Методическая статья

Крупномасштабное автоматизированное производство сфероидов стволовых клеток, полученных из жировой ткани, для 3D-биопечати

2.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/63430

⸱

31 марта 2022 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Nucleus of Multidisciplinary Research in Biology (Numpex-Bio), Federal University of Rio de Janeiro, 2Laboratory of Tissue Bioengineering, National Institute of Metrology, Quality and Technology (Inmetro), 3Post-graduation Program of Translational Biomedicine (Biotrans), Unigranrio, 4Post-graduation Program in Biotechnology, National Institute of Metrology, Quality and Technology (Inmetro), 5Dental School, Fluminense Federal Fluminense

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы описываем крупномасштабное производство сфероидов стромальных/стволовых клеток (ASC) жирового происхождения с использованием автоматизированной системы пипетирования для посева клеточной суспензии, обеспечивая тем самым однородность размера и формы сфероида. Эти сфероиды ASC могут быть использованы в качестве строительных блоков для подходов к 3D-биопечати.

Аннотация

Стромальные/стволовые клетки , полученные из жировой ткани (ИСС), представляют собой субпопуляцию клеток, обнаруженных в стромальной сосудистой фракции подкожной жировой клетчатки человека, признанной классическим источником мезенхимальных стромальных / стволовых клеток. Многие исследования были опубликованы с ASC для подходов тканевой инженерии на основе каркасов, которые в основном изучали поведение этих клеток после их посева на биоактивные каркасы. Тем не менее, появляются подходы без каркаса для инженерии тканей in vitro и in vivo, в основном с использованием сфероидов, чтобы преодолеть ограничения подходов на основе каркасов.

Сфероиды представляют собой 3D-микроткани, образованные процессом самосборки. Они могут лучше имитировать архитектуру и микроокружение нативных тканей, в основном из-за увеличения межклеточных и межклеточных матриксных взаимодействий. В последнее время сфероиды в основном исследуются в качестве моделей заболеваний, исследований скрининга лекарств и строительных блоков для 3D-биопечати. Однако для подходов к 3D-биопечати для биофабрикатирования сложных моделей тканей и органов необходимы многочисленные сфероиды, однородные по размеру и форме. Кроме того, когда сфероиды производятся автоматически, существует мало шансов на микробиологическое загрязнение, повышающее воспроизводимость метода.

Крупномасштабное производство сфероидов считается первым обязательным этапом для разработки линии биофабрикации, которая продолжается в процессе 3D-биопечати и заканчивается полным созреванием тканевой конструкции в биореакторах. Тем не менее, количество исследований, в которых изучалось крупномасштабное производство сфероидов ASC, по-прежнему ограничено, вместе с количеством исследований, в которых использовались сфероиды ASC в качестве строительных блоков для 3D-биопечати. Таким образом, эта статья направлена на то, чтобы показать крупномасштабное производство сфероидов ASC с использованием неадгезивного микроформованного гидрогеля, распространяющего СФЕРОИДЫ ASC в качестве строительных блоков для подходов к 3D-биопечати.

Введение

Сфероиды считаются бесконтактным подходом в тканевой инженерии. ИСС способны образовывать сфероиды в процессе самосборки. 3D-микроархитектура сфероида увеличивает регенеративный потенциал ИСС, включая дифференциацию в несколько линий 1,2,3. Эта исследовательская группа работает со сфероидами ASC для инженерии хряща и костной ткани 4,5,6. Что еще более важно, сфероиды считаются строительными блоками в биофабрикации тканей и органов, в основном из-за их способности к слиянию.

Использование сфероидов для формирования тканей зависит от трех основных моментов: (1) разработка стандартизированных и масштабируемых роботизированных методов их биофабрикации7, (2) систематическое фенотипирование тканевых сфероидов8, (3) разработка методов сборки 3D-тканей9. Эти сфероиды могут быть сформированы с различными типами клеток и получены с помощью различных методов, включая висячую каплю, реагрегацию, микрофлюидику и микромолоды 8,9,10. Каждый из этих методов имеет преимущества и недостатки, связанные с однородностью размеров и формы сфероидов, восстановлением сфероидов после образования, количеством производимых сфероидов, автоматизацией процессов, трудоемкостью и затратами11.

