Этот протокол описывает подробную, низковходную пробоподготовку для секвенирования с одним ядром, включая рассечение верхних цервикальных и звездчатых ганглиев мыши, диссоциацию клеток, криоконсервацию, выделение ядра и штрих-кодирование хэштегов.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Изоляция и мультиплексирование ядра со штрихкодированными антителами симпатических ганглиев мыши для секвенирования одноядерной РНК
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Сердечная вегетативная нервная система имеет решающее значение для контроля сердечной функции, такой как частота сердечных сокращений и сократимость сердца, и делится на симпатическую и парасимпатическую ветви. Как правило, существует баланс между этими двумя ветвями для поддержания гомеостаза. Однако состояния сердечных заболеваний, такие как инфаркт миокарда, сердечная недостаточность и гипертония, могут вызывать ремоделирование клеток, участвующих в сердечной иннервации, что связано с неблагоприятным клиническим исходом.
Хотя существует огромное количество данных о гистологической структуре и функции сердечной вегетативной нервной системы, ее молекулярно-биологическая архитектура в здоровье и болезнях все еще загадочна во многих аспектах. Новые технологии, такие как секвенирование одноклеточной РНК (scRNA-seq), обещают генетическую характеристику тканей с одноклеточным разрешением. Однако относительно большой размер нейронов может препятствовать стандартизированному использованию этих методов. Здесь этот протокол использует секвенирование одноядерной РНК на основе капель (snRNA-seq), метод характеристики биологической архитектуры сердечных симпатических нейронов в здоровье и болезни. Продемонстрирован поэтапный подход для выполнения snRNA-seq двустороннего верхнего шейного (SCG) и звездчатого ганглия (StG), рассеченных у взрослых мышей.
Этот метод обеспечивает долгосрочное сохранение образцов, поддерживая адекватное качество РНК, когда образцы от нескольких людей / экспериментов не могут быть собраны все сразу в течение короткого периода времени. Штрих-кодирование ядер с помощью хэштегов oligos (HTO) позволяет демультиплексировать и отслеживать отдельные ганглионные образцы после секвенирования. Последующие анализы выявили успешный захват ядер нейрональных, спутниковых глиальных и эндотелиальных клеток симпатических ганглиев, что подтверждается snRNA-seq. Таким образом, этот протокол обеспечивает поэтапный подход к snRNA-seq симпатических внешних сердечных ганглиев, метод, который имеет потенциал для более широкого применения в исследованиях иннервации других органов и тканей.
Введение
Вегетативная нервная система (ВНС) является важнейшей частью периферической нервной системы, которая поддерживает гомеостаз организма, включая адаптацию к условиям окружающей среды и патологии1. Он участвует в регуляции нескольких систем органов по всему телу, таких как сердечно-сосудистая, дыхательная, пищеварительная и эндокринная системы. ВНС делится на симпатическую и парасимпатическую ветви. Спинномозговые ветви симпатической нервной системы синапс в ганглиях симпатической цепи, расположенные двусторонне в паравертебральном положении. Двусторонние шейные и грудные ганглии, особенно StG, являются важными компонентами, участвующими в сердечной симпатической иннервации. При болезненных состояниях, таких как ишемия сердца, может произойти ремоделирование нейронов, что приводит к симпатическому овердрайву2. Ремоделирование нейронов было продемонстрировано в нескольких гистологических исследованиях на людях и нескольких других видах животных 3,4,5,6. Подробная биологическая характеристика ремоделирования нейронов, вызванного ишемией сердца, в сердечных симпатических ганглиях в настоящее время отсутствует, а фундаментальные биологические характеристики специализированных типов нейрональных клеток или подтипов в сердечной симпатической нервной системе (SNS) еще не полностью определены при здоровье и заболевании7.
