Method Article

Обнаружение пострепликативного накопления и восстановления разрывов в клетках человека с помощью анализа волокон ДНК

DOI:

10.3791/63448

⸱

February 3rd, 2022

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Institute of Biomedical Sciences, University of São Paulo, 2Division of Oncology, Department of Internal Medicine, Washington University in St. Louis

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы описываем две модификации анализа волокон ДНК для исследования одноцепочечных разрывов ДНК в репликации ДНК после индукции поражения. Анализ волокон S1 позволяет обнаруживать пострепликтивные промежутки с использованием эндонуклеазы S1, специфичной для ssDNA, в то время как анализ заполнения пробелов позволяет визуализировать и количественно оценивать восстановление пробелов.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Анализ ДНК-волокна представляет собой простой и надежный метод анализа динамики репликационной вилки, основанный на иммунодетекции аналогов нуклеотидов, которые включаются в синтез ДНК в клетках человека. Однако этот метод имеет ограниченное разрешение в несколько тысяч килобаз. Следовательно, пострепликтивные одноцепочечные разрывы ДНК (ssDNA) размером всего в несколько сотен оснований не обнаруживаются стандартным анализом. Здесь мы описываем модифицированную версию анализа волокна ДНК, которая использует нуклеазу S1, фермент, который специфически расщепляет ssDNA. При наличии пострепликативных разрывов ssDNA нуклеаза S1 будет нацеливаться и расщеплять промежутки, создавая более короткие тракты, которые могут быть использованы в качестве считывания разрывов ssDNA на текущих вилках. Эти пострепликтивные пробелы сдНК образуются, когда поврежденная ДНК реплицируется прерывисто. Они могут быть восстановлены с помощью механизмов, не связанных с репликацией генома, в процессе, известном как заполнение пробелов или пострепликативное восстановление. Поскольку механизмы заполнения пробелов включают синтез ДНК независимо от S-фазы, изменения в схеме маркировки волокон ДНК также могут быть использованы для мониторинга событий заполнения пробелов. В целом, эти модификации анализа волокон ДНК являются мощными стратегиями для понимания того, как пострепликтивные пробелы формируются и заполняются в геноме клеток человека.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Основополагающие работы предоставили доказательства накопления пострепликативных одноцепочечных (ssDNA) пробелов при лечении агентами, повреждающими ДНК, в бактериях1 и клетках человека 2,3. Во время репликации поврежденных шаблонов ДНК механизм синтеза ДНК может обходить поражения, используя специфические транслейсионные синтезные ДНК-полимеразы или с помощью механизмов переключения шаблонов. В качестве альтернативы, реплисома может также просто пропустить поражение, оставив зазор ssDNA позади, чтобы быть восстановленным позже. Совсем недавно исследование ясно показало, что лечение генотоксическими агентами приводит к разрывам ssDNA у эукариот с использованием электронной микроскопии для визуализации специфической структуры промежуточных продуктов репликации4. Формирование этих областей пострепликативных промежутков первоначально предполагалось как простой результат полупереключенного способа репликации ДНК2. В этом случае поражение на запаздывающей нити может блокировать удлинение фрагмента Окадзаки, но прогрессирование вилки естественным образом спасается следующим фрагментом Окадзаки, оставляя после себя разрыв сдНК. Однако дальнейшие исследования показали, что образование промежутков на ведущей нити также возможно, как впервые показано у бактерий5. Было показано, что у эукариот PRIMPOL, уникальная ДНК-полимераза с активностью примазы, способна возобновить синтез ДНК после репликации, блокирующей поражение через ее выговорную активность 6,7,8,9,10,11. Таким образом, активность примазы PRIMPOL может объяснить образование пострепликативных разрывов ссДНК в ведущей цепи при лечении повреждающим ДНК агентом в клетках человека12. Тем не менее, обнаружение этих пробелов, а также восстановление зазоров до недавнего времени требовало косвенных или трудоемких подходов, таких как электронная микроскопия4 или анализы на основе плазмид13. Использование специфической для ssDNA нуклеазы S1 для обнаружения пробелов в клетках человека было впервые предложено ранними исследованиями более сорока лет назад с использованием методов градиента сахарозы 2,3. Совсем недавно наша группа применила использование этой нуклеазы для обнаружения ssDNA в репликации ДНК (пострепликтивные промежутки) с использованием других методов, таких как ДНК-волокно и кометные анализы14. Эти новые подходы проложили путь к нынешнему всплеску исследований пострепликационных пробелов. Здесь мы описываем стратегию использования нуклеазы S1 для обнаружения пострепликативных разрывов ssDNA с помощью анализа волокон ДНК и объясняем, как схема дифференциальной маркировки в протоколе волокна ДНК может позволить изучить восстановление этих пробелов.