В методе микроформования клетки дозируются и осаждаются в нижней части микромоли из-за силы тяжести. Неадгезивный гидрогель не позволяет клеткам прилипать к дну, а межклеточные взаимодействия приводят к образованию одного сфероида за спад 8,12. Этот метод биофабрикации генерирует сфероиды однородного и контролируемого размера, может быть роботизирован для крупномасштабного производства эффективным по времени способом с минимальными усилиями и имеет хорошие затратоэффективно-критические факторы при проектировании биофабрикации тканевого сфероида 7,8. Этот метод может быть применен для формирования сфероидов любой клеточной линии для получения нового типа ткани с предсказуемыми, оптимальными и контролируемыми характеристиками8.

Биофабрикация определяется как «автоматизированная генерация биологически функциональных продуктов со структурной организацией...»13. Поэтому автоматизированное производство сфероидов считается первым обязательным этапом разработки линии биофабрикации, которая продолжается в процессе 3D-биопечати и заканчивается полным созреванием биопечатной ткани путем слияния сфероидов. В этом исследовании, чтобы улучшить масштабируемость биофабрикации сфероидов ASC, мы используем автоматизированную систему пипетирования для посева клеточной суспензии, обеспечивая тем самым однородность размера и формы сфероида. В данной работе показано, что удалось получить большое количество (тысячи) сфероидов, необходимых для 3D-биопечати подходов к биофабрикату более сложных тканевых моделей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

ИСС, используемые в этом исследовании, были ранее выделены от здоровых человеческих доноров и криоконсервированы, как описано14 в соответствии с Комитетом по этике исследований Университетской больницы Клементино Фрага Филью, Федеральный университет Рио-де-Жанейро, Бразилия (25818719.4.0000.5257). Смотрите Таблицу материалов для получения подробной информации обо всех материалах и оборудовании, используемых в этом исследовании.

1. Трипсинизация монослоя ASC при прохождении три

  1. Откройте тканевую культуру 175см2 колбы, содержащей монослой ИСС при 80% слиянии и выбросьте супернатант.
  2. Добавьте 7 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS, 0,01 М) и дважды промыть монослой. Далее выбросьте жидкость.
  3. Добавьте 5 мл 0,125% трипсина с 0,78 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА). Далее инкубируют в течение 5 мин при 37 °C.
  4. Добавьте 10 мл модифицированной орлиной среды Dulbecco с низким содержанием глюкозы (DMEM LOW) с 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) в колбу тканевой культуры 175см2 и хорошо смешайте клеточную суспензию с 10 мл сорбологической пипеткой.
  5. Соберите клеточную суспензию с помощью серологической пипетки объемом 10 мл и переложите ее в центрифужную трубку объемом 50 мл. Далее центрифугу на 400 × г в течение 5 мин для получения гранулы ИСС. Повторное суспендирование клеточной гранулы с использованием DMEM LOW , содержащей 10% FBS.
  6. Выполните подсчет ячеек путем исключения trypan.
  7. После подсчета возьмите в общей сложности 1 × 106 ASC в отдельной центрифужной трубке объемом 15 мл, чтобы засеять 81 рецессию, микроформованную неадгезионным гидрогелем (в общей сложности 10 000 клеток / мл, посеянных здесь). Чтобы засеять 256 рецессий микроформованного неадгезивного гидрогеля, возьмите в общей сложности 5 × 105 ИСС в центрифужную трубку (в общей сложности 2 500 клеток / мл, посеянных здесь).