Новые технологии, такие как scRNA-seq, открыли шлюзы для генетической характеристики мелких тканей на одноклеточном уровне 8,9. Однако относительно большой размер нейронов может препятствовать оптимизированному использованию этих одноклеточных методов у людей10. Кроме того, секвенирование одной клетки требует высокой пропускной способности клеток для восстановления достаточного количества клеток из-за высоких потерь в процессе секвенирования. Это может оказаться сложной задачей при изучении небольших тканей, которые трудно захватить за один сеанс и требуют нескольких образцов для введения достаточного количества одиночных клеток для секвенирования. Недавно разработанная технология snRNA-seq на основе капель (то есть платформа 10x Chromium) позволяет изучать биологические различия между одиночными ядрами11,12. snRNA-seq имеет преимущество перед scRNA-seq для крупных клеток (>30 мкм), которые не могут быть захвачены в Gel Bead in Emulsions (GEMs), а также улучшенную совместимость с обширной диссоциацией и/или длительным сохранением 13,14,15.
Гетерогенность, количество нейрональных клеток и других клеток, обогащенных сердечными СНС, являются важными аспектами для характеристики ВНС в состояниях здоровья и заболевания. Кроме того, органная или региональная иннервация каждым симпатическим ганглием способствует усложнению СНС. Кроме того, было показано, что шейные, звездчатые и грудные ганглии симпатической цепи иннервируют различные области сердца16. Поэтому необходимо выполнить одноядерный анализ ганглионарных клеток, полученных из отдельных ганглиев, для изучения их биологической архитектуры.
SnRNA-seq на основе капель позволяет профилировать экспрессию транскриптома для пула из тысяч клеток из нескольких образцов одновременно с более низкими затратами, чем платформы секвенирования на основе пластин. Этот подход позволяет snRNA-seq на основе капель быть более подходящим для классификации клеточного фенотипа и новой субпопуляционной идентификации клеток в SCG и StG. Примечательно, что этот протокол обеспечивает краткий поэтапный подход к идентификации, выделению и секвенированию одноядерной РНК симпатических внешних сердечных ганглиев, метод, который имеет потенциал для широкого применения в исследованиях характеристик ганглиев, иннервирующих другие связанные органы и ткани в здоровье и болезни.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Этот протокол описывает все этапы, необходимые для snRNA-seq цервикальных и/или шейно-цервикоторакальных (звездчатых) ганглиев. Использовались самки и самцы мышей C57BL/6J (15 недель, n = 2 для каждого пола). Одна дополнительная мышь Wnt1-Cre;mT/mG была использована для визуализации ганглиев в целях рассечения17,18. Эта дополнительная мышь была получена путем скрещивания мыши B6.Cg-Tg(Wnt1-cre)2Sor/J и мыши B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J мыши. Все эксперименты на животных проводились в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных, опубликованным NIH и одобренным Комитетом по этике животных Лейденского университета (номер лицензии AVD1160020185325, Лейден, Нидерланды). Смотрите Таблицу материалов для получения подробной информации обо всех материалах, оборудовании, программном обеспечении и животных, используемых в протоколе.
1. Препараты
ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы выполняются в шкафу для клеточного культивирования.
- Очистите щипцы и ножницы, погружая инструменты в 70% этанол на 20 минут.
- Приготовьте ганглиозную среду, состоящую из нейробазальной среды, дополненной B-27 плюс (1x), L-глютамином (2 мМ) и 1% антибиотиком-антимикотиком. Предгреть ганглиозную среду при комнатной температуре.
- Готовят раствор для пищеварения: 0,25% трипсин-ЭДТА (1:1) и 1 400 Ед/мл коллагеназы типа 2, растворенной в ганглиозной среде.
- Подготовьте свежий, холодный (4 °C) буфер промывки клеток (0,4% бычьего сывороточного альбумина [BSA]) и буфер лизиса (10 мМ Tris-HCl, 10 мМ NaCl, 3 мМ MgCl2 и 0,1% неионного моющего средства, 40 ЕД/мл РНКАзы в воде без нуклеазы) для выделения ядра.
- Приготовьте буфер промывки ядра (1x фосфатно-буферный физиологический раствор [PBS] с 2,0% BSA и ингибитором РНКазы 0,2U/μL).
