Методическая статья

Модифицированная техника манжеты для модели трансплантации шейки шейки сердца мыши

DOI:

10.3791/63504

⸱

7 февраля 2022 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Urological Oncology Surgery, Chongqing University Cancer Hospital, 2School of Medicine, Chongqing University, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Basic Medical Science, Army Medical University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В настоящем протоколе модель трансплантации сердца мыши используется для исследования механизма отторжения сердечного аллотрансплантата. В этой модели гетеротопической трансплантации сердца повышается эффективность операции, а приживаемость сердечных трансплантатов обеспечивается за счет шейного сквозного анастомоза имплантации сердца с использованием модифицированной техники Cuff.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Отторжение сердечного аллотрансплантата ограничивает долгосрочную выживаемость пациентов после трансплантации сердца. Модель трансплантации сердца мыши идеально подходит для изучения механизма отторжения сердечного аллотрансплантата в доклинических исследованиях из-за их высокой гомологии с генами человека. Это понимание поможет разработать уникальные подходы к улучшению долгосрочной выживаемости пациентов, получающих сердечные аллотрансплантаты. В мышиной модели имплантация донорского сердца в брюшной полости обычно выполняется со сквозным анастомозом аорты реципиента и нижней полой вены с помощью швов. В этой модели сердце донора имплантируется путем сквозного анастомоза в сонную артерию и яремную вену реципиента с помощью техники модифицированной манжеты. Операция по трансплантации проводится без наложения швов и, таким образом, может увеличить выживаемость реципиента, поскольку нет вмешательства в кровоснабжение и венозный рефлюкс нижней части тела. Эта модель мыши поможет исследовать механизмы, лежащие в основе иммунологического и патологического (острого / хронического) отторжения сердечных аллотрансплантатов.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Трансплантация сердца стала стандартным методом лечения терминальной сердечной недостаточности. Более 5 500 трансплантаций сердца в год выполняются в организациях, зарегистрированных при Международном обществе трансплантации сердца и легких. Среди реципиентов аллогенной трансплантации сердца частота отторжения в течение 1 года по-прежнему составляет >10%, в то время как частота отторжения в течение 3 лет увеличилась до 36%1,2. Тем не менее, эффективные профилактические методы лечения пациентов с отторжением сердечного аллотрансплантата отсутствуют. Поэтому необходимы исследования на животных моделях, которые выясняют физиологические механизмы, лежащие в основе иммунологического и патологического отторжения сердечных аллотрансплантатов. Такие исследования будут способствовать изучению новых мишеней, необходимых для разработки эффективных лекарств, которые помогут предотвратить отторжение сердечного аллотрансплантата и улучшить показатели выживаемости в этих популяциях пациентов.

Некоторые потенциальные иммунологические и патофизиологические механизмы отторжения сердечного аллотрансплантата были предложены недавно в мышиных модельных исследованиях гетеротопической трансплантации сердца 3,4,5. Следовательно, гетеротопическая трансплантация сердца у мышей стала идеальной доклинической моделью для исследования механизмов иммунного отторжения и патологического повреждения, происходящего в сердечных аллотрансплантатах после трансплантации сердца из-за их высокой гомологии с генами человека. Преобладающая концепция заключается в выполнении гетеротопической трансплантации на мышиной модели путем абдоминального сквозного анастомоза в аорте реципиента и нижней полой вене с использованием швов, аналогично нормальной анатомии человека. Однако эта процедура может нарушить кровоснабжение реципиента и венозный рефлюкс нижней части тела6. Поэтому здесь предложена модифицированная гетеротопическая процедура трансплантации сердца на мышиной модели.

Донорское сердце имплантируется сонной артерией и яремной веной реципиента сквозным цервикальным анастомозом с использованием модифицированной техники Cuff. Эта модифицированная процедура облегчила оперативную осуществимость и обеспечила приживаемость сердечного трансплантата без вмешательства в кровоснабжение и венозный рефлюкс нижней части тела.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных, восьмое издание, Национальный исследовательский совет (США) 2011 г. Процедуры, связанные с животными, были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию онкологической больницы Чунцинского университета, Чунцин, Китай. Для аллогенной трансплантации сердца использовали самцов мышей BALB/c и C57BL/6 массой 20-30 г, полученных из коммерческих источников (см. Таблицу материалов). Мыши C57BL/6 использовались в качестве доноров и сингенных реципиентов, в то время как мыши BALB/c служили аллогенными реципиентами. Схема протокола показана на рисунке 1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все расходные материалы, используемые во время операции, включая хирургические инструменты и растворы, стерильны. Хирургическое вмешательство проводится по принципу асептической техники операции.

