Стратегии инокуляции для заражения корней растений почвенными микроорганизмами

Естественные почвы населены удивительным количеством микробов, которые могут быть нейтральными, вредными или полезными для растений¹. Многие патогены растений переносятся через почву, окружают корни и атакуют подземный орган. Эти микроорганизмы относятся к самым разнообразным кладам: грибы, оомицеты, бактерии, нематоды, насекомые и некоторые вирусы ^1,2. Как только условия окружающей среды благоприятствуют инфекции, восприимчивые растения станут больными, а урожайность сельскохозяйственных культур снизится. Последствия изменения климата, такие как глобальное потепление и экстремальные погодные условия, увеличат долю почвенных патогенов растений³. Поэтому становится все более важным изучать эти разрушительные микробы и их влияние на производство продуктов питания и кормов, а также на природные экосистемы. Кроме того, в почве есть микробные мутуалисты, которые плотно взаимодействуют с корнями и способствуют росту, развитию и иммунитету растений. При столкновении с патогенами растения могут активно вербовать специфических противников в ризосфере, которые могут поддерживать выживание хозяина, подавляя патогены 4,5,6,7. Тем не менее, механистические детали и пути, участвующие в полезных взаимодействиях корневого микроба, часто все еще неизвестны⁶.

Поэтому важно расширить общее понимание взаимодействия корневого микроба. Надежные методы инокуляции корней почвенными микроорганизмами необходимы для проведения модельных исследований и передачи полученных результатов сельскохозяйственному применению. Полезные взаимодействия в почве изучаются, например, с Serendipita indica (ранее известной как Piriformospora indica), азотфиксирующим Rhizobium spp. или микоризными грибами, в то время как известные почвенные патогены растений включают Ralstonia solanacearum, Phytophthora spp., Fusarium spp. и Verticillium spp.1. Последние два являются грибковыми родами, которые распространены глобально и вызывают сосудистые заболевания². Verticillium spp. (Ascomycota) может заражать сотни видов растений - в основном двудольных, включая травянистых однолетников, древесные многолетники и многие сельскохозяйственные растения ^2,8. Гифы Verticillium входят в корень и растут как межклеточными, так и внутриклеточными по направлению к центральному цилиндру для колонизации сосудов ксилемы ^2,9. В этих сосудах грибок остается на протяжении большей части своего жизненного цикла. Поскольку сок ксилемы беден питательными веществами и несет защитные соединения растений, гриб должен адаптироваться к этой уникальной среде. Это достигается путем секреции связанных с колонизацией белков, которые позволяют патогену выживать в своем хозяине^10,11. Достигнув корневой сосудистой системы, грибок может распространяться внутри сосудов ксилемы акропетально к листве, что приводит к системной колонизации хозяина ^9,12. На данный момент на растение негативно влияет рост ^9,10,13. Например, происходит задержка роста и желтые листья, а также преждевременное старение 13,14,15,16.

Одним из представителей этого рода является Verticillium longisporum, который хорошо приспособлен к медным хозяевам, таким как агрономически важный рапс, цветная капуста и модельное растение Arabidopsis thaliana¹². Несколько исследований объединили V. longisporum и A. thaliana, чтобы получить обширное представление о сосудистых заболеваниях, передаваемых через почву, и результирующих реакциях защиты корней 13,15,16,17. Простое тестирование чувствительности может быть реализовано с использованием модельной системы V. longisporum / A. thaliana, и для обоих организмов доступны хорошо зарекомендовавшие себя генетические ресурсы. С V. longisporum тесно связан возбудитель Verticillium dahliae. Хотя оба вида грибов выполняют сходный сосудистый образ жизни и процесс инвазии, их эффективность размножения от корней до листьев и симптомы заболевания у A. thaliana различны: в то время как V. longisporum обычно вызывает раннее старение, инфекция V. dahliae приводит к увяданию¹⁸. Недавно в методологическом резюме были представлены различные стратегии корневой прививки для заражения A. thaliana V. longisporum или V. dahliae, помогающие в планировании экспериментальных установок¹⁹. В полевых условиях V. longisporum иногда наносит значительный ущерб производству масличного рапса¹², тогда как V. dahliae имеет очень широкий диапазон хозяев, включающий несколько культивируемых видов, таких как виноградная лоза, картофель и помидор⁸. Это делает оба патогена экономически интересными моделями для изучения.