- Готовят буфер окрашивания ST (ST-SB) (10 мМ Tris-HCl, 146 мМ NaCl, 21 мМ MgCl2, 1 мМ CaCl2, 2% BSA, 0,02% Tween-20 в воде без нуклеазы).
2. Рассечение верхних шейных ганглиев взрослой мыши (SCG)
- Усыплите мышей и держите их на льду.
ПРИМЕЧАНИЕ: В текущем исследовании в общей сложности 4 мыши C57BL6 / J были усыплены асфиксией CO2 . Альтернативно, изофлуран может быть использован с последующей экссангинацией, когда необходимо собрать большое количество крови для других целей исследования. - Закрепите мышь на рассеченной доске булавками и обливайте ее 70% этанолом, чтобы свести к минимуму диспергирование шерсти (бритье не требуется).
- Под стереомикроскопом откройте кожу области шеи, сделав ножницами разреза по средней линии, отодвиньте подчелюстные железы в сторону и удалите стерномастоидную мышцу, чтобы обнажить и найти общую сонную артерию и ее бифуркацию (рисунок 1A, B, см. стрелку).
- Рассекают бифуркацию правой и левой сонной артерии и прикрепленную к ней ткань. Переложите каждый рассеченный кусочек ткани в отдельную чашку Петри размером 3,5 см, содержащую холодный PBS.
- Ищите SCG, прикрепленный к бифуркации сонной артерии. Очистите SCG дальше, удалив артерию и другую прикрепленную ткань в чашке Петри (рисунок 1E).
3. Рассечение звездчатых ганглиев взрослых мышей (StG)
- Чтобы рассечь StG, сделайте средний разрез в брюшной полости с последующим открытием диафрагмы и вентральной грудной стенки.
- Удалите сердце и легкие, чтобы обнажить спинную грудную клетку. Ищите левый и правый StG anterolateral к musculus colli longus (MCL) на уровне первого ребра (рисунок 1C, D, обозначен пунктирными линиями).
- Рассекните как левый, так и правый StG щипцами и отдельно перенесите их на 3,5 см чашки Петри, содержащие холодный PBS (рисунок 1F).
4. Выделение и криоконсервация ганглионарных клеток мыши
Шаги 4-6 обобщены на рисунке 2.
- Аккуратно перенесите все отдельные SCG и StG в отдельные микроцентрифужные трубки объемом 1,5 мл с щипцами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте наконечники пипеток для переноса ганглиев, потому что ганглии склонны прилипать к стенке пластиковых наконечников пипеток. - Добавьте 500 мкл 0,25% раствора трипсина-ЭДТА в каждую микроцентрифужную трубку и инкубируйте на встряхивающей водяной бане при 37 °C в течение 40 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап направлен на облегчение пищеварения и высвобождения клеток в растворе коллагеназы типа 2. - Подготовьте пробирку объемом 15 мл, содержащую 5 мл ганглиозной среды для каждого образца. Дайте ганглиям осесть на дне микроцентрифужных трубок. Соберите супернатант, который содержит очень мало ганглионарных клеток, перенесите супернатант в подготовленные 15 мл пробирки и пометьте каждую трубку. В качестве альтернативы, чтобы сэкономить некоторое время, аспирировать супернатант трипсина-ЭДТА без сбора, так как в нем может быть обнаружено очень мало диссоциированных клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Небольшое количество раствора трипсина-ЭДТА (~10-30 мкл) можно оставить в микроцентрифужной трубке, чтобы избежать удаления ганглиев. Избегайте пипетирования на этом этапе, потому что это может повредить ганглии и привести к низкому выходу ганглионарных клеток впоследствии. - Добавьте 500 мкл раствора коллагеназы типа 2 в каждую микроцентрифужную трубку и вылейте на встряхивающей водяной бане при 37 °C в течение 35-40 мин. Попробуйте повторно суспендировать ганглий через 35 мин; если ганглий еще неповрежден и не диссоциирует, при необходимости продлевают время инкубации или увеличивают концентрацию раствора коллагеназы 2 типа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации может варьироваться в зависимости от размера ганглия. - Повторное суспендирование ганглиев в растворе коллагеназы путем пипетки вверх и вниз ~ 10 раз или до тех пор, пока сгустки тканей больше не обнаруживаются.
