Методическая статья

Изоляция и мультиплексирование ядра со штрихкодированными антителами симпатических ганглиев мыши для секвенирования одноядерной РНК

DOI:

10.3791/63397

⸱

23 марта 2022 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomy & Embryology, Leiden University Medical Center, 2Department of Cardiology, Leiden University Medical Center, 3Department of Medical Statistics and Bioinformatics, Leiden University Medical Center

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает подробную, низковходную пробоподготовку для секвенирования с одним ядром, включая рассечение верхних цервикальных и звездчатых ганглиев мыши, диссоциацию клеток, криоконсервацию, выделение ядра и штрих-кодирование хэштегов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сердечная вегетативная нервная система имеет решающее значение для контроля сердечной функции, такой как частота сердечных сокращений и сократимость сердца, и делится на симпатическую и парасимпатическую ветви. Как правило, существует баланс между этими двумя ветвями для поддержания гомеостаза. Однако состояния сердечных заболеваний, такие как инфаркт миокарда, сердечная недостаточность и гипертония, могут вызывать ремоделирование клеток, участвующих в сердечной иннервации, что связано с неблагоприятным клиническим исходом.

Хотя существует огромное количество данных о гистологической структуре и функции сердечной вегетативной нервной системы, ее молекулярно-биологическая архитектура в здоровье и болезнях все еще загадочна во многих аспектах. Новые технологии, такие как секвенирование одноклеточной РНК (scRNA-seq), обещают генетическую характеристику тканей с одноклеточным разрешением. Однако относительно большой размер нейронов может препятствовать стандартизированному использованию этих методов. Здесь этот протокол использует секвенирование одноядерной РНК на основе капель (snRNA-seq), метод характеристики биологической архитектуры сердечных симпатических нейронов в здоровье и болезни. Продемонстрирован поэтапный подход для выполнения snRNA-seq двустороннего верхнего шейного (SCG) и звездчатого ганглия (StG), рассеченных у взрослых мышей.

Этот метод обеспечивает долгосрочное сохранение образцов, поддерживая адекватное качество РНК, когда образцы от нескольких людей / экспериментов не могут быть собраны все сразу в течение короткого периода времени. Штрих-кодирование ядер с помощью хэштегов oligos (HTO) позволяет демультиплексировать и отслеживать отдельные ганглионные образцы после секвенирования. Последующие анализы выявили успешный захват ядер нейрональных, спутниковых глиальных и эндотелиальных клеток симпатических ганглиев, что подтверждается snRNA-seq. Таким образом, этот протокол обеспечивает поэтапный подход к snRNA-seq симпатических внешних сердечных ганглиев, метод, который имеет потенциал для более широкого применения в исследованиях иннервации других органов и тканей.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Вегетативная нервная система (ВНС) является важнейшей частью периферической нервной системы, которая поддерживает гомеостаз организма, включая адаптацию к условиям окружающей среды и патологии1. Он участвует в регуляции нескольких систем органов по всему телу, таких как сердечно-сосудистая, дыхательная, пищеварительная и эндокринная системы. ВНС делится на симпатическую и парасимпатическую ветви. Спинномозговые ветви симпатической нервной системы синапс в ганглиях симпатической цепи, расположенные двусторонне в паравертебральном положении. Двусторонние шейные и грудные ганглии, особенно StG, являются важными компонентами, участвующими в сердечной симпатической иннервации. При болезненных состояниях, таких как ишемия сердца, может произойти ремоделирование нейронов, что приводит к симпатическому овердрайву2. Ремоделирование нейронов было продемонстрировано в нескольких гистологических исследованиях на людях и нескольких других видах животных 3,4,5,6. Подробная биологическая характеристика ремоделирования нейронов, вызванного ишемией сердца, в сердечных симпатических ганглиях в настоящее время отсутствует, а фундаментальные биологические характеристики специализированных типов нейрональных клеток или подтипов в сердечной симпатической нервной системе (SNS) еще не полностью определены при здоровье и заболевании7.