Таким образом, следующие протоколы используют как V. longisporum , так и V. dahliae в качестве модельных корневых патогенов для иллюстрации возможных подходов к корневым прививкам. Арабидопсис (Arabidopsis thaliana), масличный рапс (Brassica napus) и помидор (Solanum lycopersicum) были выбраны в качестве модельных хозяев. Подробное описание методологий можно найти в тексте ниже и в сопроводительном видео. Обсуждаются преимущества и недостатки для каждой системы инокуляции. Взятый вместе, этот набор протоколов может помочь определить подходящий метод для конкретных исследовательских вопросов в контексте взаимодействия корневого микроба.

1. Среды для грибковых культур и систем посева растений

1. Жидкий картофельный бульон из декстрозы (PDB): Приготовьте 21 г / л PDB в сверхчистой воде в термостабильной колбе.
2. Жидкий бульон из декстрозы Чапек (CDB): Приготовьте 42 г /л CDB в сверхчистой воде в термостабильной колбе.
3. Среда для системы прививки чашки Петри: Приготовьте термостойкую колбу с 1,5 г / л мурашиге и среды Skoog (MS) и 8 г / л агара в сверхчистой воде.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте сахара в этой среде, так как это приведет к чрезмерному росту грибков после прививки.
4. Среда для системы инокуляции на основе пластиковых стаканчиков: Подготовьте термостабильную колбу с 4,4 г / л MS, 0,2 г / л MgSO₄, 1 г / л KNO₃, 0,5 г / л 2-(N-морфолино)этанесульфоновой кислоты (MES) и 6,0 г / л агара в сверхчистой воде и отрегулируйте рН до 5,7 с 5 М КОН.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте сахара в этой среде, так как это приведет к чрезмерному росту грибков после прививки.
5. 1/4 MS среды: Приготовьте 1,2 г/л MS в сверхчистой воде.
6. Используйте автоклав для стерилизации всех вышеперечисленных растворов. Положите стеклянные колбы в корзину, закройте крышку и стерилизуйте в течение 15 мин при 121 °C и 98,9 кПа.

2. Стерилизация поверхности семян растений

ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда используйте приведенный ниже протокол для стерилизации поверхности семян арабидопсиса, масличного рапса и томата перед посевом.

1. Переложите семена в реакционную трубку объемом 2 мл. Поместите трубку в эксикатор с внутренним объемом 5,8 л.
2. Генерируйте газообразный хлор в эксикаторе, добавляя 6 мл 33% соляной кислоты (HCl) в 100 мл 12% водного гипохлорита натрия (NaClO).
3. Немедленно закройте крышку эксикатора и высиживайте семена в течение 3 ч в газе.

3. Приготовление инокулята со спорами Verticillium (бесполыми конидиями)

ПРИМЕЧАНИЕ: Культивируют V. dahliae (штамм JR2) так же, как V. longisporum (штамм Vl43)17,18,19. Убедитесь, что все оборудование и среды свободны от микробов и что все этапы выполняются в ламинарной вытяжке, чтобы сохранить осечку inoculum.