- Перенесите клеточную суспензию в ранее использованную трубку объемом 15 мл, которая содержит глоглиевую культуральную среду и суспензию трипсина-ЭДТА из того же ганглия. Открутите клеточную суспензию с помощью центрифуги ротора качающегося ковша в течение 10 мин, 300 × г при комнатной температуре. Осторожно выбросьте супернатант клетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку ганглионарные клетки диссоциированы от одного ганглия, клеточная гранула может быть слишком маленькой, чтобы ее можно было обнаружить на глаз; небольшое количество супернатанта можно оставить в трубке, чтобы избежать случайного удаления гранулы клетки. - Повторно суспендируют ганглионарные клетки в 270 мкл фетальной бычьей сыворотки (FBS, низкий эндотоксин) и переносят каждую клеточную суспензию FBS в криовиал 1 мл.
- Чтобы подсчитать клетки, смешайте 5 мкл суспензии ганглионных клеток с 5 мкл 0,4% красителя трипанового синего цвета и загрузите смесь в гемоцитометр. Подсчитайте общее количество и количество живых клеток под микроскопом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Жизнеспособность клеток (количество живых клеток / общее количество клеток = жизнеспособность %) обычно превышает 90% с этим протоколом диссоциации. Количество живых клеток одного ганглия (SCG или StG) обычно находится в диапазоне 9000-60 000 клеток, когда ганглий изолирован от мыши в возрасте от 12 до 16 недель. - Добавьте 30 мкл диметилсульфоксида (DMSO) к каждой клеточной суспензии FBS в криовиалах, хорошо перемешайте и перенесите криовиалы в контейнер для замораживания клеток, который хранится при комнатной температуре. Храните криовиальный загруженный контейнер при -80 °C в течение ночи и перенесите криовиалы в жидкий азот на следующий день для длительного хранения перед секвенированием.
5. Изоляция ядра
ПРИМЕЧАНИЕ: Левый и правый SCG, выделенные из четырех мышей (в общей сложности 8 образцов), были использованы в качестве примера в следующей подготовке к выделению ядра и секвенированию. Держите все на льду в течение всей процедуры. Из-за невидимости мелких гранул ядра настоятельно рекомендуется центрифуга с качающимися ведрами для облегчения удаления супернатанта на протяжении всей процедуры.
- Подготовьте 15 мл пробирок с сетчатым фильтром (30 мкм) сверху и предварительно промыть ситечко 1 мл ганглиозной среды.
- Извлеките криовиалы из жидкого азота и немедленно разморозьте их на водяной бане при 37 °C. Когда небольшая гранула льда останется в криовиале, выньте криовиалы из водяной бани.
- Восстановите ганглионарные клетки, опустив 1 мл ганглиозной среды в каждый криовиал, осторожно встряхиваясь вручную. Необязательно: Для оценки восстановления клеток смешайте клеточную суспензию после восстановления и возьмите 5 мкл клеточной суспензии для подсчета живых клеток, как описано на этапе 4.8.
- Загрузите каждую суспензию ганглионных клеток на отдельное ситечко (подготовленное на этапе 5.1) и промойте каждый сетчатый фильтр 4-5 мл ганглионной среды.
- Центрифугируют суспензию процеженных клеток в течение 5 мин при 300 × г, осторожно удаляют надосадочный агент и повторно суспендируют клетки в 50 мкл буфера промывки клеток.
- Переведите клеточную суспензию в низкосвязанную трубку ДНК/РНК 0,5 мл микроцентрифуги.
- Центрифугируют клеточную суспензию при 500 × г в течение 5 мин при 4 °С.