Анализ волокон ДНК является мощным методом, который используется растущим числом лабораторий и дает ценную информацию о динамике репликационной вилки и механизмах реакции на стресс репликации. Вкратце, этот метод основан на последовательном включении аналогов нуклеотидов (таких как CldU -5-хлор-2'-дезоксиуридин- и IdU-5-йодо-2'-дезоксиуридин) в реплицирующуюСЯ ДНК. После сбора клеток лизируют, а молекулы ДНК распространяются на стеклянном предметном стекле с положительным покрытием. CldU и IdU затем обнаруживаются специфическими антителами, которые могут быть визуализированы в флуоресцентном микроскопе в виде двухцветных волокон. Наконец, длины трактов IdU и CldU измеряются для выявления любых изменений динамики репликации ДНК в результате индукции повреждения ДНК. Этот метод может быть использован для исследования различных явлений, таких как сваливание вилки, замедление вилки, зарождающаяся деградация ДНК и вариации частоты запуска источника15,16.

Одним из ограничений анализа волокна ДНК является его разрешение в несколько килобаз. Поскольку пострепликтивные пробелы ssDNA могут находиться в диапазоне сотен оснований, невозможно визуализировать эти промежутки непосредственно по стандартному протоколу волокна ДНК. Наличие пробелов ssDNA в репликации ДНК в клетках человека, обработанных генотоксическими агентами, косвенно упоминалось ранее. Например, наблюдение за ssDNA, оцениваемой по набору ssDNA-связывающего белка, репликационного белка A (RPA) в клетках вне S-фазы или образованию ssDNA, обнаруженному при раскручивании щелочной ДНК в сочетании с отсутствием длительного сваливания вилки анализом днк-волокна 12,17,18,19,20,21 было связано с накоплением пробелов в сдНК. Кроме того, пострепликтивные разрывы ssDNA индуцируют ATR-зависимую контрольную точку фазы G2/M и арест клеток, обработанных ядами репликации 18,19,20,21,22.

Нуклеаза S1 разлагает одноцепочечные нуклеиновые кислоты, высвобождая 5'-фосфорилмоно- или олигонуклеотиды, и имеет в 5 раз более высокое сродство к ssDNA по сравнению с РНК. Двухцепочечные нуклеиновые кислоты (ДНК: ДНК, ДНК: РНК или РНК: РНК) устойчивы к нуклеазе S1, за исключением случаев, когда они используются в чрезвычайно высоких концентрациях. Нуклеаза S1 также расщепляет двухцепочечную ДНК в одноцепочечной области, вызванной ником, разрывом, несоответствием или петлей. Таким образом, нуклеаза S1 представляет собой специфическую для ssDNA эндонуклеазу, способную расщеплять промежутки ssDNA, в конечном итоге генерируя двухцепочечные разрывы23,24. Таким образом, добавление шагов для переваривания нуклеазы S1 в протокол волокна ДНК косвенно позволяет обнаружить пострепликтивные пробелы ssDNA. При наличии пробелов обработка открытых ядер нуклеазой S1 до распространения ДНК будет генерировать более короткие тракты в результате расщепления SsDNA SsDNA, по своей сути присутствующего в промежутках14. Соответственно, сокращение тракта является считыванием пробелов в СДНК с использованием этого подхода. По сравнению со стандартным протоколом ДНК-волокна, ДНК-волокно с нуклеазой S1 требует только двух дополнительных этапов: воздействия на ядра (клеточная пермеабилизация) и лечения нуклеазой S1. Важно отметить, что соответствующие средства контроля являются обязательными, такие как образцы, обработанные генотоксическим агентом, но без нуклеазы S1, и образцы, обработанные нуклеазой S1 без генотоксического агента. Сам протокол, включая включение аналогов, обработку S1 и распространение, может быть выполнен за один день и не требует исключительного материала. Для этого требуются только аналоги тимидина, очищенная нуклеаза S1, соответствующие первичные и вторичные антитела и флуоресцентный микроскоп. В целом, днк-волокно, использующее нуклеазу S1, обнаруживает пробелы ssDNA на текущих репликационных вилках, используя относительно простой подход.

Пострепликтивные пробелы сдНК, образовавшиеся в результате механизмов реакции на стресс репликации, могут быть восстановлены (или заполнены) различными механизмами, включая транслейционный синтез ДНК или переключение шаблонов, в процессе, называемом заполнением пробелов или пострепликационным восстановлением (PRR)25. Эти процессы происходят за наступающими форками, включая репликационно-независимый синтез ДНК 14,26,27. Основываясь на этих результатах, схема маркировки, отличная от стандартного анализа волокна ДНК, может быть выполнена для визуализации событий заполнения пробелов в фазе G2 непосредственно 14,16,26,28. В частности, один аналог тимидина может быть использован для маркировки репликационной вилки во время генотоксического лечения и пострепликтивного образования пробелов сдДНК, в то время как другой аналог тимидина может быть использован для маркировки событий заполнения пробелов. В этом протоколе клетки маркируются первым аналогом тимидина (например, IdU) сразу после или одновременно с генотоксическим лечением в течение 1 ч, так что зарождающаяся ДНК мечится в момент образования разрыва. Нокодазол добавляют после лечения в течение 12-24 ч для ареста клеток в G2 / M, предотвращая следующую S-фазу. В течение последних 4 ч лечения нокодазолом второй аналог тимидина (cldU, например) добавляют в среду, которая будет включена во время заполнения пробелов. Важно отметить, что этот анализ может быть использован только для обнаружения событий заполнения пробелов в G2, поскольку сигнал заполнения пробелов от CldU не может быть отличим от сигнала из-за включения CldU в репликацию ДНК в S-фазе. Поэтому, чтобы свести к минимуму фоновый сигнал, время включения CldU после индукции повреждения должно совпадать с тем, когда большая часть клеточной популяции входит в фазу G214. Поэтому эти сроки будут варьироваться в зависимости от клеточной линии и условий лечения. Рекомендуется оптимизировать прогрессию клеточного цикла перед использованием этого анализа. Совместное окрашивание этих аналогов тимидина позволяет визуализировать участки, заполняющие пробелы (PRR) (пластыри CldU) поверх зарождающейся ДНК (тракты IdU), синтезированной во время генотоксического лечения, когда были созданы пробелы ssDNA.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Поскольку в исследовании используются человеческие клетки, работа была одобрена Комитетом по этике Института биомедицинских наук при Университете Сан-Паулу (ICB-USP, номер одобрения No 48347515.3.00005467) для исследования с образцами человека.

