каждого CLD. Затем данные строятся на логарифмической шкале, выделяющей два компонента. Последние иллюстрируют два различных механизма остановки удлинения цепи2. Путем рисования линий, соответствующих более высокому компоненту DP, абсолютные параметры (т.е. наклоны и перехваты линий) могут быть использованы для сравнения CLD без нормализации в эталонный профиль. CLD штамма Synechocystis PCC6803 дикого типа (WT) и одиночных изогенных мутантов glgA1 и glgA2 были нанесены на логарифмическую шкалу, и для каждого профиля были определены линии подгонки (рисунок 6C). Первый компонент был очень похож между образцами, достигнув максимума при DP 6. Это показывает, что ветвящийся фермент явно производит максимум таких цепей. Второй компонент появился в виде широкого плеча, которое уже было описано для мышей и человеческих гликогенов2. Наклон второго компонента возник при более высоком DP в ΔglgA1 и наклон соответствующей линии подгонки (красной линии) был ниже профиля wildtype. Таким образом, недостаток GlgA1 замедляет остановку удлинения цепи при биосинтезе, что, как было предложено, происходит при стерической помехе для мышей и человеческого гликогена2. Эти данные свидетельствуют о том, что оставшийся удлиняющий фермент (т.е. GlgA2) производит более длинные цепи перед скученностью цепи. В ΔglgA2 наблюдался противоположный эффект с более резким падением линии фитинга, подтверждая, что цепи, производимые оставшимся GlgA1, в целом короче, чем цепи, синтезированные только GlgA2 до стерического препятствия. Этот анализ показывает, что обе изоформы обладают различной кинетикой и/или что их соответствующая согласованность с активностью ветвящихся ферментов различается.

У авторов нет конфликта интересов, связанного с данной работой.