- Удалите 45 мкл супернатанта, не касаясь нижней части трубки, чтобы избежать смещения гранулы клетки.
- Добавьте 45 мкл охлажденного лизисного буфера и аккуратно пипетку вверх и вниз, используя наконечник пипетки объемом 200 мкл.
- Инкубировать клетки в течение 8 мин на льду.
- Добавьте 50 мкл буфера промывки холодного ядра в каждую трубку. Не перемешивать.
- Центрифугируют суспензию ядра при 600 × г в течение 5 мин при 4 °С.
- Удалите 95 мкл супернатанта, не нарушая гранулу ядра.
- Добавьте 45 мкл охлажденного буфера промывки ядра в гранулу. Необязательно: Возьмите 5 мкл суспензии ядра, смешайте с 5 мкл 0,4% трипан-синего цвета для подсчета и проверьте качество ядер под микроскопом с помощью гемоцитометра.
- Центрифугируют суспензию ядра при 600 × г в течение 5 мин при 4 °С.
- Удалите супернатант, не касаясь нижней части трубки, чтобы избежать смещения гранулы ядра.
6. Штрих-кодирование ядра с хэштегом oligos (HTO) и мультиплексирование
ПРИМЕЧАНИЕ: Этапы окрашивания HTO были модифицированы и оптимизированы для ядерной маркировки очень низких количеств (ганглионарных) ядер в соответствии с предыдущим применением в кортикальной ткани Gaublomme et al.15.
- Добавьте 50 мкл буфера ST-SB к грануле ядра, осторожно пипетку 8-10 раз, пока ядра не будут полностью повторно суспендированы.
- Добавьте 5 мкл fc-блокирующего реагента на 50 мкл смеси ST-SB/ядра и инкубируйте в течение 10 мин на льду.
- Добавьте 1 мкл (0,5 мкг) одноядерного хэштег-антитела на пробирку смеси ST-SB/ядер и инкубируйте в течение 30 мин на льду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Более короткое время инкубации приводит к снижению эффективности маркировки хэштегов, как показано в репрезентативных результатах. - Добавьте 100 мкл ST-SB в каждую пробирку. Не перемешивать.
- Центрифугируют суспензию ядра в течение 5 мин, 600 × г при 4 °С.
- Удалите 145 мкл супернатанта, не нарушая гранулу ядра.
- Повторите шаги 6.4 и 6.5. Удалите супернатант как можно больше, не касаясь дна трубки, чтобы избежать смещения гранулы ядра.
- Повторно суспендируют гранулу ядра в 50 мкл ST-SB и аккуратно перемешивают ядра.
- Возьмите 5 мкл суспензии ядра и смешайте его с 5 мкл 0,4% трипан-синего цвета, чтобы подсчитать ядра под микроскопом. См. рисунок 3А для репрезентативного изображения ядер, смешанных с трипановым синим и загруженных в гемоцитометр.
- Центрифугируют суспензию ядра в течение 5 мин при 600 × г при 4 °С.
- Повторное суспендирование ядер в ST-SB для достижения целевой концентрации ядра 1000-3000 ядер/мкл для каждого образца в соответствии с соответствующим количеством ядер.
- Объедините образцы для достижения требуемого количества ячеек.
ПРИМЕЧАНИЕ: Например, в этом эксперименте 8 образцов были одинаково объединены для достижения в общей сложности 25 000 ядер, чтобы немедленно перейти к 10-кратному геномике хрома и snRNA-seq после этого. Количество ядер обычно находится в пределах 6000-40000 клеток, когда ганглий изолирован от мыши в возрасте от 12 до 16 недель. Только около половины от общего количества нагруженных ядер может быть захвачено snRNA-seq на основе капель. Например, смесь из 25 000 ядер была подготовлена для обеспечения захвата 10 000 ядер, что необходимо для дальнейшей подготовки библиотеки и секвенирования.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Анализ контроля качества подготовки библиотеки одноядерных кДНК и snRNA-seq
Репрезентативные результаты описывают результаты секвенирования 10 000 захваченных ядер в одном пуле с библиотекой 25 000 считываний / экспрессии генов ядра и библиотекой хэштегов 5000 чтений / ядра. Рисунок 3B иллюстрирует результаты контроля качества1-й цепи кДНК, библиотеки экспрессии генов (GEX) и библиотеки HTO, которые были проверены с помощью биоанализатора. Ожидается, что кДНА, ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Здесь описан подробный протокол, который фокусируется на i) рассечении верхних шейных и звездчатых симпатических ганглиев взрослой мыши, ii) изоляции и криоконсервации ганглионарных клеток, iii) выделении ядра и iv) штрих-кодировании ядра с маркировкой HTO для целей мультиплексирования и snRNA-seq.