1. Заполните 150 мл жидкого PDB (стадия 1.1) в колбу для шиканерии объемом 500 мл и дополните среду 500 мг/л цефотаксима.
2. Добавьте Verticillium conida из хранилища глицерина в среду PDB. Закройте колбу стерильной пенной пробкой.
3. Инкубируют культуру в течение 7-10 дней в темном ящике при комнатной температуре (РТ) при непрерывном горизонтальном встряхивании (ротационный шейкер; 60 об/мин). В результате образуются небольшие белые сферы мицелия.
4. Осторожно удалите и выбросьте супернатант PDB. Большая часть мицелия должна остаться в колбе.
5. Добавьте 100 мл жидкого CDB (стадия 1.2) на мицелий в колбе для шиканеров и дополните среду 500 мг/л цефотаксима.
6. Инкубировать еще 4-5 дней в темном ящике при РТ при непрерывном горизонтальном встряхивании (вращательный шейкер, 60 об/мин), чтобы вызвать споруляцию. Супернатант станет желтовато-сероватым по мере высвобождения конидий.
7. Отфильтруйте часть (5-10 мл) конидиасодержащей жидкости через фильтровальную бумагу (уровень удержания частиц 8-12 мкм) в стерильную 50 мл коллекторную трубку. Это отделяет споры от мицелия.
8. Определите концентрацию спор с помощью камеры подсчета клеток и микроскопа. Разбавляют безмикробной средой 1/4 MS в сверхчистой воде до получения приведенных ниже концентраций спор.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Под микроскопом конидии от V. longisporum в основном длиннотянутые и размером 7,1-8,8 мкм, в то время как V. dahliae conidia короче (3,5-5,5 мкм) и довольно сферические²⁰.
9. Используйте эти свежесобранные конидии в качестве инокулята. Следите за тем, чтобы эксперименты проводились всегда со свежесобранными конидиями, а не с замороженными запасами, так как замораживание значительно снижает количество жизнеспособных спор¹⁹.
10. Для длительного хранения заморозьте споры в виде высококонцентрированного спорового раствора (приблизительно 1 х 10⁸ спор/мл) в 25% глицерине при -80 °C (хранится до 1 года). Для следующих экспериментов используйте эти запасы глицерина для инокуляции среды PDB на этапе 3.2.

4. Стерильная система инокуляции in vitro на основе чашек Петри

ПРИМЕЧАНИЕ: Для системы чаш Петри¹⁷ убедитесь, что все оборудование и среды свободны от микробов и что все этапы выполняются в ламинарной вытяжке.

1. После автоклавирования перелейте среду (см. шаг 1.3) в чашку Петри.
2. После затвердевания среды переупакуйте чашки Петри в стерильный полиэтиленовый пакет и храните их вверх ногами на ночь в холодильнике (4-10 °C). Охлажденная среда помогает предотвратить скольжение среды на следующих этапах.
3. Вырежьте и удалите инфекционный канал и верхнюю треть затвердевшей среды скальпелем (рисунок 1А). Избегайте попадания жидкости или воздуха под агаровую среду во время резки; в противном случае среда соскользнет и закроет инфекционный канал.