2. Изготовление микроформованного неадгезивного гидрогеля агарозы

  1. Готовят 50 мл стерильного раствора 2% сверхчистой агарозы в 0,9% NaCl в сверхчистой воде. Автоклав раствора в течение 30 мин при 121 °C.
  2. Добавьте 500 мкл стерильного 2% сверхчистого раствора агарозы в центр силиконовой формы, содержащей 81 или 256 круглых углублений.
  3. Через 40 мин отформуйте сверхчистую агарозу из силиконовой формы и поместите ее в колодец из 12-луночной пластиковой пластины.
  4. Добавьте 2 мл DMEM LOW в лунку с микроформованной агарозой и инкубируйте в инкубаторе при 37 °C в атмосфере 5% CO2 в течение не менее 12 ч перед посевом ИСС.

3. Биофабрикация сфероидов ASC с помощью автоматизированной системы дозирования

  1. Проверьте следующее:
    1. Проверьте, включен ли ламинарный поток, и воздушный поток шкафа работает правильно.
    2. Проверьте, подключено ли оборудование к правильному напряжению.
    3. Проверьте, подключен ли планшет к оборудованию.
    4. Проверьте, совпадает ли высота защитного стекла шкафа с маркировкой датчика оборудования.
  2. Нажмите кнопку On/Off на левой стороне оборудования и дождитесь запуска планшета и оборудования.
  3. Расположите наконечники коробок, стойку для трубок центрифуги и пластину, содержащую микроформованный гидрогель агарозы, в рабочем пространстве оборудования.
  4. На планшете с открытым программным обеспечением сначала нажмите на Labware Editor.
  5. Настройте виртуальный рабочий стол и выберите положения пипеток, наконечников, стойки для пластиковых трубок и пластин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Виртуальный рабочий стол должен представлять физические положения аксессуаров в оборудовании.
  6. Нажмите кнопку Переключиться на создание , чтобы включить параметры (см. шаг 3.10) и команды, которые оборудование будет выполнять на протяжении всего эксперимента. Дождитесь открытия панели инструментов и списка Produce в программном обеспечении.
  7. Изначально, чтобы указать команды, укажите количество образцов, подлежащих пипетированию, и перетащите их в список Produce.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количество образцов представляет собой количество пластиковых центрифужных трубок, содержащих суспензию ASC, которая должна быть засеяна в центр микромолодов.
  8. После ввода количества образцов нажмите на кнопку «Передача образца» на программном обеспечении, чтобы перенести суспензию ASC в скважины 12-луночной пластины, содержащей микромолди, и перетащите ее в Список продуктов.
  9. Нажмите « Свойства», чтобы настроить начальную и конечную позиции для оборудования для передачи образца.
  10. Подождите, пока программное обеспечение вернется на страницу Рабочая таблица. Нажмите на кнопку «Параметры», чтобы настроить параметры автоматического заполнения ИСС: i) Скорость аспирации 15,4 с-1; ii) Скорость дозирования 1 с-1; iii) Задержка удара 0 мс; iv) Скорость выдува 15,4 с-1; v) Начальный ход 100%.. Выберите Вода в качестве стандартного типа жидкости.
  11. Настройка параметров для смешивания ИСС для получения однородной суспензии: i) Количество циклов 5; ii) Скорость 6,5 с-1; iii) Объем 300 мкл.
  12. После настройки параметров добавьте время 40 мин в список производить.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это время необходимо, чтобы подождать, пока суспензия ASC затвердеет в нижней части микроформовки.
  13. В Список продуктов включите опцию Переноса реагента для переноса сфероидной питательной среды в соответствующие колодцы пластины.
  14. Повторите шаги 3.9-3.11, чтобы настроить положение и конфигурацию параметров для передачи сфероидной питательной среды.
  15. Нажмите на кнопку с символом проверки на верхней панели программного обеспечения, чтобы убедиться, что нет ошибки программирования.