С помощью этого протокола симпатические ганглионарные клетки могут быть легко получены путем диссоциации отдельных ганглиев с использованием обычно используемых трипсина и коллагеназы. Длительное со...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.
Благодарности
Мы благодарим Сьюзан Л. Клоэт (Департамент генетики человека, LUMC, Лейден, Нидерланды) за ее помощь в экспериментальном проектировании и полезных дискуссиях. Мы благодарим Emile J. de Meijer (Департамент генетики человека, LUMC, Лейден, Нидерланды) за помощь в выделении одноядерной РНК и подготовке библиотеки к секвенированию. Эта работа поддерживается Нидерландской организацией научных исследований (NWO) [016.196.346 to M.R.M.J.].
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| <сильно>Химикаты и реагенты | |||
| 0,25% Трипсин-ЭДТА | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| 0,4% трипановый синий краситель | Bio-Rad | 1450021 | |
| антибиотик-антимикотик | Gibco | 15240096 | |
| B-27 | Gibco | A3582801 | |
| коллагеназа 2 типа | Worthington | LS004176 | использовать 1,400 Ед/мл |
| диметилсульфоксида | Sigma Aldrich | 67685 | |
| Абсолютный этанол ≥ 99,5% | VWR | VWRC83813.360 | |
| Фетальная бычья сыворотка (с низким содержанием эндотоксина) | Biowest | S1810-500 | |
| L-глутамин | Thermo Fisher Scientific | 25030024 | |
| Нейробазальная среда | Gibco | 21103049 | |
| бычьей сыворотки Альбумин 10% | Sigma-Aldrich | A1595-50ML | Буфер для промывки клеток |
| DPBS (Ca2+, Mg2+free) | Gibco | 14190-169 | Буфер для промывки клеток |
| Раствор хлорида магния, 1 M | Sigma-Aldrich | M1028 | Буфер для лизиса ядра |
| Nonidet P40 Substitute (неионогенное моющее средство) | Sigma-Aldrich | 74385 | Буфер для лизиса ядра |
| Вода без нуклеазы (не обработанная DEPC) | Invitrogen | AM9937 | Буфер |
| для лизиса ядраИнгибитор протекторной РНКазы, 40 ЕД/&м; L | Sigma-Aldrich | 3335399001 | Nucleus Lysis Buffer |
| Sodium Chloride Solution, 5 M | Sigma-Aldrich | 59222C | Nucleus Lysis Buffer |
| Trizma Hydrochloride Solution, 1 M, pH 7,4 | Sigma-Aldrich | T2194 | Nucleus Lysis Buffer |
| Borum Сывороточный альбумин 10% | Sigma-Aldrich | A1595-50ML | Nucleus Wash |
| DPBS (Ca2+, мг< sup>2+free) | Gibco | 14190-169 | Nucleus |
| Wash Protector РНКазный ингибитор, 40 U/µ L | Sigma-Aldrich | 3335399001 | Nucleus wash |
| Бычий сывороточный альбумин 10% | Sigma-Aldrich | A1595-50ML | ST окрашивающий буфер (ST-SB) |
| Раствор хлорида кальция, 1 М | Sigma-Aldrich | 21115-100ML | ST окрашивающий буфер (ST-SB) |
| Раствор хлорида магния, 1 М | Сигма-Aldrich | M1028 | ST окрашивающий буфер (ST-SB) |
| Вода, не содержащая нуклеазы (не DEPC обработано) | Invitrogen | AM9937 | ST буфер для окрашивания (ST-SB) |
| Раствор хлорида натрия, 5M | Sigma-Aldrich | 59222C | ST буфер для окрашивания (ST-SB) |
| Раствор тризмы гидрохлорида, 1M, pH 7,4 | Sigma-Aldrich | T2194 | ST буфер для окрашивания (ST-SB) |
