Анализ взаимодействия флуоресцентно-меченых белков с искусственными фосфолипидными микровезикулами с помощью количественной проточной цитометрии

Nadezhda Podoplelova; Polina Soloveva; Andrei Garzon Dasgupta; Aleksandra Filkova; Mikhail Panteleev

doi:10.3791/63459

Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Анализ взаимодействия флуоресцентно-меченых белков с искусственными фосфолипидными микровезикулами с помощью количественной проточной цитометрии

2.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/63459

⸱

6 апреля 2022 г.

Nadezhda Podoplelova¹^,² , Polina Soloveva¹^,⁴ , Andrei Garzon Dasgupta¹^,²^,³ , Aleksandra Filkova¹^,² , Mikhail Panteleev¹^,²^,³^,⁴

¹Center for Theoretical Problems of Physicochemical Pharmacology, Russian Academy of Sciences, ²National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology named after Dmitry Rogachev, ³Faculty of Physics, Lomonosov Moscow State University, ⁴Faculty of Biological and Medical Physics, Moscow Institute of Physics and Technology

В этой статье

Краткое содержание

Здесь описан набор методов характеристики взаимодействия белков с мембранами клеток или микровезикулами.

Аннотация

В организме человека большинство основных физиологических реакций, участвующих в иммунном ответе и свертывании крови, протекают на мембранах клеток. Важным первым шагом в любой мембранозависимой реакции является связывание белка на фосфолипидной мембране. Разработан подход к изучению взаимодействия белков с липидными мембранами с использованием флуоресцентно меченых белков и проточной цитометрии. Этот метод позволяет изучать белково-мембранные взаимодействия с использованием живых клеток и природных или искусственных фосфолипидных везикул. Преимуществом данного метода является простота и доступность реагентов и оборудования. В этом методе белки маркируются с помощью флуоресцентных красителей. Тем не менее, могут использоваться как самодельные, так и коммерчески доступные, флуоресцентно меченые белки. После конъюгации с флуоресцентным красителем белки инкубируют с источником фосфолипидной мембраны (микровезикулами или клетками), а образцы анализируют методом проточной цитометрии. Полученные данные могут быть использованы для расчета кинетических констант и равновесия K_d. Кроме того, можно оценить приблизительное количество сайтов связывания белка на фосфолипидной мембране с помощью специальных калибровочных шариков.

Введение

Биомембраны разделяют внутреннее содержимое клеток животных и внеклеточное пространство. Обратите внимание, что мембраны также окружают микровезикулы, образующиеся в течение жизненного цикла клетки, и органеллы. Клеточная мембрана преимущественно состоит из липидов и белков. Мембранные белки выполняют сигнальные, структурные, транспортные и адгезивные функции. Однако липидный бислой также необходим для взаимосвязи животной клетки с внеклеточным пространством. В данной работе предложен метод исследования периферического взаимодействия внешних белков с липидной мембраной.

Наиболее ярким примером реакций, происходящих на внешнем мембранном сло....