ПРИМЕЧАНИЕ: Протоколы, описанные здесь, использовались в предыдущих публикациях с незначительными изменениями 14,16,28. Здесь основное внимание уделяется использованию ультрафиолетового света C (UVC) в качестве агента, повреждающего ДНК. Тем не менее, другие повреждающие ДНК агенты, такие как цисплатин и гидроксимочевина, также были успешно использованы28. Этот протокол может быть выполнен в массиве клеточных линий, включая U2OS, HEK293T, фибробласты человека и другие 14,28,29. Важно определить экспериментальный вопрос перед выполнением этого протокола. Анализ волокна ДНК с нуклеазой S1 (далее называемый волокном S1) используется для обнаружения наличия пострепликативных пробелов ssDNA, в то время как анализ заполнения пробелов (или PRR) выполняется для количественной оценки событий заполнения пробелов в фазе G2. Таким образом, при анализе наличия пострепликативных пробелов ssDNA исследователь должен выполнить раздел 2 (экспериментальная установка S1 Fiber) и перейти непосредственно к разделу 4 (подготовка волокна ДНК путем распространения) протокола. При анализе событий заполнения пробелов исследователь должен перейти непосредственно к разделу 3 (экспериментальная установка для заполнения пробелов (PRR)).

1. Реагенты и установка

  1. Аналоги тимидина: ресуспенд 5-йодо-2'-дезоксиуридин (IdU) и 5-хлор-2'-дезоксиуридин (CldU) в 1 N NH4OH до конечной концентрации 100 мМ. Отфильтруйте аналоги через стерильный шприцевой фильтр (0,2 мкм), аликвоту и храните их при -20 С.
  2. Антитела: Первичные - анти-BrdU крысы (Biorad) и анти-BrdU мыши (BD); Второстепенные - анти-крысиный Alexa Fluor 488 и антимышечный Alexa Fluor 594.
  3. Буфер клеточной пермеабилизации CSK100 для волокна S1: добавьте 100 мМ NaCl, 10 мМ MOPS [pH 7], 3 мМ MgCl2 [pH 7,2], 300 мМ сахарозы и 0,5% Тритона X-100 в дистиллированномH2O.
  4. Буфер нуклеазы S1 [pH 4,6]: Добавьте 30 мМ ацетата натрия [рН 4,6], 10 мМ ацетата цинка, 50 мМ NaCl и 5% глицерина вH2O.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер нуклеазы S1 должен иметь конечный рН 4,6, так как активность S1 падает на 50% при рН > 4,9.
  5. Aliquot и хранить при -20 °C нуклеазу S1, очищенную от A. oryzae , предварительно разбавленную в буфере разбавления нуклеазы S1, предоставленном производителем.
  6. Восстановите нокодазол в ДМСО до конечной концентрации 2 мМ для заполнения зазоров. проба.
  7. Буфер лизиса: Добавьте 200 мМ Tris-HCl [pH 7,5], 50 мМ ЭДТА и 0,5 % SDS вH2O.
  8. Готовят фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS).
  9. Подготовьте PBS-T, добавив 0,1% Tween-20 в PBS.
  10. Приготовьте 5% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в PBS.
  11. Приготовьте 0,1% BSA в PBS.
  12. Подготовьте PBS-T-BSA, добавив 1% BSA в PBS-T.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте эпифлуоресцентный микроскоп с ртутной или ксеноновой лампой с волной волны 510 нм и полосой пропускания 42 нм GFP (FITC, Alexa Fluor 488) и эмиссионным фильтром 624 нм и полосой пропускания 40 нм Texas Red (Alexa Fluor 594) или конфокальный микроскоп с линейным (синим) лазером 488 нм для обнаружения зеленой флуоресценции (обнаруженной между 510 и 560 нм) и 561-нм линейным (желтым) лазером для обнаружения красной флуоресценции ( обнаружен между 575 и 680 нм). Погружной объектив (40x, 63x или 100x).