4. Распределите 50-100 поверхностно-стерилизованных семян арабидопсиса стерильным наконечником пипетки по срезанной верхней поверхности. Поместите семена в угол, где поверхность срезанного агара соприкасается со стенкой чашки Петри, чтобы корни могли расти между средой и стенкой чашки Петри. Это облегчит прививку позже.
5. Закройте чашки Петри и запечатайте их воздухопроницаемой клейкой лентой, чтобы обеспечить газообмен.
6. После расслоения в течение 2 дней в темноте при 4 °C поместите пластины вертикально в подходящую стойку и выращивайте растения при 22 °C ± 1 °C в условиях длительного дня (16 ч света / 8 ч темноты) в камере роста.
7. Когда большинство корней достигнет инфекционного канала (около 9-11-дневных саженцев), уложите пластины горизонтально, откройте их и добавьте 500 мкл свежесобранной Verticillium conidia с концентрацией 4 х 10⁵ спор/мл непосредственно в инфекционный канал, убедившись, что жидкость равномерно распределена по каналу.
8. Аналогично, подготовьте контрольные пластины, добавив 500 мкл макета раствора вместо спор (безмикробная среда 1/4 MS).
9. Инкубируйте пластины горизонтально в течение нескольких минут, пока жидкость не впитается и не сможет вытечь, когда пластины снова установлены вертикально. Затем закройте крышку и запечатайте пластины воздухопроницаемой скотчем.
10. Высиживайте пластины вертикально в камере роста. По желанию накройте части корней черными бумажными ящиками, чтобы затемнить корни и почвенный грибок (см.¹⁹).
11. Выполните анализ в предпочтительные моменты времени после прививки в зависимости от исследовательского вопроса (см. условные обозначения фигур для точных временных точек, используемых здесь). Ниже приведены некоторые предложения.
    1. Срежьте листья с корней и соберите оба по отдельности. Выньте полоски агара из чашки Петри, чтобы легко получить доступ к корням, и осторожно вытащите их из агара с помощью щипцов. Заморозьте весь растительный материал немедленно в жидком азоте.
       1. Измельчите образцы в жидком азоте. Извлеките общую ДНК из 100 мг листового материала, чтобы определить с помощью количественной ПЦР (qPCR) количество грибковой ДНК относительно ДНК растений (см.¹⁹).
       2. Измельчите образцы в жидком азоте. Возьмите 100 мг растительного материала и извлеките общую РНК. Проводят количественную обратную транскрипцию ПЦР (qRT-PCR) для определения экспрессии генов растений (или грибковых генов) во время заражения (см.¹⁹).
    2. Осторожно извлеките корни из агара, избегая травм и осмотрите их под флуоресцентным микроскопом.
       1. Определение индукции маркерных генов в репортерных линиях растений (например, люциферазы, β-глюкуронидазы или флуоресцентных репортеров 17,19,21).
       2. Визуализируйте распространение грибка в корне с помощью грибковых репортерных линий (например, V. longisporum, конститутивно экспрессирующего усиленный зеленый флуоресцентный белок, Vl-sGFP⁹) или методами окрашивания (например, через 5-бром-4-хлор-3-индиксил-N-ацетил-бета-d-глюкозаминид (X-beta-D-Glc-Nac)¹⁸).