| Tween-20 | Merck Millipore | 822184 | ST буфер для окрашивания (ST-SB) |
| TotalSeq-A0451 Антиядерный комплекс пор Белки Хэштег 1 Антитело | Biolegend | 682205 | Хэштег |
| антитело TotalSeq-A0452 Антиядерный комплекс пор Белки Хэштег 2 Антитело | Biolegend | 682207 | Хэштег антитело |
| TotalSeq-A0453 Антиядерный комплекс пор Белки Хэштег 3 Антитело | Biolegend | 682209 | Хэштег антитело |
| TotalSeq-A0461 Антиядерный комплекс пор Белки Хэштег 11 Антитело | Biolegend | 682225 | Хэштег |
| антитело TotalSeq-A0462 Антиядерный комплекс пор Белки Хэштег 12 Антитело | Biolegend | 682227 | Хэштег |
| антитело TotalSeq-A0463 Антиядерный комплекс пор Белки Хэштег 13 Антитело | Biolegend | 682229 | Хэштег антитело |
| TotalSeq-A0464 Антиядерный комплекс пор Белки Хэштег 14 Антитело | Biolegend | 682231 | Хэштег |
| антитело TotalSeq-A0465 Антиядерный комплекс пор Белки Хэштег 15 Антитело | Biolegend | 682233 | Хэштег |
| антитело TruStain FcX (человек) | Biolegend | 422302 | раствор для блокировки рецепторов FC |
| Оборудование и расходные материалы | |||
| Bright-Line Гемацитометр | Merck | Z359629-1EA | |
| Centrifuge 5702/R A-4-38 | Eppendorf | ||
| Контейнер для заморозки клеток CoolCell LX | Corning | CLS432003-1EA | |
| Cryovial | Thermo Scientific | 479-6840 | |
| DNA LoBind 0,5 мл Eppendorf Tube Eppendorf | EP0030108035-250EA | ||
| Eppendorf Safe-Lock Tubes 1,5 мл | Eppendorf | 30121872 | |
| Falcon 35 мм Не обработанная TC чашка Петри | Corning | ||
| Falcon 15 мл конические центрифужные трубки | Fisher scientific | 10773501 | |
| щипцы Dumont #5 | Инструменты для тонкой науки | 11252-40 | |
| Закаленные ножницы | для тонкой науки | 14091-09 | |
| Сковорода для льда, прямоугольная 4 л Оранжевый | Corning | CLS432106-1EA | |
| Leica MS5 | Микроскоп | Leica | |
| Moria MC50 Ножницы | тонкой науки | 15370-50 | |
| Пружинные ножницы Noyes Инструменты | точной науки | 15012-12 | |
| Olympus CK2 ULWCD | Микроскоп Olympus | ||
| P10 | Gilson | F144802 | |
| P1000 | Gilson | F123602 | |
| P200 | Gilson | F123601 | |
| фильтры предварительной сепарации (30 & микро; m) | Miltenyi biotec | Miltenyi biotec130-041-407 | |
| Встряхивающая водяная баня | GFL | 1083 | |
| Силиконовая пластина | RubberBV | 3530 | Доска для препарирования |
| Программное обеспечение и пакеты | |||
| Cell ranger | V4.0.0 | ||
| Программирование | V4.1.1 | ||
| R sudio | V1.3.1073 | ||
| Seurat | V4.0 | ||
| tydiverse | V1.3.1 | ||
| Animals | |||
| B6. мышь Cg-Tg(Wnt1-cre)2Sor/J мышь | The Jackson Laboratory | JAX stock #022501 | |
| B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J мышь | The Jackson Laboratory | JAX stock #007576 | |
| C57BL/6J мыши | Charles River | ||
| Код для анализа данных | |||
Ссылки
- McCorry, L. K. Physiology of the autonomic nervous system. American Journal of Pharmaceutical Education. 71 (4), 78(2007).