2. Экспериментальная установка S1 Fiber (2 дня)

  1. День 1: Пластина 4 лунки для каждой клеточной линии: ± UVC и ± S1 нуклеазы с клетками при 70-90% слиянии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперимент может быть проведен в формате размером с 12-луночную пластину. В этом случае используются все растворы по 0,5 мл/лунка.
  2. День 2: Приготовьте свежий IdU при 20 мкМ и CldU при 200 мкМ в предварительно подогретой (37 °C) среде для культивирования клеток.
  3. Аспирировать культуральную среду и немедленно добавить среду с 20 мкМ IdU и инкубировать клетки при 37 °C, 5% CO2 (клеточный инкубатор) в течение ровно 20 мин.
  4. Быстро промывайте клетки предварительно нагретым (37 °C) PBS дважды.
  5. Облучение клеток 20 Дж/м2 UVC. Используйте необработанные клетки в качестве элементов управления.
  6. Немедленно добавьте среду с 200 мкМ CldU и инкубируйте клетки при 37 °C, 5% CO2 (клеточный инкубатор) в течение ровно 60 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Маркировка IdU и CldU может быть взаимозаменяемой, но концентрация второго аналога должна быть в 5-10 раз выше, чем у первого аналога. Сроки аналоговой инкубации могут быть адаптированы к используемому генотоксическому агенту, но время второй аналоговой инкубации должно быть достаточно длительным, чтобы обеспечить достаточное время для образования разрыва14,16. При использовании препарата, повреждающего ДНК, добавьте препарат вместе с CldU 28,29,30.
  7. Промыть ячейки предварительно подогретым (37 °C) PBS дважды.
  8. Пермеабилизируйте клетки буфером CSK100 в течение 8-10 мин при комнатной температуре (RT).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Успешная пермеабилизация может быть проверена под микроскопом яркого поля, где должны наблюдаться только ядра.
  9. Тщательно промыть ядра PBS (вылить 0,5 мл вниз по бокам каждой лунки, всего на несколько секунд).
  10. Тщательно промыть ядра буфером S1 (вылить 0,5 мл вниз по бокам каждой лунки, всего на несколько секунд).
  11. Инкубировать ядра с буфером S1 с нуклеазой S1 (20 Ед/мл) или без (в качестве контроля) в течение 30 мин при 37 °C (клеточный инкубатор).
  12. Аспирация буфера S1 и добавление 0,1% BSA в PBS.
  13. Соскоблите ядра и перенесите их в соответствующим образом аннотированную трубку объемом 1,5 мл. Держите трубки на льду все время.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Успешное отсоединение ядер может быть проверено под ярким микроскопом.
  14. Гранулирование ядер: центрифуга при ~4600 х г в течение 5 мин, при 4 °С.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В отличие от стандартного анализа волокон ДНК, ядра не могут быть подсчитаны, поэтому рассмотрим начальное количество клеток, покрытых. Альтернативно, дополнительный колодец, который не подвергался пермеабилизации, может быть использован для оценки количества клеток с помощью гемоцитометра или счетчика клеток.
  15. Повторно суспендировать гранулы хорошо в PBS в концентрации ~1500 клеток/мкл, поместить пробирки на лед и немедленно приступить к получению волокна ДНК путем немедленного распространения (раздел 4) протокола

3. Экспериментальная установка для заполнения пробелов (PRR) (3 дня)

  1. День 1: Пластина 2 скважины для каждой клеточной линии: ± UVC с ячейками при слиянии ~ 70%.
  2. День 2: Приготовьте свежий IdU при 20 мкм в предварительно подогретой (37 °C) среде для культивирования клеток.
  3. Облучение клеток 20 Дж/м2 UVC.
  4. Немедленно добавьте среду с 20 мкМ IdU и инкубируйте клетки при 37 °C, 5% CO2 (клеточный инкубатор) в течение ровно 60 мин.
  5. Промыть ячейки предварительно подогретым (37 °C) PBS дважды.
  6. Немедленно добавляют среду с 200 нг/мл нокодазола и инкубируют клетки при 37 °C, 5% CO2 (клеточный инкубатор) в течение 12-24 ч (сроки этой стадии должны быть согласованы между экспериментами).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрацию нокодазола, возможно, потребуется адаптировать в соответствии с используемой клеточной линией. При использовании генотоксического препарата инкубируют клетки с препаратом28 ± IdU.
  7. День 3: Аспирировать культуральную среду, добавить среду с 20 мкМ CldU + нокодазолом и инкубировать в течение последних 4 ч обработки нокодазолом при 37 °C, 5% CO2 (клеточный инкубатор).
  8. Промывайте ячейки предварительно подогретым (37 °C) PBS.
  9. Добавляют трипсин и инкубируют в течение 1-2 мин при 37 °C, 5% CO2 (клеточный инкубатор) для отделения клеток.
  10. Добавьте тот же объем клеточной культуральной среды и соберите клетки (среда + трипсин) в соответствующим образом аннотированную пробирку объемом 1,5 мл. Держите трубки на льду все время.
  11. Подсчитывайте клетки с помощью гемоцитометра или счетчика клеток.
  12. Гранулированные ячейки: центрифуга при ~350 х г в течение 5 мин, при 4 °C.
  13. Удалите супернатант и повторно суспендируйте клетки в PBS при ~ 1500 клетках / мкл. Держите клетки на льду и начните подготовку волокна ДНК путем немедленного распространения протокола (день 3 или 4).