Новые технологии, такие как scRNA-seq, открыли шлюзы для генетической характеристики мелких тканей на одноклеточном уровне 8,9. Однако относительно большой размер нейронов может препятствовать оптимизированному использованию этих одноклеточных методов у людей10. Кроме того, секвенирование одной клетки требует высокой пропускной способности клеток для восстановления достаточного количества клеток из-за высоких потерь в процессе секвенирования. Это может оказаться сложной задачей при изучении небольших тканей, которые трудно захватить за один сеанс и требуют нескольких образцов для введения достаточного количества одиночных клеток для секвенирования. Недавно разработанная технология snRNA-seq на основе капель (то есть платформа 10x Chromium) позволяет изучать биологические различия между одиночными ядрами11,12. snRNA-seq имеет преимущество перед scRNA-seq для крупных клеток (>30 мкм), которые не могут быть захвачены в Gel Bead in Emulsions (GEMs), а также улучшенную совместимость с обширной диссоциацией и/или длительным сохранением 13,14,15.

Гетерогенность, количество нейрональных клеток и других клеток, обогащенных сердечными СНС, являются важными аспектами для характеристики ВНС в состояниях здоровья и заболевания. Кроме того, органная или региональная иннервация каждым симпатическим ганглием способствует усложнению СНС. Кроме того, было показано, что шейные, звездчатые и грудные ганглии симпатической цепи иннервируют различные области сердца16. Поэтому необходимо выполнить одноядерный анализ ганглионарных клеток, полученных из отдельных ганглиев, для изучения их биологической архитектуры.

SnRNA-seq на основе капель позволяет профилировать экспрессию транскриптома для пула из тысяч клеток из нескольких образцов одновременно с более низкими затратами, чем платформы секвенирования на основе пластин. Этот подход позволяет snRNA-seq на основе капель быть более подходящим для классификации клеточного фенотипа и новой субпопуляционной идентификации клеток в SCG и StG. Примечательно, что этот протокол обеспечивает краткий поэтапный подход к идентификации, выделению и секвенированию одноядерной РНК симпатических внешних сердечных ганглиев, метод, который имеет потенциал для широкого применения в исследованиях характеристик ганглиев, иннервирующих другие связанные органы и ткани в здоровье и болезни.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает все этапы, необходимые для snRNA-seq цервикальных и/или шейно-цервикоторакальных (звездчатых) ганглиев. Использовались самки и самцы мышей C57BL/6J (15 недель, n = 2 для каждого пола). Одна дополнительная мышь Wnt1-Cre;mT/mG была использована для визуализации ганглиев в целях рассечения17,18. Эта дополнительная мышь была получена путем скрещивания мыши B6.Cg-Tg(Wnt1-cre)2Sor/J и мыши B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J мыши. Все эксперименты на животных проводились в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных, опубликованным NIH и одобренным Комитетом по этике животных Лейденского университета (номер лицензии AVD1160020185325, Лейден, Нидерланды). Смотрите Таблицу материалов для получения подробной информации обо всех материалах, оборудовании, программном обеспечении и животных, используемых в протоколе.

1. Препараты

ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы выполняются в шкафу для клеточного культивирования.

  1. Очистите щипцы и ножницы, погружая инструменты в 70% этанол на 20 минут.
  2. Приготовьте ганглиозную среду, состоящую из нейробазальной среды, дополненной B-27 плюс (1x), L-глютамином (2 мМ) и 1% антибиотиком-антимикотиком. Предгреть ганглиозную среду при комнатной температуре.
  3. Готовят раствор для пищеварения: 0,25% трипсин-ЭДТА (1:1) и 1 400 Ед/мл коллагеназы типа 2, растворенной в ганглиозной среде.
  4. Подготовьте свежий, холодный (4 °C) буфер промывки клеток (0,4% бычьего сывороточного альбумина [BSA]) и буфер лизиса (10 мМ Tris-HCl, 10 мМ NaCl, 3 мМ MgCl2 и 0,1% неионного моющего средства, 40 ЕД/мл РНКАзы в воде без нуклеазы) для выделения ядра.
  5. Приготовьте буфер промывки ядра (1x фосфатно-буферный физиологический раствор [PBS] с 2,0% BSA и ингибитором РНКазы 0,2U/μL).
  6. Готовят буфер окрашивания ST (ST-SB) (10 мМ Tris-HCl, 146 мМ NaCl, 21 мМ MgCl2, 1 мМ CaCl2, 2% BSA, 0,02% Tween-20 в воде без нуклеазы).