5. Стерильная система инокуляции in vitro , организованная с пластиковыми стаканчиками

ПРИМЕЧАНИЕ: Как отмечалось в первом описании данного метода¹⁹, убедитесь, что все оборудование и среды не содержат микробов и что все этапы выполняются в ламинарной вытяжке.

1. Используйте прозрачные пластиковые стаканчики общим объемом 500 мл и стерилизуйте их в 70%-75% этаноловой ванне в течение не менее 20 мин. Высушите чашки в ламинарной вытяжке.
2. Вылейте автоклавную среду (см. шаг 1.4) в пластиковые стаканчики. Необязательно добавляют цефотаксим (конечная концентрация 50 мг/л) в автоклавную среду для предотвращения бактериального загрязнения. Используйте 150 мл среды на чашку для экспериментов с арабидопсисом или более средней (250-300 мл на чашку) для экспериментов с более крупными видами растений (рапс, помидор).
3. Поместите пластиковый слой (стерилизованный ранее путем инкубации в 70%-75% этанола в течение 20 мин) на среду, прежде чем она затвердеет (рисунок 1B).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот пластиковый слой содержит четыре сборных отверстия по углам для размещения поверхностно-стерилизованных семян. Это позволяет семенам получить доступ к среде. Позже этот разделительный слой предотвращает прикосновение листьев к грибосодержащей среде, так что микробы не могут напрямую атаковать листья и должны пройти корневой путь. Еще одно отверстие находится в центре, что позволяет перерезать инфекционный канал.
4. Когда среда затвердеет, вырежьте агар скальпелем через сборное центральное отверстие на глубину около 1,5 см. Удалите разрезанный агар, чтобы создать инфекционный канал, в который грибковые споры могут быть добавлены позже.
5. Слегка поцарапайте агаровую среду кончиком пипетки в четырех меньших отверстиях, чтобы прервать затвердевшую кожуру (это позволяет семенам впитывать воду из водянистой среды агара). Поместите семена с помощью наконечника пипетки в меньшие отверстия.
6. Закройте пластиковый стакан вторым, перевернутым пластиковым стаканчиком и запечатайте воздухопроницаемой клейкой лентой. Лента должна обеспечивать газообмен.
7. После расслоения в течение 3 дней в темноте при 4 °C инкубируют чашечные системы под 12 ч света / 12 ч темноты (арабидопсис, масличный рапс) или 16 ч при свете / 8 ч в условиях темноты (томат) в камерах роста при постоянной температуре 22 °C и влажности 60%.
8. Следите за рекомендуемым возрастом растений для прививки: 21 день для арабидопсиса; 5-7 дней для масличного рапса; 12 дней для помидоров.
9. Инокулируют растения Verticillium путем добавления 1 мл раствора конидий (рекомендуемая концентрация: 4 х 10⁵ спор/мл) в инфекционный канал. Для подготовки контрольных образцов добавьте в канал 1 мл макетного раствора без спор (безмикробная среда 1/4 МС).
10. Выполните анализ в предпочтительные моменты времени после прививки в зависимости от исследовательского вопроса (см. условные обозначения фигур для точных временных точек, используемых здесь). Ниже приведены некоторые предложения.
    1. Фотографируйте растения с помощью цифровой камеры сверху, сохраняя одинаковое расстояние для каждой фотографии. Количественно оцените площадь листьев (например, с помощью ImageJ²² или BlattFlaeche^17,19; используйте длину чашек для установки шкалы) и сравните инфицированные и контрольные группы. Классифицируйте развитие симптомов заболевания (например, более мелкие, более желтоватые или некротические листья).
       ПРИМЕЧАНИЕ: Если на Arabidopsis есть какие-либо стебли, удалите их, чтобы получить лучшие фотографии розеток.
    2. Удалите корни и определите биомассу (свежий вес) побегов из зараженных и контрольных образцов путем взвешивания. Определите относительный свежий вес¹⁹.
    3. Соберите образцы для молекулярного анализа следующим образом.
    4. Arabidopsis: Удалите стебли, если таковые имеются. Срежьте розетки у основания с корней. Обязательно исключите из образца весь корневой материал и соберите целые розетки. Смешайте 4-5 розеток с разных растений в один образец и заморозьте материал листьев в жидком азоте.
    5. Аккуратно вытащите корни из среды щипцами, прижмите и смажьте их бумажным полотенцем, чтобы удалить остатки агара, и соедините 4-5 корней с разных растений в один образец. Заморозить сразу в жидком азоте.
    6. Масличный рапс / помидор: Срежьте сегменты стебля из гипокотила (например, 1 см в длину; всегда берите одну и ту же область стебля). Смешайте материал из 4-5 растений в каждом образце и заморозьте в жидком азоте.
    7. Измельчите образцы в жидком азоте. Извлеките общую ДНК из 100 мг материала листа или стебля, чтобы определить с помощью qPCR количество грибковой ДНК относительно ДНК растений (см.¹⁹).
    8. Измельчите образцы в жидком азоте, возьмите 100 мг растительного материала и извлеките общую РНК. Провести qRT-PCR для определения экспрессии генов растений (или грибковых генов) при заражении (см.¹⁹).