4. Подготовка волокна ДНК путем распространения (~1 ч на 12 слайдов)

  1. Аннотируйте слайды микроскопа углеродным карандашом и разложите их плоско на подносе.
  2. Постучите по нижней части трубки, чтобы обеспечить гомогенизацию.
  3. Добавьте 2 мкл клеток в верхнюю часть соответствующего слайда.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Можно добавить две капли, одну в верхней части слайда, а другую в середине слайда.
  4. Добавьте 6 мкл буфера лизиса и лизируйте клетки, пипетируя вверх и вниз примерно 5 раз (избегайте образования пузырьков).
  5. Потяните каплю немного к нижней части горки кончиком пипетки (чтобы направить путь распространения капли).
  6. Инкубировать в течение 5 мин при РТ для лизирования ядер.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объем буфера лизиса и время лизиса могут быть скорректированы, если лизат высыхает слишком быстро или, в качестве альтернативы, недостаточно высыхает. Объем буфера лизиса может варьироваться от 5-7 мкл, а время может приходиться на 4-10 минут.
  7. Наклоните затвор примерно на 20-40° и позвольте капле распространиться на дно слайда с постоянной, низкой скоростью.
  8. Дайте слайду высохнуть при RT в темноте (10-15 мин).
  9. Свежеприготовьте фиксирующий раствор: Смешайте метанол: ледниковую уксусную кислоту в соотношении 3:1.
  10. Погрузите слайды в банку, содержащую фиксирующий раствор, и высиживайте в течение 5 минут на RT, чтобы зафиксировать ДНК на слайдах.
    ВНИМАНИЕ: Метанол очень токсичен и должен храниться под химическим капотом. Выбросить в соответствующий контейнер.
  11. Высушите горки при RT в темноте и храните при 4 °C, защищенные от света до окрашивания.

5. Иммуноокрашивание волокон ДНК (~6 ч)

  1. Мойте слайды PBS дважды в течение 5 минут.
  2. Денатурировать ДНК свежеприготовленными 2,5 М HCl в течение 40-60 мин при RT.
    ВНИМАНИЕ: Чтобы приготовить 2,5 М HCl, влейте кислоту в воду и никогда не наоборот. Это экзотермическая реакция, поэтому она будет немного нагреваться.
  3. Мойте слайды с PBS три раза в течение 5 минут.
  4. Блок с 5% BSA (может храниться при 20 °C до трех применений), предварительно нагретый при 37 °C в течение 30-60 мин при 37 °C.
  5. Удалите лишнюю жидкость со слайдов, осторожно постукивая по бумаге.
  6. Добавьте 30 мкл первичных антител (мышиный анти-BrdU 1/20 (для IdU) и крысиный анти-BrdU 1/100 (для CldU), разведенных в PBS-T-BSA) к слайдам по каплям и поместите сверху крышку. Инкубировать в течение 1-1,5 ч при РТ в темной, влажной камере.
  7. Поместите слайды в банку с PBS на 1-2 мин, затем аккуратно снимите крышки.
  8. Вымойте PBS-T в банке три раза в течение 5 минут, затем поместите слайды в PBS.
  9. Удалите лишнюю жидкость, осторожно постукивая по бумаге.
  10. Добавьте 30 мкл вторичных антител (против мыши Alexa Fluor 594 и анти-крыс Alexa Fluor 488, разведенных на 1/75 в PBS-T-BSA.) к слайдам по каплям и поместите крышку сверху. Инкубировать в течение 45-60 мин при РТ в темной, влажной камере.
  11. Поместите слайды в банку с PBS на 1-2 мин, затем аккуратно снимите крышки.
  12. Вымойте PBS-T в банке три раза в течение 5 минут, затем поместите слайды в PBS.
  13. Удалите лишнюю жидкость, осторожно постукивая по бумаге.
  14. Добавьте 20 мкл монтажного реагента по каплям к слайдам и поместите сверху крышку. Избегайте пузырьков.
  15. Дайте слайдам высохнуть при RT в темноте, затем храните при 4 °C (или -20 °C для более длительного сохранения).

6. Получение и анализ изображений (~1 ч на образец)

ПРИМЕЧАНИЕ: Эпифлуоресцентный микроскоп может быть использован для обоих протоколов. Тем не менее, для анализа заполнения пробелов (PRR) использование конфокального микроскопа настоятельно рекомендуется для увеличения разрешения изображений.