2. Рассечение верхних шейных ганглиев взрослой мыши (SCG)

  1. Усыплите мышей и держите их на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В текущем исследовании в общей сложности 4 мыши C57BL6 / J были усыплены асфиксией CO2 . Альтернативно, изофлуран может быть использован с последующей экссангинацией, когда необходимо собрать большое количество крови для других целей исследования.
  2. Закрепите мышь на рассеченной доске булавками и обливайте ее 70% этанолом, чтобы свести к минимуму диспергирование шерсти (бритье не требуется).
  3. Под стереомикроскопом откройте кожу области шеи, сделав ножницами разреза по средней линии, отодвиньте подчелюстные железы в сторону и удалите стерномастоидную мышцу, чтобы обнажить и найти общую сонную артерию и ее бифуркацию (рисунок 1A, B, см. стрелку).
  4. Рассекают бифуркацию правой и левой сонной артерии и прикрепленную к ней ткань. Переложите каждый рассеченный кусочек ткани в отдельную чашку Петри размером 3,5 см, содержащую холодный PBS.
  5. Ищите SCG, прикрепленный к бифуркации сонной артерии. Очистите SCG дальше, удалив артерию и другую прикрепленную ткань в чашке Петри (рисунок 1E).

3. Рассечение звездчатых ганглиев взрослых мышей (StG)

  1. Чтобы рассечь StG, сделайте средний разрез в брюшной полости с последующим открытием диафрагмы и вентральной грудной стенки.
  2. Удалите сердце и легкие, чтобы обнажить спинную грудную клетку. Ищите левый и правый StG anterolateral к musculus colli longus (MCL) на уровне первого ребра (рисунок 1C, D, обозначен пунктирными линиями).
  3. Рассекните как левый, так и правый StG щипцами и отдельно перенесите их на 3,5 см чашки Петри, содержащие холодный PBS (рисунок 1F).
    ​

4. Выделение и криоконсервация ганглионарных клеток мыши

Шаги 4-6 обобщены на рисунке 2.