1. Процедура получения реципиента

  1. Вызвать общую анестезию путем вдыхания 5% изофлурана через индукционную камеру размером 15 x 10 x 10 см, соединенную с колпаком (см. Таблицу материалов).
  2. Зафиксируйте мышь-реципиент на операционном столе с помощью грелки. Поддерживайте анестезию при непрерывном вдыхании 2% изофлурана через маску для лица над носом и ртом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Медленная частота и ритм дыхания, исчезновение роговичного рефлекса и отсутствие педального рефлекса в пальцах ног указывают на эффективность анестезии.
  3. После бритья волос продезинфицируйте операционную область тремя чередующимися раундами повидон-йодного скраба с последующим добавлением спирта. Затем надрежьте кожу на 1,5-2 см параллельно средней линии шейки матки от правильного нижнечелюстного угла до хвоста.
  4. Рассекают ~1 см правой наружной яремной вены с помощью электрокоагулятора и микрощипцов. Перережьте вену на проксимальном конце атравматичным микрососудистым зажимом и перевязать ее на дистальном конце.
  5. Пропустите дистальный конец вены через полиуретановую колючую манжету 22 G (см. Таблицу материалов) со скошенным концом и поверхностными канавками. Зафиксируйте вену ручкой манжеты с помощью микрососудистого зажима.
  6. Убрать 8-0 Перевязывают шов на дистальном конце, переворачивают просвет над манжетой, зацепленной поверхностной зазубриной, наизнанку и фиксируют хирургическим швом 10-0 в бороздках поверхности.
  7. Резецируют правую подъязычную железу, чтобы сформировать ямку для имплантации сердечного трансплантата, и оставляют правую долю подчелюстной железы и правую грудино-ключичную мышцу.
  8. Рассекают правую общую сонную артерию на ~1 см с помощью микрощипцов и зажимают артерию атравматичным микрососудистым зажимом на проксимальном конце. На дистальном конце перевязывают и перерезают артерию.
  9. Пропустите дистальный конец артерии через полиуретановую колючую манжету 26 G (см. Таблицу материалов) со скошенным концом и канавками на поверхности. Зафиксируйте артерию ручкой манжеты с помощью микрососудистого зажима.
  10. Снимите шов лигирования на дистальном конце, выверните просвет наизнанку над манжетой и зафиксируйте поверхностным шипом и бороздками хирургическим швом 10-0.
  11. После подготовки сосудов реципиента капните 100 МЕ/мл физиологического раствора гепарина на сосуды, чтобы предотвратить тромбоз. Накройте шейный разрез стерильной влажной солевой марлей для последующей имплантации.

2. Донорская процедура

  1. Используйте ту же анестезирующую процедуру (шаг 1.1) для мыши-донора.
  2. Сбрейте волосы на животе с помощью электрической бритвы и продезинфицируйте операционную область тремя чередующимися раундами повидон-йодного скраба с последующим добавлением спирта.
  3. Надрежьте живот (2-3 см) ножницами по средней линии от лобкового симфиза до подкшифовидного сустава, а разрезаемый участок расширите ретрактором.
  4. Рассекают 1 см брюшной аорты и нижней полой вены с помощью электрокоагулятора и микрощипцов и проводят гепаринизацию путем введения 1 мл физиологического раствора с добавлением 250 МЕ/мл гепарина через нижнюю полую вену. После этого иссекают брюшную аорту и нижнюю полую вену.
  5. Иссеките грудную клетку по передней подмышечной линии с обеих сторон хирургическими ножницами, чтобы отделить грудную стенку. Обыграйте верхнюю полую вену со счетом 8-0 хирургический шов.
  6. Вставьте иглу для кожи головы в надпеченочную нижнюю полую вену. Затем введите ледяной физиологический раствор с добавлением 100 МЕ / мл гепарина через иглу для кожи головы из надпечной нижней полой вены для перфузии донорского сердца до тех пор, пока цвет крови не исчезнет.
  7. Повторно перфузируют донорское сердце 2-3 мл ледяного раствора гистидина-триптофана-кетоглутарата (HTK) (см. Таблицу материалов) с помощью иглы для кожи головы из дуги аорты для защиты донорского миокарда. Среднее время теплой ишемии составляет 5 минут.
  8. Перевязывают верхнюю и нижнюю полые вены и легочную вену хирургическим швом 5-0. Рассекают и отрезают донорскую аорту и легочную артерию до их разветвления. После этого разделите верхнюю и нижнюю полые вены и легочную вену, чтобы удалить донорское сердце.