- Li, C. -Y., Li, Y. -G. Cardiac sympathetic nerve sprouting and susceptibility to ventricular arrhythmias after myocardial infarction. Cardiology Research and Practice. 2015, 698368(2015).
- Ajijola, O. A., et al. Extracardiac neural remodeling in humans with cardiomyopathy. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 5 (5), 1010(2012).
- Nguyen, B. L., et al. Acute myocardial infarction induces bilateral stellate ganglia neural remodeling in rabbits. Cardiovascular Pathology. 21 (3), 143-148 (2012).
- Ajijola, O. A., et al. Remodeling of stellate ganglion neurons after spatially targeted myocardial infarction: Neuropeptide and morphologic changes. Heart Rhythm. 12 (5), 1027-1035 (2015).
- Han, S., et al. Electroanatomic remodeling of the left stellate ganglion after myocardial infarction. Journals of the American College of Cardiology. 59 (10), 954-961 (2012).
- Zeisel, A., et al. Molecular architecture of the mouse nervous system. Cell. 174 (4), 999-1014 (2018).
- Svensson, V., Vento-Tormo, R., Teichmann, S. A. Exponential scaling of single-cell RNA-seq in the past decade. Nature Protocols. 13 (4), 599-604 (2018).
- Li, C. L., et al. Somatosensory neuron types identified by high-coverage single-cell RNA-sequencing and functional heterogeneity. Cell Research. 26 (8), 967(2016).
- Kokubun, S., et al. Distribution of TRPV1 and TRPV2 in the human stellate ganglion and spinal cord. Neuroscience Letters. 590, 6-11 (2015).
- Lake, B. B., et al. A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys. Nature Communication. 10 (1), 2832(2019).
- Petrany, M. J., et al. Single-nucleus RNA-seq identifies transcriptional heterogeneity in multinucleated skeletal myofibers. Nature Communication. 11 (1), 6374(2020).
- Wu, H., Kirita, Y., Donnelly, E. L., Humphreys, B. D. Advantages of single-nucleus over single-cell RNA sequencing of adult kidney: rare cell types and novel cell states revealed in fibrosis. Journal of the American Society of Nephrology. 30 (1), 23-32 (2019).
- Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. PLoS One. 13 (12), 0209648(2018).
- Gaublomme, J. T., et al. Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics. Nature Communications. 10 (1), 2907(2019).
- Zandstra, T. E., et al. Asymmetry and heterogeneity: part and parcel in cardiac autonomic innervation and function. Frontiers in Physiology. 12, 665298(2021).
- Lewis, A. E., Vasudevan, H. N., O'Neill, A. K., Soriano, P., Bush, J. O. The widely used Wnt1-Cre transgene causes developmental phenotypes by ectopic activation of Wnt signaling. Developmental Biology. 379 (2), 229-234 (2013).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Stuart, T., et al. Comprehensive integration of single cell data. bioRxiv. , (2018).
- Avraham, O., et al. Satellite glial cells promote regenerative growth in sensory neurons. Nature Communications. 11 (1), 4891(2020).
- Stoeckius, M., et al. Cell Hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biology. 19 (1), 224(2018).
- Lacar, B., et al. Nuclear RNA-seq of single neurons reveals molecular signatures of activation. Nature Communications. 7 (1), 11022(2016).
- Lake, B. B., et al. A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA. Scientific Reports. 7 (1), 6031(2017).
- Grindberg, R. V., et al. RNA-sequencing from single nuclei. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (49), 19802-19807 (2013).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