  1. Аккуратно перенесите все отдельные SCG и StG в отдельные микроцентрифужные трубки объемом 1,5 мл с щипцами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте наконечники пипеток для переноса ганглиев, потому что ганглии склонны прилипать к стенке пластиковых наконечников пипеток.
  2. Добавьте 500 мкл 0,25% раствора трипсина-ЭДТА в каждую микроцентрифужную трубку и инкубируйте на встряхивающей водяной бане при 37 °C в течение 40 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап направлен на облегчение пищеварения и высвобождения клеток в растворе коллагеназы типа 2.
  3. Подготовьте пробирку объемом 15 мл, содержащую 5 мл ганглиозной среды для каждого образца. Дайте ганглиям осесть на дне микроцентрифужных трубок. Соберите супернатант, который содержит очень мало ганглионарных клеток, перенесите супернатант в подготовленные 15 мл пробирки и пометьте каждую трубку. В качестве альтернативы, чтобы сэкономить некоторое время, аспирировать супернатант трипсина-ЭДТА без сбора, так как в нем может быть обнаружено очень мало диссоциированных клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Небольшое количество раствора трипсина-ЭДТА (~10-30 мкл) можно оставить в микроцентрифужной трубке, чтобы избежать удаления ганглиев. Избегайте пипетирования на этом этапе, потому что это может повредить ганглии и привести к низкому выходу ганглионарных клеток впоследствии.
  4. Добавьте 500 мкл раствора коллагеназы типа 2 в каждую микроцентрифужную трубку и вылейте на встряхивающей водяной бане при 37 °C в течение 35-40 мин. Попробуйте повторно суспендировать ганглий через 35 мин; если ганглий еще неповрежден и не диссоциирует, при необходимости продлевают время инкубации или увеличивают концентрацию раствора коллагеназы 2 типа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации может варьироваться в зависимости от размера ганглия.
  5. Повторное суспендирование ганглиев в растворе коллагеназы путем пипетки вверх и вниз ~ 10 раз или до тех пор, пока сгустки тканей больше не обнаруживаются.
  6. Перенесите клеточную суспензию в ранее использованную трубку объемом 15 мл, которая содержит глоглиевую культуральную среду и суспензию трипсина-ЭДТА из того же ганглия. Открутите клеточную суспензию с помощью центрифуги ротора качающегося ковша в течение 10 мин, 300 × г при комнатной температуре. Осторожно выбросьте супернатант клетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку ганглионарные клетки диссоциированы от одного ганглия, клеточная гранула может быть слишком маленькой, чтобы ее можно было обнаружить на глаз; небольшое количество супернатанта можно оставить в трубке, чтобы избежать случайного удаления гранулы клетки.
  7. Повторно суспендируют ганглионарные клетки в 270 мкл фетальной бычьей сыворотки (FBS, низкий эндотоксин) и переносят каждую клеточную суспензию FBS в криовиал 1 мл.
  8. Чтобы подсчитать клетки, смешайте 5 мкл суспензии ганглионных клеток с 5 мкл 0,4% красителя трипанового синего цвета и загрузите смесь в гемоцитометр. Подсчитайте общее количество и количество живых клеток под микроскопом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Жизнеспособность клеток (количество живых клеток / общее количество клеток = жизнеспособность %) обычно превышает 90% с этим протоколом диссоциации. Количество живых клеток одного ганглия (SCG или StG) обычно находится в диапазоне 9000-60 000 клеток, когда ганглий изолирован от мыши в возрасте от 12 до 16 недель.
  9. Добавьте 30 мкл диметилсульфоксида (DMSO) к каждой клеточной суспензии FBS в криовиалах, хорошо перемешайте и перенесите криовиалы в контейнер для замораживания клеток, который хранится при комнатной температуре. Храните криовиальный загруженный контейнер при -80 °C в течение ночи и перенесите криовиалы в жидкий азот на следующий день для длительного хранения перед секвенированием.

5. Изоляция ядра

ПРИМЕЧАНИЕ: Левый и правый SCG, выделенные из четырех мышей (в общей сложности 8 образцов), были использованы в качестве примера в следующей подготовке к выделению ядра и секвенированию. Держите все на льду в течение всей процедуры. Из-за невидимости мелких гранул ядра настоятельно рекомендуется центрифуга с качающимися ведрами для облегчения удаления супернатанта на протяжении всей процедуры.