6. Почвенная система посева в горшках

1. Тщательно смешайте почву и песок в объемном соотношении 3:1 (почва:песок), чтобы облегчить смывание субстрата с корней. Перелейте смесь в автоклавный мешок. Если смесь слишком сухая, добавьте соответствующее количество воды и перемешайте ее с субстратом. Пар при 80 °C в течение 20 мин в автоклаве для минимизации микробных загрязнений.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте нагревания до температуры выше 80 °C, так как это может повлиять на органические питательные вещества почвы.
2. Наполните горшки почвенно-песчаной смесью и переложите их в лотки. Добавьте воду в лотки примерно на 1/3 высоты горшка, чтобы почвенно-песчаная смесь тщательно пропиталась водой. Кроме того, опрыскивайте субстрат водой баллончиком для обеспечения влажных условий запуска.
3. Посейте по 3-4 семени в каждом горшке (рисунок 1С), следя за тем, чтобы семена имели достаточное расстояние друг от друга. Держите их в течение 3 дней в темноте при 4 °C для расслоения для синхронизации прорастания.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительно культивировать избыток растений, что позволяет отбирать растения одинакового размера для экспериментов по прививке и уменьшает отклонения из-за индивидуальных различий.
4. Пусть рассада растет в условиях долгого дня (16 ч света / 8 ч темноты; постоянная температура 22 °C; влажность 60%) при регулярном поливе.
5. Следите за рекомендуемым возрастом растений для прививки: 21 день для арабидопсиса, 7 дней для масличного рапса и 10 дней для томата. Собирайте растения аналогичного размера для выполнения «корневой прививки»15,17,23,24. Выньте почву из горшков и аккуратно выкопайте корни.
6. Осторожно промойте только корни в емкости для воды и держите розетки вне воды. Инкубировать промытые корни в течение 60 мин в чашке Петри, содержащей раствор спор Verticillium (рекомендуемая концентрация: 2 x 10⁶ спор/мл). Для неинфицированной контрольной группы инкубируют корни в течение 60 мин в макете раствора без спор (без микробов 1/4 MS среды).
7. Подготовьте новые горшки с влажной, стерилизованной паром почвой (80 °C в течение 20 мин) без песка. Используйте наконечник пипетки, чтобы сделать одно отверстие в центре почвы в каждом горшке.
8. Непосредственно поместите корни в отверстие (перенесите только одно растение на горшок). После вставки корней убедитесь, что отверстия аккуратно засыпаются почвой. Избегайте давления на почву, иначе пересадка может вызвать симптомы стресса, такие как фиолетовые листья.
9. Культивируют инфицированные и контрольные группы в условиях длительного дня (16 ч при светлой / 8 ч темноты; постоянная температура 22 °C; влажность 60%) при регулярном поливе.
10. Выполните анализ в предпочтительные моменты времени после прививки в зависимости от исследовательского вопроса (см. условные обозначения фигур для точных временных точек, используемых здесь). Ниже приведены некоторые предложения.
    1. Фотографируйте растения цифровой камерой сверху, сохраняя дистанцию одинаковой для каждой фотографии. Количественно оцените площадь листьев (например, с помощью ImageJ²² или BlattFlaeche^17,19; используйте диаметр горшков для установки шкалы) и сравните инфицированные и контрольные группы. Классифицируйте развитие симптомов заболевания (например, более мелкие, более желтоватые или некротические листья)¹³.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Удаление стеблей Arabidopsis облегчает фотографирование розеток.
    2. Удалите корни и определите биомассу (свежий вес) побегов из зараженных и контрольных образцов путем взвешивания. Определите относительный свежий вес¹⁹.
    3. В качестве альтернативы можно измерить высоту растения или классифицировать грибковый рост из сегментов стебля для оценки тяжести заболевания¹³.
    4. Соберите образцы для молекулярного анализа следующим образом.
    5. Арабидопсис: Удалите стебли. Срежьте розетки на корневой кроне. Смешайте 4-5 розеток из разных растений в один образец. Заморозьте материал листа в жидком азоте.
       ПРИМЕЧАНИЕ: В случае корней трудно очистить их в достаточной степени от почвы без перепрограммирования экспрессии генов путем промывки.
    6. Масличный рапс / помидор: Срежьте сегменты стебля из гипокотила (например, 1 см в длину; всегда берите одну и ту же область стебля). Смешайте материал из 4-5 растений в один образец и заморозьте его в жидком азоте.
    7. Измельчите образцы в жидком азоте. Извлеките общую ДНК из 100 мг листа или стеблевого материала, чтобы определить с помощью qPCR количество грибковой ДНК относительно ДНК растений (см.¹⁹).
    8. Измельчите образцы в жидком азоте, возьмите 100 мг растительного материала и извлеките общую РНК. Провести qRT-PCR для определения экспрессии генов растений (или грибковых генов) при заражении (см.¹⁹).

7. Анализ данных

1. Рассчитайте среднее и стандартное отклонение (± SD) на основе биологических реплик.
2. Вычислите относительные значения, разделив все результаты из зараженной группы на результат элемента управления. Отображайте среднее значение, например, как «относительно макета» или «относительно дикого типа».
3. Определение статистической значимости между группами.