  16. Нажмите кнопку Play (с символом треугольника) на верхней панели программного обеспечения, чтобы запустить программу.
  17. Дайте оборудованию запуститься, как запрограммировано, и подождите, пока оно издаст звук, указывающий на то, что оно закончилось.
  18. Соберите 12-луночную пластину и инкубируйте ее в инкубаторе при 37 °C, 5% CO2 в течение не менее 18 ч, чтобы сфероиды были полностью сформированы и компактны.
  19. Вручную собирают сфероиды после 1, 3 и 7 дней посева для анализа. Вручную промывайте среду микропипеткой, чтобы освободить сфероиды от микроформованного неадгезивного агарозного гидрогеля.
  20. Через 5 мин проверьте под микроскопом, чтобы определить, полностью ли сфероиды высвобождаются из микроформованного неадгезивного агарозного гидрогеля.
  21. Соберите сфероиды вручную с помощью микропипетки и перенесите их в центрифужную трубку объемом 15 мл.
  22. Промыть сфероиды не менее двух раз с 0,01 М PBS. Оцените жизнеспособность и выполните биомеханические анализы на свежих образцах сфероидов. Для морфологического анализа (гистологии) инкубируют образцы сфероидов в 4% параформальдегиде в PBS в течение не менее 18 ч при 2-8 °C.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Автоматическая система пипеток может засеять суспензию ячейки ASC в 12 лунок одной 12-луночной пластины за 15 минут. Использование 81 микроформованного неадгезивного гидрогеля позволит получить 972 сфероида в конце протокола. Использование 256 микроформованных неадгезивных гидрогелей даст 3072 сфероида в конце протокола. Сфероиды ASC были проанализированы на однородность их размера и формы. Сфероиды ASC из микроформований с 81 рецессией показали однородный диаметр в течение периода культивирования в отличие от сфероидов ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В данной работе представлена крупномасштабная генерация сфероидов ASC с использованием автоматизированной системы пипеток. Критическим этапом протокола является точная настройка программного обеспечения для обеспечения правильного объема суспензии ячейки, скорости и расстояния для пипетки. Параметры, описанные в протоколе, были определены после ряда испытаний по оптимизации дозирования суспензии ячейки ASC в скважины 12-луночных пластин, содержащих микроформованные, неадгезивные гидрогели. Оптимизация оценивалась путем и...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Мы благодарим Национальный институт метрологии, качества и технологии (INMETRO, RJ, Бразилия) за использование их объектов. Это исследование было частично поддержано Фондом Карлоса Шагаса Филью по поддержке исследований штата Рио-де-Жанейро (Faperj) (финансовый кодекс: E26/202.682/2018 и E-26/010.001771/2019), Национальным советом по научно-техническому развитию (CNPq) (финансовый код: 307460/2019-3) и Управлением военно-морских исследований (ONR) (финансовый код: N62909-21-1-2091). Эта работа была частично поддержана Национальным центром науки и технологий по регенеративной медицине INCT Regenera (http://www.inctregenera.org.br/).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
12-луночная пластиковая пластинаCorning3512
50 мл центрифужная трубкаCorningCLS430828
EpMotion 5070Eppendorf5070000282
epT.I.P.S. MotionEppendorf30015231
этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)Инвитроген15576028
фетальная бычья сыворотка (FBS)Gibco10082147
Модифицированная орлиная среда Dulbecco's с низким содержанием глюкозы (DMEM LOW)Gibco31600034
MicroTtissue 3D чашка Петри микроплесневые сфероиды - 16 x 16 матрицаSigma
MicroTtissue 3D чашка Петри микро-плесневые сфероиды - 9 x 9 матрицаSigmaZ764019
фосфатный солевой буфер (PBS)Sigma806552
хлорид натрия (NaCl)SigmaS8776
колба для культуры тканейCorning430720U
трипанLonza17-942E
трипсинGibco27250018
ультрачистый агарозныйInvitrogen16500100
Z764000