  1. Подготовьте 15 мл пробирок с сетчатым фильтром (30 мкм) сверху и предварительно промыть ситечко 1 мл ганглиозной среды.
  2. Извлеките криовиалы из жидкого азота и немедленно разморозьте их на водяной бане при 37 °C. Когда небольшая гранула льда останется в криовиале, выньте криовиалы из водяной бани.
  3. Восстановите ганглионарные клетки, опустив 1 мл ганглиозной среды в каждый криовиал, осторожно встряхиваясь вручную. Необязательно: Для оценки восстановления клеток смешайте клеточную суспензию после восстановления и возьмите 5 мкл клеточной суспензии для подсчета живых клеток, как описано на этапе 4.8.
  4. Загрузите каждую суспензию ганглионных клеток на отдельное ситечко (подготовленное на этапе 5.1) и промойте каждый сетчатый фильтр 4-5 мл ганглионной среды.
  5. Центрифугируют суспензию процеженных клеток в течение 5 мин при 300 × г, осторожно удаляют надосадочный агент и повторно суспендируют клетки в 50 мкл буфера промывки клеток.
  6. Переведите клеточную суспензию в низкосвязанную трубку ДНК/РНК 0,5 мл микроцентрифуги.
  7. Центрифугируют клеточную суспензию при 500 × г в течение 5 мин при 4 °С.
  8. Удалите 45 мкл супернатанта, не касаясь нижней части трубки, чтобы избежать смещения гранулы клетки.
  9. Добавьте 45 мкл охлажденного лизисного буфера и аккуратно пипетку вверх и вниз, используя наконечник пипетки объемом 200 мкл.
  10. Инкубировать клетки в течение 8 мин на льду.
  11. Добавьте 50 мкл буфера промывки холодного ядра в каждую трубку. Не перемешивать.
  12. Центрифугируют суспензию ядра при 600 × г в течение 5 мин при 4 °С.
  13. Удалите 95 мкл супернатанта, не нарушая гранулу ядра.
  14. Добавьте 45 мкл охлажденного буфера промывки ядра в гранулу. Необязательно: Возьмите 5 мкл суспензии ядра, смешайте с 5 мкл 0,4% трипан-синего цвета для подсчета и проверьте качество ядер под микроскопом с помощью гемоцитометра.
  15. Центрифугируют суспензию ядра при 600 × г в течение 5 мин при 4 °С.
  16. Удалите супернатант, не касаясь нижней части трубки, чтобы избежать смещения гранулы ядра.

6. Штрих-кодирование ядра с хэштегом oligos (HTO) и мультиплексирование

ПРИМЕЧАНИЕ: Этапы окрашивания HTO были модифицированы и оптимизированы для ядерной маркировки очень низких количеств (ганглионарных) ядер в соответствии с предыдущим применением в кортикальной ткани Gaublomme et al.15.

  1. Добавьте 50 мкл буфера ST-SB к грануле ядра, осторожно пипетку 8-10 раз, пока ядра не будут полностью повторно суспендированы.
  2. Добавьте 5 мкл fc-блокирующего реагента на 50 мкл смеси ST-SB/ядра и инкубируйте в течение 10 мин на льду.
  3. Добавьте 1 мкл (0,5 мкг) одноядерного хэштег-антитела на пробирку смеси ST-SB/ядер и инкубируйте в течение 30 мин на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Более короткое время инкубации приводит к снижению эффективности маркировки хэштегов, как показано в репрезентативных результатах.
  4. Добавьте 100 мкл ST-SB в каждую пробирку. Не перемешивать.
  5. Центрифугируют суспензию ядра в течение 5 мин, 600 × г при 4 °С.
  6. Удалите 145 мкл супернатанта, не нарушая гранулу ядра.
  7. Повторите шаги 6.4 и 6.5. Удалите супернатант как можно больше, не касаясь дна трубки, чтобы избежать смещения гранулы ядра.
  8. Повторно суспендируют гранулу ядра в 50 мкл ST-SB и аккуратно перемешивают ядра.
  9. Возьмите 5 мкл суспензии ядра и смешайте его с 5 мкл 0,4% трипан-синего цвета, чтобы подсчитать ядра под микроскопом. См. рисунок 3А для репрезентативного изображения ядер, смешанных с трипановым синим и загруженных в гемоцитометр.
  10. Центрифугируют суспензию ядра в течение 5 мин при 600 × г при 4 °С.
  11. Повторное суспендирование ядер в ST-SB для достижения целевой концентрации ядра 1000-3000 ядер/мкл для каждого образца в соответствии с соответствующим количеством ядер.
  12. Объедините образцы для достижения требуемого количества ячеек.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Например, в этом эксперименте 8 образцов были одинаково объединены для достижения в общей сложности 25 000 ядер, чтобы немедленно перейти к 10-кратному геномике хрома и snRNA-seq после этого. Количество ядер обычно находится в пределах 6000-40000 клеток, когда ганглий изолирован от мыши в возрасте от 12 до 16 недель. Только около половины от общего количества нагруженных ядер может быть захвачено snRNA-seq на основе капель. Например, смесь из 25 000 ядер была подготовлена для обеспечения захвата 10 000 ядер, что необходимо для дальнейшей подготовки библиотеки и секвенирования.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Анализ контроля качества подготовки библиотеки одноядерных кДНК и snRNA-seq
Репрезентативные результаты описывают результаты секвенирования 10 000 захваченных ядер в одном пуле с библиотекой 25 000 считываний / экспрессии генов ядра и библиотекой хэштегов 5000 чтений / ядра. Рисунок 3B иллюстрирует результаты контроля качества1-й цепи кДНК, библиотеки экспрессии генов (GEX) и библиотеки HTO, которые были проверены с помощью биоанализатора. Ожидается, что кДНА, ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь описан подробный протокол, который фокусируется на i) рассечении верхних шейных и звездчатых симпатических ганглиев взрослой мыши, ii) изоляции и криоконсервации ганглионарных клеток, iii) выделении ядра и iv) штрих-кодировании ядра с маркировкой HTO для целей мультиплексирования и snRNA-seq.