Рисунок 1: Компиляция трех систем инокуляции и отдельных этапов в протоколах. Эти рисунки иллюстрируют системы с моделью растения Arabidopsis thaliana. Для других видов растений сроки должны быть скорректированы. Выделяются оранжевые поля, для которых наиболее рекомендуются последующие анализы с соответствующей системой. (A) Для системы прививки в чашках Петри¹⁷ налейте среду и дайте ей затвердеть. Храните тарелки в холодильнике на ночь. Затем скальпелем вырежьте и удалите верхнюю треть, а также инфекционный канал (IC) (белые участки на рисунке были удалены из агара, в то время как голубоватые области представляют агар). Поместите семена на срезанную поверхность и закройте чашку Петри. После расслоения поместите пластины вертикально и дайте растениям расти. Как только большая часть корней достигнет инфекционного канала, добавьте споровый раствор пипеткой непосредственно в канал. Убедитесь, что решение распределено равномерно. Закройте чашки Петри и высиживайте их вертикально в камере роста. Подходы, которые могут последовать, включают экспрессионный анализ с количественной обратной транскрипцией ПЦР (qRT-PCR), микроскопию с репортерными линиями и количественную оценку микробной ДНК. (B) Для системы прививки в пластиковых стаканчиках¹⁹ залить среду и перенести разделяющий пластиковый слой с помощью сборных отверстий (четыре небольших отверстия в углах для размещения семян и одно большое отверстие в центре инфекционного канала). Дайте среде затвердеть. Вырежьте и удалите агаровую среду в центральном отверстии скальпелем для получения инфекционного канала (IC). Поцарапайте среду в меньших отверстиях и перенесите семена. Закройте чашку перевернутой чашкой и запечатайте воздухопроницаемой лентой (обозначенной желтым цветом). Дайте растениям расти. Для прививки добавьте споровый раствор пипеткой непосредственно в инфекционный канал. Закройте систему и продолжайте выращивание в камере роста. Подходы, которые могут последовать, включают экспрессионный анализ с помощью qRT-PCR, количественную оценку микробной ДНК и определение свежего веса, площади листьев или других характеристик заболевания. С) "Корневая прививка"^15,17,23,24: для почвенной системы посева заполняйте горшки смесью почвы с песком. Перенесите семена и дайте саженцам расти. Выкапывают растения аналогичного размера и вымывают корни в воде. Поместите промытые корни в чашку Петри, держа раствор со спорами. После инкубации вставить одиночные растения в горшки с почвой. Подходы, которые могут последовать, включают экспрессионный анализ листьев с помощью qRT-PCR, количественную оценку микробной ДНК и определение свежего веса, площади листьев или других характеристик заболевания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

В соответствии с протоколом растения культивировали и прививали V. longisporum (штамм Vl4325) или V. dahliae (изолят JR218). Различные сценарии были разработаны, чтобы доказать эффективность и подчеркнуть некоторые возможности данных протоколов. Показаны репрезентативные результаты.

Экспрессивная индукция генов, участвующих в биосинтезе антимикробного индол-глюкозинолата (IG), является надежным показателем для оценки инфекции Verticillium 17,19,26. У арабидопсиса, MYB51 (белок домена MYB 51; AT1G18570) кодирует фактор транскрипции, участвующий в активации генов, необходимых для биосинтеза IG27. MYB51 может служить маркерным геном, который указывает на успешную инвазию, поскольку он последовательно индуцируется в корнях V. longisporum26 или другими почвенными грибами, такими как Phytophthora parasitica26 и Fusarium oxysporum21. Через два дня после прививки (2 dpi) в системе на основе чашки Петри индукция MYB51 была визуализирована в корнях Arabidopsis. Репортерная линия растений PromMYB51::YFP21 раскрыла активацию промотора, а анализ qRT-PCR подтвердил значительную транскрипционную индукцию этого гена (рисунок 2A-B). Такие эксперименты направлены на определение экспрессионных изменений в корнях во время инфекции.

Поскольку виды Verticillium , используемые в этом исследовании, ведут сосудистый образ жизни и распространяются от корня к побегу через сосуды ксилемы, количество грибковой ДНК может быть определено в листьях в качестве параметра степени распространения грибков. Арабидопсис был привит корнем в системе in vitro в пластиковых стаканчиках, а розетки были собраны через 12 дней. По сравнению с фоновым значением, обнаруженным в пробном контроле, значительное количество грибковой ДНК было обнаружено в листьях зараженных растений (рисунок 2C). Это свидетельствует о том, что инфекция успешно прогрессировала. Для дальнейших исследований количество грибковой ДНК может быть количественно определено в различных генотипах растений, чтобы получить представление о реакциях защиты корней. Кроме того, корни были собраны в этот момент времени, чтобы проверить индукцию гена маркера с помощью qRT-PCR. Значительно обогатилось обилие транскриптов MYB51 (рисунок 2D). Это показывает, что тесты на восприимчивость и экспрессионный анализ могут быть легко выполнены параллельно с системой чашек, что подчеркивает большое преимущество этой процедуры.