Ссылки

  1. Gentile, C. Filling the gaps between the in vivo and in vitro microenvironment: Engineering of spheroids for stem cell technology. Current Stem Cell Research & Therapy. 11 (8), 652-665 (2016).
  2. Bartosh, T. J., et al. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (31), 13724-13729 (2010).
  3. Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential. Tissue Engineering Part C: Methods. 16 (4), 735-749 (2009).
  4. Cortês, I., et al. A scaffold- and serum-free method to mimic human stable cartilage validated by secretome. Tissue Engineering: Part A. 27 (5-6), 311-327 (2021).
  5. Kronemberger, G. S., et al. Scaffold- and serum-free hypertrophic cartilage tissue engineering as an alternative approach for bone repair. Artificial Organs. 44 (7), 288-299 (2020).
  6. Kronemberger, G. S., et al. The hypertrophic cartilage induction influences the building-block capacity of human adipose stem/stromal cell spheroids for biofabrication. Artificial Organs. 45 (10), 1208-1218 (2021).
  7. Mehesz, A. N., et al. Scalable robotic biofabrication of tissue spheroids. Biofabrication. 3 (2), 025002(2011).
  8. Koudan, E. V., et al. The scalable standardized biofabrication of tissue spheroids from different cell types using nonadhesive technology. 3D Printing and Additive Manufacturing. 4 (1), 53-60 (2017).
  9. Parfenov, V. A., et al. label-free and nozzle-free biofabrication technology using magnetic levitational assembly. Biofabrication. 10 (3), 034104(2018).
  10. Laschke, M. W., Menger, M. D. Life is 3D: Boosting spheroid function for tissue engineering. Trends in Biotechnology. 35 (2), 133-144 (2017).
  11. Gutzweiler, L., et al. Large scale production and controlled deposition of single HUVEC spheroids for bioprinting applications. Biofabrication. 9 (2), 025027(2017).
  12. Lin, H., Li, Q., Lei, Y. Three-dimensional tissues using human pluripotent stem cell spheroids as biofabrication building blocks. Biofabrication. 9 (2), 025007(2017).
  13. Groll, J., et al. Biofabrication: reappraising the definition of an evolving field. Biofabrication. 8 (1), 013001(2016).
  14. Baptista, L. S., et al. An alternative method for the isolation of mesenchymal stromal cells derived from lipoaspirate samples. Cytotherapy. 11 (6), 706-715 (2009).
  15. Conway, M. K., et al. Scalable 96-well plate based iPSC culture and production using a robotic liquid handling system. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (99), e52755(2015).
  16. Moutsatsou, P., et al. Automation in cell and gene therapy manufacturing: from past to future. Biotechnology Letters. 41 (11), 1245-1253 (2019).
  17. Doulgkeroglou, M. -K., et al. Automation, monitoring, and standardization of cell product manufacturing. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 811(2020).
  18. Bhise, N. S., et al. A liver-on-a-chip platform with bioprinted hepatic spheroids. Biofabrication. 8 (1), 014101(2016).
  19. Daly, A. C., Kelly, D. J. Biofabrication of spatially organised tissues by directing the growth of cellular spheroids within 3D printed polymeric microchambers. Biomaterials. 197, 194-206 (2019).
  20. Lopa, S., et al. Microfluidic biofabrication of 3D multicellular spheroids by modulation of non-geometrical parameters. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 366(2020).
  21. Meseguer-Ripolles, J., Kasarinaite, A., Lucendo-Villarin, B., Hay, D. C. Protocol for automated production of human stem cell derived liver spheres. STAR Protocols. 2 (2), 100502(2021).
  22. Lee, G. -H., Suh, Y., Park, J. Y. A paired bead and magnet array for molding microwells with variable concave geometries. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e55548(2018).
  23. Becerra, D., Wu, T., Jeffs, S., Ott, H. C. High-throughput culture method of induced pluripotent stem cell-derived alveolar epithelial cells. Tissue Engineering Part C - Methods. 27 (12), 639-648 (2021).
  24. Mironov, V., Kasyanov, V., Markwald, R. R. Organ printing: from bioprinter to organ biofabrication line. Current Opinion Biotechnology. 22 (5), 667-673 (2011).
  25. De Moor, L., et al. High-throughput fabrication of vascularized spheroids for bioprinting. Biofabrication. 10 (3), 035009(2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

3D

Похожие статьи