С помощью этого протокола симпатические ганглионарные клетки могут быть легко получены путем диссоциации отдельных ганглиев с использованием обычно используемых трипсина и коллагеназы. Длительное со...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Сьюзан Л. Клоэт (Департамент генетики человека, LUMC, Лейден, Нидерланды) за ее помощь в экспериментальном проектировании и полезных дискуссиях. Мы благодарим Emile J. de Meijer (Департамент генетики человека, LUMC, Лейден, Нидерланды) за помощь в выделении одноядерной РНК и подготовке библиотеки к секвенированию. Эта работа поддерживается Нидерландской организацией научных исследований (NWO) [016.196.346 to M.R.M.J.].

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<сильно>Химикаты и реагенты
0,25% Трипсин-ЭДТАThermo Fisher Scientific25200056
0,4% трипановый синий красительBio-Rad1450021
антибиотик-антимикотикGibco15240096
B-27GibcoA3582801
коллагеназа 2 типаWorthingtonLS004176использовать 1,400 Ед/мл
диметилсульфоксидаSigma Aldrich67685
Абсолютный этанол ≥ 99,5%VWRVWRC83813.360
Фетальная бычья сыворотка (с низким содержанием эндотоксина)BiowestS1810-500
L-глутаминThermo Fisher Scientific25030024
Нейробазальная средаGibco21103049
бычьей сыворотки Альбумин 10%Sigma-AldrichA1595-50MLБуфер для промывки клеток
DPBS (Ca2+, Mg2+free)Gibco14190-169Буфер для промывки клеток
Раствор хлорида магния, 1 MSigma-AldrichM1028Буфер для лизиса ядра
Nonidet P40 Substitute (неионогенное моющее средство)Sigma-Aldrich74385Буфер для лизиса ядра
Вода без нуклеазы (не обработанная DEPC)InvitrogenAM9937Буфер
для лизиса ядраИнгибитор протекторной РНКазы, 40 ЕД/&м; LSigma-Aldrich3335399001Nucleus Lysis Buffer
Sodium Chloride Solution, 5 MSigma-Aldrich59222CNucleus Lysis Buffer
Trizma Hydrochloride Solution, 1 M, pH 7,4Sigma-AldrichT2194Nucleus Lysis Buffer
Borum Сывороточный альбумин 10%Sigma-AldrichA1595-50MLNucleus Wash
DPBS (Ca2+, мг< sup>2+free)Gibco14190-169Nucleus
Wash Protector РНКазный ингибитор, 40 U/µ LSigma-Aldrich3335399001Nucleus wash
Бычий сывороточный альбумин 10%Sigma-AldrichA1595-50MLST окрашивающий буфер (ST-SB)
Раствор хлорида кальция, 1 МSigma-Aldrich21115-100MLST окрашивающий буфер (ST-SB)
Раствор хлорида магния, 1 МСигма-AldrichM1028ST окрашивающий буфер (ST-SB)
Вода, не содержащая нуклеазы (не DEPC обработано)InvitrogenAM9937ST буфер для окрашивания (ST-SB)
Раствор хлорида натрия, 5MSigma-Aldrich59222CST буфер для окрашивания (ST-SB)
Раствор тризмы гидрохлорида, 1M, pH 7,4Sigma-AldrichT2194ST буфер для окрашивания (ST-SB)
Tween-20Merck Millipore822184ST буфер для окрашивания (ST-SB)
TotalSeq-A0451 Антиядерный комплекс пор Белки Хэштег 1 АнтителоBiolegend682205Хэштег
антитело TotalSeq-A0452 Антиядерный комплекс пор Белки Хэштег 2 АнтителоBiolegend682207Хэштег антитело
TotalSeq-A0453 Антиядерный комплекс пор Белки Хэштег 3 АнтителоBiolegend682209Хэштег антитело
TotalSeq-A0461 Антиядерный комплекс пор Белки Хэштег 11 АнтителоBiolegend682225Хэштег
антитело TotalSeq-A0462 Антиядерный комплекс пор Белки Хэштег 12 АнтителоBiolegend682227Хэштег
антитело TotalSeq-A0463 Антиядерный комплекс пор Белки Хэштег 13 АнтителоBiolegend682229Хэштег антитело
TotalSeq-A0464 Антиядерный комплекс пор Белки Хэштег 14 АнтителоBiolegend682231Хэштег
антитело TotalSeq-A0465 Антиядерный комплекс пор Белки Хэштег 15 АнтителоBiolegend682233Хэштег
антитело TruStain FcX (человек)Biolegend422302раствор для блокировки рецепторов FC
Оборудование и расходные материалы
Bright-Line  ГемацитометрMerckZ359629-1EA
Centrifuge 5702/R A-4-38Eppendorf 
Контейнер для заморозки клеток CoolCell LXCorningCLS432003-1EA
CryovialThermo Scientific479-6840
DNA LoBind 0,5 мл Eppendorf Tube EppendorfEP0030108035-250EA
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1,5 млEppendorf30121872
Falcon 35 мм Не обработанная TC чашка ПетриCorning
Falcon 15 мл конические центрифужные трубкиFisher scientific10773501
щипцы Dumont #5Инструменты для тонкой науки11252-40
Закаленные ножницыдля тонкой науки14091-09
  Сковорода для льда, прямоугольная 4 л ОранжевыйCorningCLS432106-1EA
Leica MS5МикроскопLeica
Moria MC50 Ножницытонкой науки15370-50
Пружинные ножницы Noyes Инструментыточной науки15012-12
Olympus CK2 ULWCDМикроскоп Olympus
P10GilsonF144802
P1000GilsonF123602
P200GilsonF123601
фильтры предварительной сепарации (30 & микро; m)Miltenyi biotecMiltenyi biotec130-041-407
Встряхивающая водяная баняGFL1083
Силиконовая пластинаRubberBV3530Доска для препарирования
Программное обеспечение и пакеты
Cell rangerV4.0.0
ПрограммированиеV4.1.1
R sudioV1.3.1073
SeuratV4.0
tydiverseV1.3.1
Animals
B6. мышь Cg-Tg(Wnt1-cre)2Sor/J мышьThe Jackson LaboratoryJAX stock #022501
B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J мышьThe Jackson LaboratoryJAX stock #007576
C57BL/6J мышиCharles River
Код для анализа данных
EP022629905351008 для для https://github.com/rubenmethorst/Single-cell-SCG_JoVE