Чтобы включить доказательства того, что другие модельные виды растений также могут быть интродуцированы, масличный рапс был заражен V. longisporum, а помидор V. dahliae в системе в пластиковых стаканчиках. На 12-й день после прививки у корней количественно оценивали количество грибковой ДНК в сегментах стебля, срезанных у основания саженцев (рисунок 2E-F). Грибковая ДНК была обнаружена у обоих видов растений, что указывает на размножение патогенов внутри растения. Опять же, различные генотипы растений могут быть протестированы, чтобы получить знания о защитных механизмах.

Если корневой колонизирующий микроб, представляющий интерес, не распространяется от корней к листьям, невозможно количественно оценить количество микробной ДНК в листьях в качестве параметра тяжести заболевания. Другим вариантом измерения тяжести заболевания является оценка и экстраполяция симптомов у хозяина. Чтобы проиллюстрировать это, Arabidopsis был привит V. dahliae в почвенной системе, и была оценена площадь зеленых листьев (рисунок 2G-H). В то время как розетки обработанных макетами растений выглядели здоровыми и зелеными, зараженные патогенами растения имели уменьшенный размер листьев и желтоватые или даже некротические листья. Таким образом, восприимчивость различных генотипов растений может быть проанализирована и подтверждена, например, путем количественной оценки свежего веса.

Рисунок 2: Репрезентативные результаты, полученные путем следования протоколам. (A,B) Корни Arabidopsis были инокулированы V. longisporum в системе чаш Петри. Репортерная линия PromMYB51::YFP21 выявила сильную активацию промотора MYB51 в инфицированных корнях по сравнению с имитацией контроля (микроскопия при 2 dpi; шкала: 50 мкм). Транскрипционная индукция MYB51 в корнях дикого типа (WT) была дополнительно подтверждена анализом qRT-PCR (2 dpi). Значения зараженных образцов приведены относительно пробных образцов (установлено значение 1) (n = 5; ± SD). (C) Системная колонизация через V. longisporum: после инокуляции корней Arabidopsis в чашечной системе относительное количество грибковой ДНК определяли в листьях с помощью количественной ПЦР (qPCR; 12 dpi). Значения зараженных образцов приведены относительно фонового уровня в пробных образцах (установлено значение 1) (n = 3; ± SD). (D) V. longisporum инфицированные и обработанные имитацией корни были собраны из системы чашек и проведен анализ qRT-PCR. Значения зараженных образцов приведены относительно пробных образцов (установлено значение 1) (n = 3; ± SD). Было обнаружено, что MYB51 индуцирован транскрипционно (12 dpi). (E) Рапс масличных культур прививали в чашечной системе V. longisporum, а относительное количество грибковой ДНК количественно определяли с помощью qPCR в стволовых сегментах (12 dpi). Значения зараженных образцов приведены относительно фонового уровня в пробных образцах (установлено значение 1) (n = 3; ± SD). (F) Томат прививали в чашечной системе V. dahliae и количественно определяли относительное количество грибковой ДНК с помощью qPCR в сегментах стебля (12 dpi). Значения зараженных образцов приведены относительно фонового уровня в пробных образцах (установлено значение 1) (n = 5; ± SD). (Г,Ч) Arabidopsis был инокулирован корневым соусом V. dahliae в почвенной системе, и показаны репрезентативные изображения зараженных и обработанных макетами растений (21 dpi). Была обследована область зеленых листьев. По сравнению с макетом (установлено на 1), зараженные растения имели меньшую площадь зеленых листьев (n = 5; ± SD). (Б-Ф,Н) Для пар грунтовки см.19; статистика: t-тест студента относительно макета, * p≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Авторам нечего раскрывать.