3. Имплантация

  1. Имплантируйте донорское сердце в шейный карман мыши-реципиента в перевернутом положении.
  2. Втяните манжету с вывернутой яремной веной реципиента в просвет донорской легочной артерии для выполнения сквозного анастомоза донорской легочной артерии к наружной яремной вене реципиента. Перевязать манжету, используя бороздки на поверхности через хирургический шов 10-0, чтобы зафиксировать анастомоз.
  3. Используйте аналогичную процедуру для сквозного анастомоза донорской аорты к сонной артерии реципиента.
  4. Отпустите атравматичный микрососудистый зажим яремной вены с последующей сонной артерией для повторной перфузии донорского сердца. Среднее время холодовой ишемии составляет 15 минут.
  5. Зафиксируйте сердечный трансплантат и зашите его должным образом, чтобы предотвратить перекручивание трансплантата.
  6. Закрыть шейный разрез непрерывными швами с помощью полиамидного монофиламентного шва 5-0 (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Снимите шов после полного заживления раны.
  7. Держите мышь-реципиента в теплой, сухой и чистой клетке, пока она не оправится от анестезии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Восстановление занимает 5-10 минут.
  8. Вводите бупренорфин (0,05 мг/кг) подкожно мыше-реципиенту каждые 6 ч в течение 48 ч для послеоперационной анальгезии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Дозировка анальгезии была оптимизирована для этого исследования. Тем не менее, режим обезболивания может быть расширен / изменен при наличии каких-либо признаков боли в соответствии с рекомендациями по использованию животных в учреждении.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой мышиной гетеротопической модели трансплантации сердца выживаемость мышей-реципиентов составила примерно 95,2% (20 из 21 мыши выжили). Основной причиной смерти стало послеоперационное кровотечение. Учащенное сердцебиение с регулярным ритмом служит показателем приживаемости имплантированного донорского сердца.

Мыши C57BL/6 и BALB/c были типами MHC (H-2b) и MHC (H-2d) в этой модели, соответственно 7,8. Эти два штамма различаются по...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Модель трансплантации сердца мыши способствует исследованию механизмов отторжения после трансплантации сердца, способствуя разработке уникальных подходов к улучшению долгосрочной выживаемости реципиентов сердечного аллотрансплантата. Однако трансплантация сердца у мышей является сложной и ответственной задачей, требующей высокого уровня микрохирургических методов, особенно при сосудистом анастомозе11,12,13. Модель трансплантации...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам раскрывать нечего.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (81870304) Цзюнь Ли.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
  5-0 Полиамидный монофиламентный шовный материалB.Braun Medical Inc.C3090954
  8-0 Полиамидный монофиламентный шовный материалB.Braun Medical Inc.
10-0 Полиамидный монофиламентный шовный материалB.Braun Medical Inc.
Манжета из полиуретана 22 гB.Braun Medical Inc.4251628-02
26 G полиуретановая манжетаSuzhou Linhua Medical Instrument Co., LTDREF383713
Индукционная камера для анестезииRWD Life Science Co., LTDV100
Атравматический микрососудистый зажимBeyotimeFS500
BALB/c и C57BL/6 мышей (20– 30 г)Центр экспериментальных животных (Армейский медицинский университет, Чунцин, Китай)
БупренорфинUS Biological Life Sciences352004
ЭлектрокоагуляторGuangzhou Runman Medical Instrument Co., LTDZJ1099
GauzeHenan piaoan group Co., LTD10210402
ГрелкаGuangzhou Dewei Biological Technology Co., LTDDK0032
HeparinNorth China Pharmaceutical Co., LTD2101131-2
раствор HTKShenzhen Changyi Pharmaceutical Co., LTDYZB/Min8263-2013
Шприц для инъекций (10 мл)Shandong weigao group medical polymer Co., LTD20211001
IsofluraneRWD Life Science Co., LTD21070201
Физиологический растворSouthwest pharmaceutical Co., LTDH50021610
Игла для кожи головыHongyu Medical Group20183150210
ShaverBeyotimeFS600
Аппарат для анестезии мелких животныхRWD Life Science Co., LTDR500
Хирургический операционный микроскопTiannuoxiang Scientific Instrument Co., Ltd, Пекин, КитайSZX-6745
ТампонYubei Medical Materials Co., Ltd21080274
C2090880G0090781