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McCorry, L. K. Physiology of the autonomic nervous system. American Journal of Pharmaceutical Education. 71 (4), 78(2007).
  2. Li, C. -Y., Li, Y. -G. Cardiac sympathetic nerve sprouting and susceptibility to ventricular arrhythmias after myocardial infarction. Cardiology Research and Practice. 2015, 698368(2015).
  3. Ajijola, O. A., et al. Extracardiac neural remodeling in humans with cardiomyopathy. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 5 (5), 1010(2012).
  4. Nguyen, B. L., et al. Acute myocardial infarction induces bilateral stellate ganglia neural remodeling in rabbits. Cardiovascular Pathology. 21 (3), 143-148 (2012).
  5. Ajijola, O. A., et al. Remodeling of stellate ganglion neurons after spatially targeted myocardial infarction: Neuropeptide and morphologic changes. Heart Rhythm. 12 (5), 1027-1035 (2015).
  6. Han, S., et al. Electroanatomic remodeling of the left stellate ganglion after myocardial infarction. Journals of the American College of Cardiology. 59 (10), 954-961 (2012).
  7. Zeisel, A., et al. Molecular architecture of the mouse nervous system. Cell. 174 (4), 999-1014 (2018).
  8. Svensson, V., Vento-Tormo, R., Teichmann, S. A. Exponential scaling of single-cell RNA-seq in the past decade. Nature Protocols. 13 (4), 599-604 (2018).
  9. Li, C. L., et al. Somatosensory neuron types identified by high-coverage single-cell RNA-sequencing and functional heterogeneity. Cell Research. 26 (8), 967(2016).
  10. Kokubun, S., et al. Distribution of TRPV1 and TRPV2 in the human stellate ganglion and spinal cord. Neuroscience Letters. 590, 6-11 (2015).
  11. Lake, B. B., et al. A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys. Nature Communication. 10 (1), 2832(2019).
  12. Petrany, M. J., et al. Single-nucleus RNA-seq identifies transcriptional heterogeneity in multinucleated skeletal myofibers. Nature Communication. 11 (1), 6374(2020).
  13. Wu, H., Kirita, Y., Donnelly, E. L., Humphreys, B. D. Advantages of single-nucleus over single-cell RNA sequencing of adult kidney: rare cell types and novel cell states revealed in fibrosis. Journal of the American Society of Nephrology. 30 (1), 23-32 (2019).
  14. Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. PLoS One. 13 (12), 0209648(2018).
  15. Gaublomme, J. T., et al. Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics. Nature Communications. 10 (1), 2907(2019).
  16. Zandstra, T. E., et al. Asymmetry and heterogeneity: part and parcel in cardiac autonomic innervation and function. Frontiers in Physiology. 12, 665298(2021).
  17. Lewis, A. E., Vasudevan, H. N., O'Neill, A. K., Soriano, P., Bush, J. O. The widely used Wnt1-Cre transgene causes developmental phenotypes by ectopic activation of Wnt signaling. Developmental Biology. 379 (2), 229-234 (2013).
  18. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  19. Stuart, T., et al. Comprehensive integration of single cell data. bioRxiv. , (2018).
  20. Avraham, O., et al. Satellite glial cells promote regenerative growth in sensory neurons. Nature Communications. 11 (1), 4891(2020).
  21. Stoeckius, M., et al. Cell Hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biology. 19 (1), 224(2018).
  22. Lacar, B., et al. Nuclear RNA-seq of single neurons reveals molecular signatures of activation. Nature Communications. 7 (1), 11022(2016).
  23. Lake, B. B., et al. A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA. Scientific Reports. 7 (1), 6031(2017).
  24. Grindberg, R. V., et al. RNA-sequencing from single nuclei. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (49), 19802-19807 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Cardiac Autonomic Nervous SystemHashtag OligosMultiplexed SequencingGanglia DissectionNeuronal Cell ClustersSample Preservation

Похожие статьи