  1. Поместите каплю погружного масла (для микроскопа) в верхней части слайда, где ячейки были лизированы, и найдите фокус, используя зеленый канал, выполнив поиск зеленых точек на заднем плане (можно использовать цели 40x, 63x и 100x).
  2. Найдите основную концентрацию волокон и переместитесь к краям, чтобы найти хорошо распределенные неперекрывающиеся отдельные волокна, используя только один канал для выбора областей для изображений и избежать потенциального смещения.
  3. Сделайте около 15-20 снимков на слайд вместе со всем слайдом на зеленом и красном каналах и объедините два канала, чтобы получить двухцветные волокна ДНК.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании конфокального микроскопа делайте снимки с высоким разрешением (1024 x 1024 пикселей) и используйте значения точечных отверстий, близкие к 1, для красной и зеленой флуоресценции.
  4. Используйте ImageJ (бесплатное программное обеспечение, предоставляемое NIH, https://imagej.nih.gov/ij/) для измерения длины трактов IdU и CldU.
    1. Откройте рисунок, перетащив его в поле ImageJ.
    2. Используйте шкалу, сгенерированную программным обеспечением микроскопа (соответствующим образом откалиброванную), для преобразования длины в микрометры. Используйте инструмент «Прямая линия », щелкнув5-й значок слева направо на поле ImageJ, чтобы измерить шкалу на предоставленном изображении микрометров и получить измерение в пикселях. Нажмите «Анализировать > «Установить масштаб » и замените «расстояние в пикселях» соответствующим числом, а «единицу длины» на мкм.
    3. В поле ImageJ выберите инструмент «Сегментированная линия », щелкнув левой кнопкоймыши 5-й значок слева направо, а затем выбрав второй вариант сверху вниз.
    4. Нарисуйте точный контур красного (IdU) или зеленого (CldU) тракта, щелкнув левой кнопкой мыши, и остановите рисунок, щелкнув правой кнопкой мыши. Нажмите кнопку M на клавиатуре, чтобы измерить длину.
    5. Для волокна S1 анализируйте только красно-зеленый (двухцветные волокна)16. Измеряйте длину красного и зеленого трактов по крайней мере из 150 волокон из разных изображений, отслеживая измерения красного и зеленого трактов для каждого отдельного волокна.
    6. Для анализа заполнения пробелов измеряйте только длину трактов IdU (красный), которые содержат не менее 1 CldU (зеленого) пятна, но не имеют непрерывного окрашивания CldU. Наберите не менее 10-15 трактов IdU с разных снимков с не менее чем 1 пластырем CldU.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа можно использовать другое программное обеспечение, например, Zeiss LSM Image Browser.
  5. Для волокон S1 отобразите длину трактов IdU, длину трактов CldU и соотношения (CldU/IdU или наоборот) в отдельной графике в виде точечных графиков с медианами.
  6. Измерьте события заполнения пробелов как единицы «плотности на килобаза», разделите общее количество участков CldU (PRR, зеленый) на заданную длину тракта IdU (красный) на общую длину красного тракта в килобазах (учитывая 1 мкм = 2,59 килобаз31). Затем отобразите данные в виде точечных диаграмм с медианами.
  7. В обоих экспериментах выполните статистический анализ между двумя выборками с использованием Манн-Уитни (непараметрический тест) и между более чем двумя выборками с использованием Крускала-Уоллиса с последующим тестом множественных сравнений Данна.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В анализе S1 Fiber, если обработка генотоксическим агентом приводит к пострепликативным пробелам ssDNA, общая длина волокон ДНК из Ядер, обработанных S1, будет короче при лечении повреждением ДНК по сравнению с необработанными образцами, а также с образцами, которые были обработаны генотоксическим агентом, но не были представлены на расщепление S1 (рисунок 1).

В качестве альтернативы, если лечение нуклеазой S1 существенно не влияет на длину волокон ДНК по сравнени...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Критические шаги стандартного протокола анализа днк-волокна обсуждались в предыдущей публикации32. Здесь мы описываем модифицированные версии стандартного анализа волокон ДНК для исследования наличия пострепликативных пробелов ssDNA, а также их восстановления путем заполнения пробелов, первоначально описанных в14. В контексте пострепликативного присутствия разрыва ssDNA использование нуклеазы S1 в протоколе S1 Fiber, скорее всего, будет подходящим после воздействия генотокс...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Работа в лаборатории C.F.M.M. поддерживается Фондом Ампаро в Пескизе на эстаду Сан-Паулу (FAPESP, Сан-Паулу, Бразилия, Гранты No 2019/19435-3, #2013/08028-1 и 2017/05680-0) в рамках Международного сотрудничества исследований от FAPESP и Нидерландской организации научных исследований (NWO, Нидерланды); Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, Brasília, DF, Brazil, Grants # 308868/2018-8] и Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal do Ensino Superior (CAPES, Brasília, DF, Brazil, Finance Code 001).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Уксусная кислота, Ледянойсинтезатор64-19-7Альтернативно, BSA - Biosera - REF PM-T1725/100
Синтез гидроксида аммония1336-21-6Или аналогичное
антитело против мыши IgG1 Alexa Fluor 594InvitrogenA11005-Антитело
против крысы Alexa Fluor 488InvitrogenA21470-Антитело
мыши против BrdUBecton Disckson347580-Антитело
Крыса анти-BrdUAbcam  Ab6326-Капюшон
биологической безопасностиPachanePA 410Используйте капюшон, присутствующий в лаборатории
BSA (Bovine Serum Albumin)Sigma-AldrichA3294Или аналогичный
скребокдля клеток Thermo Scientific179693Или аналогичный
CldUMillipore-SigmaC6891-Cloridricacid
Synth7647-01-0Или аналогичные
конфокальные стекла Zeiss серии LSM (7, 8 или 9)Zeiss-Или аналогичные
покровные стекла (или покровные стекла)Thermo Scientific152460В качестве альтернативы, Olen - Kasvi Cover Glass (24 x 60 мм) - K5-2460
DMEM - High GlucoseLGC/GibcoBR30211-05/12100046Используйте питательные среды, специфичные для используемой клеточной линии.
ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота динатриевая соль дигидрат)Sigma-AldrichE5314Или аналогичный
эпифлуоресцентный микроскоп Axiovert 200Zeiss-Илианалогичный
FBS (фетальная бычья сыворотка)Gibco12657-029Или аналогичный
Forma Series II Инкубатор CO2 с водяной рубашкойThermo Scientific 311013-998-074Используйте клеточный инкубатор, присутствующий в лабораторная
стеклянная предметная банкаSigma-AldrichS5516Или аналогичная
ГлицеринSigma-Aldrich56-81-5Или аналогичная
IduMillipore-SigmaI7125-Magnesium
ChlorideSynth7791-18-6Или аналогичная
метанолMerck67-56-1Или аналогичная
предметные стекла микроскопаDenvilleM1021Альтернативно, Olen - Предметные стекла для микроскопа Kasvi - K5-7105 OR Прецизионная стеклянная линия - 7105-1
MOPS (á CIDO 3-morfolinopropano 1-sulfô nico)Synth1132-61-2Или аналогичный
NocodazoleSigma-Aldrich31430-18-9-PBS
(Phosphate Buffer Salt)Life Thechnologies3002Или аналогичный
Пенициллин-СтрептомицинGibco15140122Или аналогичный
ProLong Gold AntiFade MountantInvitrogenP36930Любой раствор против выцветания иммунофлуоресценция может быть использована
нуклеазой S1, выделенной из Aspergillus oryzaeInvitrogen18001-016Предварительно разведите нуклеазу S1 (1/100 - 1/200) в буфере для разведения нуклеазы S1, предоставленном производителем, аликвотируйте и храните при -20 °°; C
SDS (Додецилсульфат натрия)BioRad161-0302Или аналогичный
Тригидрат ацетата натрияSigma-Aldrich6131-90-4Или аналогичный
Sodium ChlorideSynth  7647-14-5Или аналогичная
сахарозаSigma-Aldrich57-50-1Или аналогичная
Tris BaseWest Lab ResearchBP152-1Или аналогичная
Triton X-100Synth9002-93-1Или аналогичная
TrypsinGibco25200072Или аналогичная
Tween 20Sigma-AldrichP1379Или аналогичная
лампа UVCНеспецифические-существенные: длина излучения 254 нм
VLX-3W УФ-радиометрVilber Loumart-Илианалогичный
ацетат цинкаSigma-Aldrich557-34-6или аналогичный

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rupp, W. D., Howard-Flanders, P. Discontinuities in the DNA synthesized in an excision-defective strain of Escherichia coli following ultraviolet irradiation. Journal of Molecular Biology. 31 (2), 291-304 (1968).
  2. Meneghini, R. Gaps in DNA synthesized by ultraviolet light-irradiated WI38 human cells. Biochimica et Biophysica Acta. 425 (4), 419-427 (1976).
  3. Meneghini, R., Cordeiro-Stone, M., Schumacher, R. I. Size and frequency of gaps in newly synthesized DNA of xeroderma pigmentosum human cells irradiated with ultraviolet light. Biophysical Journal. 33 (1), 81-92 (1981).
  4. Lopes, M., Foiani, M., Sogo, J. M. Multiple mechanisms control chromosome integrity after replication fork uncoupling and restart at irreparable UV lesions. Molecular Cell. 21 (1), 15-27 (2006).
  5. Heller, R. C., Marians, K. J. Replication fork reactivation downstream of a blocked nascent leading strand. Nature. 439 (7076), 557-562 (2006).
  6. Bianchi, J., et al. PrimPol bypasses UV photoproducts during eukaryotic chromosomal DNA replication. Molecular Cell. 52 (4), 566-573 (2013).
  7. García-Gómez, S., et al. PrimPol, an archaic primase/polymerase operating in human cells. Molecular Cell. 52 (4), 541-553 (2013).
  8. Mourón, S., et al. Repriming of DNA synthesis at stalled replication forks by human PrimPol. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (12), 1383-1389 (2013).
  9. Wan, L., et al. hPrimpol1/CCDC111 is a human DNA primase-polymerase required for the maintenance of genome integrity. EMBO Reports. 14 (12), 1104-1112 (2013).
  10. Keen, B. A., Jozwiakowski, S. K., Bailey, L. J., Bianchi, J., Doherty, A. J. Molecular dissection of the domain architecture and catalytic activities of human PrimPol. Nucleic Acids Research. 42 (9), 5830-5845 (2014).
  11. Tirman, S., Cybulla, E., Quinet, A., Meroni, A., Vindigni, A. PRIMPOL ready, set, reprime. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 56 (1), 17-30 (2021).
  12. Quinet, A., Lerner, L. K., Martins, D. J., Menck, C. F. M. Filling gaps in translesion DNA synthesis in human cells. Mutation Research, Genetic Toxicology Environmental Mutagenesis. 836, 127-142 (2018).
  13. Ziv, O., Diamant, N., Shachar, S., Hendel, A., Livneh, Z. Quantitative measurement of translesion DNA synthesis in mammalian cells. DNA Repair Protocols. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Bjergbæk, L. 920, Humana Press. Totowa, NJ. (2012).
  14. Quinet, A., et al. Translesion synthesis mechanisms depend on the nature of DNA damage in UV-irradiated human cells. Nucleic Acids Research. 44 (12), 5717-5731 (2016).
  15. Técher, H., et al. Replication dynamics: biases and robustness of DNA fiber analysis. Journal of Molecular Biology. 425 (23), 4845-4855 (2013).
  16. Quinet, A., Carvajal-Maldonado, D., Lemacon, D., Vindigni, A. DNA fiber analysis: Mind the gap. Methods in Enzymology. 591, 55-82 (2017).
  17. Elvers, I., Johansson, F., Groth, P., Erixon, K., Helleday, T. UV stalled replication forks restart by re-priming in human fibroblasts. Nucleic Acids Research. 39 (16), 7049-7057 (2011).
  18. Diamant, N., et al. DNA damage bypass operates in the S and G2 phases of the cell cycle and exhibits differential mutagenicity. Nucleic Acids Research. 40 (1), 170-180 (2012).
  19. Temviriyanukul, P., et al. Temporally distinct translesion synthesis pathways for ultraviolet light-induced photoproducts in the mammalian genome. DNA Repair. 11 (6), 550-558 (2012).
  20. Jansen, J. G., et al. Redundancy of mammalian Y family DNA polymerases in cellular responses to genomic DNA lesions induced by ultraviolet light. Nucleic Acids Research. 42 (17), 11071(2014).
  21. Quinet, A., et al. Gap-filling and bypass at the replication fork are both active mechanisms for tolerance of low-dose ultraviolet-induced DNA damage in the human genome. DNA Repair. 14 (1), 27-38 (2014).
  22. Callegari, A. J., Clark, E., Pneuman, A., Kelly, T. J. Postreplication gaps at UV lesions are signals for checkpoint activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (18), 8219-8224 (2010).
  23. Vogt, V. M. Purification and further properties of single-strand-specific nuclease from Aspergillus oryzae. European Journal of Biochemistry. 33 (1), 192-200 (1973).
  24. Cordeiro-Stone, M., Schumacher, R. I., Meneghini, R. Structure of the replication fork in ultraviolet light-irradiated human cells. Biophysical Journal. 27 (2), 287-300 (1979).
  25. Lehmann, A. R., Fuchs, R. P. Gaps and forks in DNA replication: Rediscovering old models. DNA Repair (Amst). 5 (12), 1495-1498 (2006).
  26. Daigaku, Y., Davies, A. A., Ulrich, H. D. Ubiquitin-dependent DNA damage bypass is separable from genome replication. Nature. 465 (7300), 951-955 (2010).
  27. Karras, G. I., Jentsch, S. The RAD6 DNA damage tolerance pathway operates uncoupled from the replication fork and is functional beyond S phase. Cell. 141 (2), 255-267 (2010).
  28. Tirman, S., et al. Temporally distinct post-replicative repair mechanisms fill PRIMPOL-dependent ssDNA gaps in human cells. Molecular Cell. 81 (19), 4026-4040 (2021).
  29. Cong, K., et al. Replication gaps are a key determinant of PARP inhibitor synthetic lethality with BRCA deficiency. Molecular Cell. 81 (15), 3128-3144 (2021).
  30. Quinet, A., et al. PRIMPOL-mediated adaptive response suppresses replication fork reversal in BRCA-deficient cells. Molecular Cell. 77 (3), 461-474 (2020).
  31. Jackson, D. A., Pombo, A. Replicon clusters are stable units of chromosome structure: evidence that nuclear organization contributes to the efficient activation and propagation of S phase in human cells. The Journal of Cell Biology. 140 (6), 1285-1295 (1998).
  32. Schwab, R. A., Niedzwiedz, W. Visualization of DNA replication in the vertebrate model system DT40 using the DNA fiber technique. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (56), e3255(2011).
  33. Simoneau, A., Xiong, R., Zou, L. The trans cell cycle effects of PARP inhibitors underlie their selectivity toward BRCA1/2-deficient cells. Genes & Development. 35 (17-18), 1271-1289 (2021).
  34. Taglialatela, A., et al. REV1-Polζ maintains the viability of homologous recombination-deficient cancer cells through mutagenic repair of PRIMPOL-dependent ssDNA gaps. Molecular Cell. 81 (19), 4008-4025 (2021).
  35. Lim, K. S., et al. USP1 Is required for replication fork protection in BRCA1-deficient tumors. Molecular Cell. 72 (6), 925-941 (2018).
  36. Peng, M., et al. Opposing roles of FANCJ and HLTF protect forks and restrain replication during stress. Cell Reports. 24 (12), 3251-3261 (2018).
  37. Huang, J., et al. The DNA translocase FANCM/MHF promotes replication traverse of DNA interstrand crosslinks. Molecular Cell. 52 (3), 434-446 (2013).
  38. Ding, W., Bishop, M. E., Lyn-Cook, L. E., Davis, K. J., Manjanatha, M. G. In vivo alkaline comet assay and enzyme-modified alkaline comet assay for measuring DNA strand breaks and oxidative DNA damage in rat liver. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (111), e53833(2016).
  39. Lu, Y., Liu, Y., Yang, C. Evaluating in vitro DNA damage using comet assay. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e56450(2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

DNA Fiber AssayReplication Fork DynamicsPost Replicative GapsS1 NucleaseSingle Stranded DNAGap Filling AssayDNA Replication StressGenome IntegrityImmunodetection MethodDNA Damage Repair

Related Articles