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Khush, K. K., et al. The International thoracic organ transplant registry of the international society for heart and lung transplantation: Thirty-sixth adult heart transplantation report - 2019; focus theme: Donor and recipient size match. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 38 (10), 1056-1066 (2019).
  2. Stehlik, J., et al. The registry of the international society for heart and lung transplantation: 29th official adult heart transplant report--2012. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 31 (10), 1052-1064 (2012).
  3. Huang, H., et al. Combined intrathymic and intravenous injection of mesenchymal stem cells can prolong the survival of rat cardiac allograft associated with decrease in miR-155 expression. Journal of Surgical Research. 185 (2), 896-903 (2013).
  4. Eggenhofer, E., et al. Features of synergism between mesenchymal stem cells and immunosuppressive drugs in a murine heart transplantation model. Transplant Immunology. 25 (2-3), 141-147 (2011).
  5. Sula Karreci, E., et al. Brief treatment with a highly selective immunoproteasome inhibitor promotes long-term cardiac allograft acceptance in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (52), 8425-8432 (2016).
  6. Liu, F., Kang, S. M. Heterotopic heart transplantation in mice. Journal of Visualized Experiments. 6, 238(2007).
  7. Lin, C. M., Gill, R. G., Mehrad, B. The natural killer cell activating receptor, NKG2D, is critical to antibody-dependent chronic rejection in heart transplantation. American Journal of Transplantation. 21 (11), 3550-3560 (2021).
  8. Ito, H., Hamano, K., Fukumoto, T., Wood, K. J., Esato, K. Bidirectional blockade of CD4 and major histocompatibility complex class II molecules: An effective immunosuppressive treatment in the mouse heart transplantation model. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 17 (5), 460-469 (1998).
  9. Zhou, Y. X., et al. Acute rejection correlates with expression of major histocompatibility complex class I antigens on peripheral blood CD3(+)CD8(+) T-lymphocytes following skin transplantation in mice. Journal of International Medical Research. 39 (2), 480-487 (2011).
  10. Oberhuber, R., et al. Murine cervical heart transplantation model using a modified cuff technique. Journal of Visualized Experiments. (92), e50753(2014).
  11. Cui, D., Tan, C., Liu, Z. An alternative technique of arterial anastomosis in mouse heart transplantation. Clinical Transplantation. 32 (6), 13264(2018).
  12. Plenter, R. J., Zamora, M. R., Grazia, T. J. Four decades of vascularized heterotopic cardiac transplantation in the mouse. Journal of Investigative Surgery. 26 (4), 223-228 (2013).
  13. Fang, J., et al. A simplified two-stitch sleeve technique for arterial anastomosis of cervical heterotopic cardiac transplantation in mice. American Journal of Translational Research. 5 (5), 521-529 (2013).
  14. Matsuura, A., Abe, T., Yasuura, K. Simplified mouse cervical heart transplantation using a cuff technique. Transplantation. 51 (4), 896-898 (1991).
  15. Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Primarily vascularized allografts of hearts in mice. The role of H-2D, H-2K, and non-H-2 antigens in rejection. Transplantation. 16 (4), 343-350 (1973).
  16. Fensterer, T. F., Miller, C. J., Perez-Abadia, G., Maldonado, C. Novel cuff design to facilitate anastomosis of small vessels during cervical heterotopic heart transplantation in rats. Comparative Medicine. 64 (4), 293-299 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи