Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Удаление глаз у живых личинок рыбок данио для изучения иннерваторно-зависимого роста и развития зрительной системы

4.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/63509

⸱

11 февраля 2022 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Reed College, 2Committee on Development, Regeneration, and Stem Cell Biology, University of Chicago, 3Department of Cell and Developmental Biology, University College London

В этой статье

Краткое содержание

В статье объясняется, как хирургически удалить глаза у живых личинок рыбок данио в качестве первого шага к исследованию того, как вход сетчатки влияет на рост и развитие зрительного тектума. Кроме того, в статье представлена информация об обезболивании личинок, фиксации и рассечении мозга с последующей иммуногистохимией и конфокальной визуализацией.

Аннотация

Рыбки данио демонстрируют замечательный пожизненный рост и регенеративные способности. Например, специализированные ниши стволовых клеток, созданные во время эмбриогенеза, поддерживают непрерывный рост всей зрительной системы, как в глазу, так и в мозге. Скоординированный рост между сетчаткой и оптическим тектумом обеспечивает точное ретинотопическое картирование по мере добавления новых нейронов в глаза и мозг. Чтобы решить, предоставляют ли аксоны сетчатки важную информацию для регулирования поведения тектальных стволовых и клеток-предшественников, таких как выживание, пролиферация и / или дифференцировка, необходимо иметь возможность сравнивать иннервированные и денервированные тектальные доли внутри одного и того же животного и у разных животных.

Хирургическое удаление одного глаза у живой личинки рыбки данио с последующим наблюдением за оптическим тектумом достигает этой цели. В сопроводительном видео показано, как обезболить личинок, электролитически заточить вольфрамовые иглы, и использовать их для удаления одного глаза. Далее показано, как препарировать мозг у неподвижных личинок рыбок данио. Наконец, видео содержит обзор протокола иммуногистохимии и демонстрацию того, как монтировать окрашенные эмбрионы в агарозу с низкой температурой плавления для микроскопии.

Введение

Целью этого метода является исследование того, как вход сетчатки влияет на рост и развитие оптического тектума, центра визуальной обработки в мозге рыбок данио. Удалив один глаз, а затем сравнив две стороны оптического тектума, можно наблюдать и нормализовать тектальные изменения в одном образце, что позволяет сравнивать несколько образцов. Современные молекулярные подходы в сочетании с этой техникой дадут представление о механизмах, лежащих в основе роста и развития зрительной системы, а также аксональной дегенерации и регенерации.

Сенсорные системы - зрительная, слуховая и соматосенсорная - собирают информацию от внешних органов и передают эту информацию в центральную нервную систему, генерируя «карты» внешнего мира по среднему мозгу 1,2. Зрение является доминирующей сенсорной модальностью почти для всех позвоночных, включая многих рыб. Сетчатка, нервная ткань в глазу, собирает информацию с помощью нейронной цепи, состоящей в основном из фоторецепторов, биполярных клеток и ганглиозных клеток сетчатки (RGC), проекционных нейронов сетчатки. RGC имеют длинные аксоны, которые находят свой путь через внутреннюю поверхность сетчатки к головке зрительного нерва, где они фасцикулируют и путешествуют вместе через мозг, в конечном итоге заканчиваясь в центре визуальной обработки в спинном среднем мозге. Эта структура называется оптическим тектумом у рыб и других позвоночных, не являющихся млекопитающими, и гомологична верхнему колликулусу у млекопитающих3.

Оптический тектум представляет собой двусторонне симметричную многослойную структуру в спинном среднем мозге. У рыбок данио и большинства других рыб каждая доля зрительного тектума получает визуальный ввод исключительно от контралатерального глаза, так что левый зрительный нерв заканчивается в правой тектальной доле, а правый зрительный нерв заканчивается в левой тектальной доле4 (рисунок 1). Как и его аналог млекопитающих, превосходный колликулус, оптический тектум интегрирует визуальную информацию с другими сенсорными входами, включая прослушивание и соматозондирование, контролируя сдвиги в зрительном внимании и движениях глаз, таких как саккады 1,5,6. Однако, в отличие от верхнего колликулуса млекопитающих, оптический тектум непрерывно генерирует новые нейроны и глию из специализированной ниши стволовых клеток вблизи медиального и каудального краев тектальных долей, называемой зоной текальной пролиферации7. Поддержание пролиферативных предшественников в тектуме зрительного нерва и других областях центральной нервной системы частично способствует замечательной регенеративной способности, задокументированной у рыбок данио8.

Предыдущая работа, изучающая мозг слепых или одноглазых рыб, показала, что размер зрительного тектума прямо пропорционален количеству иннервации сетчатки, которую он получает 9,10,11. У взрослых пещерных рыб, глаза которых вырождаются в раннем эмбриогенезе, оптический тектум заметно меньше, чем у близкородственных, видимых поверхностных рыб9. Дегенерация глаза пещерной рыбы может быть заблокирована путем замены эндогенной линзы линзой от поверхностной рыбы во время эмбриогенеза. Когда эти одноглазые пещерные рыбы выращиваются до зрелого возраста, иннервированная тектальная доля содержит примерно на 10% больше клеток, чем неиннервированная тектальная доля9. Аналогичным образом, у личинок киллифиш, которые инкубировались с помощью химической обработки для создания глаз разных размеров в пределах одного и того же человека, сторона тектума с большей иннервацией была больше и содержала больше нейронов10. Данные экспериментов по раздавливанию зрительного нерва у взрослых золотых рыбок указывают на то, что иннервация способствует пролиферации, при этом пролиферация тектальных клеток уменьшается, когда иннервация была нарушена11.

Подтверждая и расширяя эти классические исследования, несколько недавних докладов предоставляют данные, свидетельствующие о том, что пролиферация в ответ на иннервацию модулируется, по крайней мере частично, путем BDNF-TrkB12,13. Остается много открытых вопросов о росте и развитии оптического тектума, в том числе о том, как развивающаяся сенсорная система справляется с травмой и дегенерацией аксонов, какие клеточные и молекулярные сигналы позволяют входу сетчатки регулировать рост зрительного тектума, когда эти механизмы становятся активными, и позволяют ли иннервационная пролиферация и дифференцировка сетчатке и ее целевой ткани координировать темпы роста и обеспечивать точное ретинотопическое картирование. Кроме того, существуют гораздо более широкие вопросы о развитии, зависящем от активности, которые можно решить, опросив зрительную систему рыбок данио с помощью хирургических подходов, таких как описанный ниже.

Чтобы исследовать клеточные и молекулярные механизмы, с помощью которых нейронная активность, в частности от визуального ввода, изменяет выживание и пролиферацию клеток, описанный подход непосредственно сравнивает иннервированные и денервированные тектальные доли (рисунок 1) в отдельных личинках рыбок данио. Этот метод позволяет документировать дегенерацию аксона RGC в тектуме зрительного нерва и подтвердить, что количество митотических клеток коррелирует с иннервацией.

figure-introduction-1
Рисунок 1: Эскизы личинок рыбок данио до и после одностороннего удаления глаз. (А) Рисование 5 личинок dpf при просмотре под рассекающим микроскопом. Каждая личинка встроена в агарозу с низкой температурой плавления и ориентирована сбоку, прежде чем вольфрамовая игла с острым крючковатым кончиком используется для вычерпывания глаза лицом вверх (левый глаз в этом примере). (B) Рисунок дорсального вида личинки 9 dpf в результате операции, изображенной в A. Только три сильно схематизированных аксона RGC от правого глаза дефасцикулируют и соединяются с нейронами в левой тектальной доле. Сокращения: dpf = дни после оплодотворения; dps = дни после операции; RGC = ганглиозные клетки сетчатки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Методы в этой статье были проведены в соответствии с руководящими принципами и одобрением институциональных комитетов по уходу за животными и их использованию Рид-колледжа и Университетского колледжа Лондона. Смотрите Таблицу материалов для получения подробной информации о штаммах рыбок данио, используемых в этом исследовании.

1. Подготовка материалов и инструментов

  1. Принимайте решения.
    1. Получают эмбриональную среду (E314) путем разбавления 60-кратного запаса (300 мМ NaCl, 10,2 мМ KCl, 20 мМ CaCl 2-дигидрата и 20 мМ MgCl2-гексагидрата в деионизированной воде, автоклавной и хранящейся при комнатной температуре). Добавьте 160 мл 60x E3 к 10 л деионизированной воды. Хранить при комнатной температуре.
    2. Получите 1% агарозу с низкой температурой плавления (LMP) в E3. Растворить 1 г агарозы LMP в 100 мл E3 кипятить в микроволновой печи в течение 1-2 мин на высокой мощности. Аликвот расплавленную агарозу в 1,7 мл микрофьюжных пробирок и хранит при 4 °C. Кипятить на водяной бане и держать в тепловом блоке при температуре 40 °C, когда он будет готов к использованию для встраивания.
    3. Изготавливают изотонический раствор модифицированных звонарей Марка (MMR15) путем разбавления 10-кратного запаса (1 M NaCl, 20 мМ KCl, 10 мМ MgSO4, 20 мМ CaCl 2-дигидрата, 50 мМ HEPES, рН, скорректированного до 7,5 с 10 М NaOH, затем автоклавированного и хранящегося при комнатной температуре). Добавьте 10 мл 10x MMR к 90 мл деионизированной воды.
  2. Заливайте тарелки Sylgard согласно инструкции производителя, позволяя им устанавливаться и сушиться в течение нескольких дней16.
  3. Электролитически заточите вольфрамовые иглы (протокол, модифицированный из 17).
    1. Во-первых, приготовьте 10% (мас./об.) раствор KOH, добавив 200 мл деионизированной воды в стеклянную банку с широким горлом с завинчивающейся крышкой. Медленно размешать в 20 г гранул KOH.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот едкий раствор является высокоэкзотермическим. Наденьте перчатки и средства защиты глаз и перемешайте раствор в капюшоне.
    2. Отрежьте вольфрамовую проволоку длиной 2-3 см и вставьте ее в держатель иглы.
    3. Подключите катодные и анодные провода к источнику питания. Прикрепите зажим для аллигатора на конце катодной проволоки к частично выпрямленной скрепке и вставьте скрепку в раствор KOH, прикрепив ее к боковой части банки.
    4. Далее прикрепите зажим аллигатора анодной проволоки к шейке игольчатого держателя. Включите питание (до ~20 В) и окуните вольфрамовый провод в раствор KOH, вытащив провод из раствора под углом, чтобы электролитически заточить провод в тонкий наконечник.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пузырьки будут исходить из скрепки по мере развития реакции.
    5. Проверьте кончик иглы под рассекающим микроскопом, чтобы убедиться, что он достаточно острый.
    6. Промойте иглу деионизированной водой, чтобы удалить все остатки KOH. Сделайте несколько игл заранее и держите их до личиночных операций и рассечений.
  4. Сделайте камерные слайды для визуализации образцов рыбок данио с помощью вертикального конфокального микроскопа.
    1. Получите стекла микроскопа и двухкомпонентную эпоксидную смолу (см. Таблицу материалов). Смешайте эпоксидную смолу в соответствии с инструкциями на упаковке и нанесите толстые кольца или прямоугольники на стеклянные слайды. Дайте горкам затвердеть и высохнуть в вытяжке в течение не менее 24 часов перед использованием.

2. Сбор и выращивание эмбрионов

  1. Парите взрослых самцов и самок рыб желаемых генотипов в гнездовых ящиках в конце дня / ранним вечером. На следующее утро, после того, как они нерестятся, соберите вновь оплодотворенные яйца с помощью сетчатого ситечка и перенесите их в Е3 в 100 мм чашках Петри.
  2. Инкубируйте эмбрионы при ~27,5 °C с 14-часовым световым /10-часовым темным циклом до дня операции. Меняйте E3 ежедневно или по мере необходимости.
  3. Кормите личинок с помощью капельницы, полной собранных коловраток один раз в день, начиная либо через 5 дней после оплодотворения (dpf), либо через день после операции. После того, как у личинок будет несколько часов, чтобы поесть, измените E3, чтобы удалить оставшихся коловраток и продукты жизнедеятельности.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не кормите личинок в день операции.

3. Подготовьте личинок к операции

  1. В день операции используйте стеклянную пипетку Пастера с широким отверстием, чтобы перенести 10-15 личинок в 35-миллиметровую чашку Петри, наполненную свежей E3.
  2. Обезболивают личинки путем добавления 3-5 капель 0,4% мас./об. раствора трикаина (0,4 г трикаина, растворенного в 210 мМ Трис, рН 9; конечный раствор, скорректированный до рН 7,4 при необходимости18) в чашку для конечной концентрации ~0,0015% мас./об.трикаина. Ищите отсутствие реакции на прикосновение, чтобы определить, адекватно личинки обезболены. Если они все еще реагируют на прикосновение через ~3 мин, добавьте еще 2-3 капли 0,4% мас./об.раствор трикаина и повторно проведите повторную оценку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этой стадии развития можно контролировать кровоток и частоту сердечных сокращений в дополнение к моторике под рассекающим микроскопом.
  3. Обездвиживают обезболенных личинок рыбок данио, встраивая их в 1% агарозу LMP, растворенную в E3.
    1. Во-первых, поместите крышку 35-миллиметровой чашки Петри лицевой стороной вверх под рассекающим микроскопом. Затем возьмите одну личинку в узкоствольную стеклянную пипетку Пастера с небольшим количеством E3.
    2. Затем аспирировать ~200 мкл расплавленной, теплой (~40 °C) 1% агарозы LMP в пипетку с личинкой. Наконец, брызните личинку и агарозу на перевернутую крышку чашки Петри.
    3. Используйте тусклую вольфрамовую иглу, чтобы быстро, но осторожно маневрировать личинкой так, чтобы она была боковой, с одним глазом, обращенным вверх. Дождитесь схватывания агарозы (~5 мин).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если агароза затвердевает, в то время как личинка не является боковой, освободите ее от агарозы (как описано в шаге 5) и верните ее в чашку с E3 и трицином.

4. Удаление глаз

  1. Как только агароза застынет, и личинка будет расположена сбоку, используйте кончик очень тонкой, электролитически заточенной вольфрамовой иглы, чтобы проткнуть кожу вокруг глаза, следуя краю глазной орбиты.
  2. Далее сдвиньте край иглы (не кончик) под глаз с височно-вентральной стороны глаза. Используйте контролируемое давление, чтобы освободить глаз от глазницы.
  3. Используйте очень тонкие хирургические щипцы, чтобы удалить глаз, защемляя зрительный нерв и подталкивая глаз от медиального к боковому. В качестве альтернативы, просто продолжайте давить на глаз дорсально и спереди боковой стороной иглы, в конечном итоге разрезая зрительный нерв и освобождая глаз.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если ткани, отличные от глаза, случайно заколоты во время операции, быстро и гуманно убейте личинку путем быстрого обезглавливания.

5. Послеоперационный уход до экспериментальной конечной точки

  1. После успешного удаления глаз накройте агарозу раствором MMR.
  2. Освободите каждую личинку от агарозы, осторожно расчесывая вольфрамовую иглу вокруг их головы, а затем вокруг их тела, стабилизируя крышку чашки Петри щипцами.
  3. Переложите одноглазых личинок в 35-миллиметровую чашку Петри, которая содержит MMR, дополненную разбавлением 1:100 коктейля пенициллин/стрептомицин. Инкубируйте эмбрионы при ~27,5 °C с темным циклом 14 ч света/10 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот изотонический раствор MMR, дополненный антибиотиками, первоначально способствует заживлению и выживанию личинок. Каждое блюдо может вместить до 15 выздоравливающих личинок.
  4. На следующий день верните личинок в Е3. Начиная с второй половины дня после операции, кормите личинок (~ 6 dpf и старше) с помощью капельницы, полной собранных коловраток один раз в день. После того, как у личинок будет несколько часов, чтобы поесть, измените E3, чтобы удалить оставшихся коловраток и отходы.

6. Фиксация личинок

  1. Как только личинки достигнут желаемой стадии развития для анализа, обезболивайте их смертельной дозой трикаина (~ 0,4% конечной концентрации), пока их сердца не остановятся.
  2. Пипетка до 30 личинок на 1,5 мл микрофьюжной трубки. Удалите избыток E3, а затем добавьте 0,5-1 мл фиксирующего раствора (4% параформальдегида (PFA) и 4% сахарозы в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS)) для фиксации ткани. Насиживают личинок в течение ночи при 4 °C.
  3. Промыть личинок PBS на следующий день, удалив фиксатор и промывая личинок 3-4 раза PBS. Хранить личинки при температуре 4 °C до 7 дней до рассечения.

7. Рассечение личинок для выявления мозга (адаптировано из 15)

  1. Подвешивайте неподвижные личинки в каплях PBS на пластине Сильварда под рассекающим микроскопом. Закрепите их сбоку, поместив два вольфрамовых штифта (обычно старые вольфрамовые иглы, которые составляют менее 2 см) через нотохорд, причем один штифт находится позади пигментированной области, охватывающей область аорты-гонад-мезонефрос (AGM), и другой в соответствии с концом расширения желтка.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Расположите вольфрамовые штифты в как можно меньшем количестве попыток, потому что ткань будет становиться более рыхлой с каждым проколом.
  2. Используйте очень острую вольфрамовую иглу и острые щипцы, чтобы обнажить мозг, удалив в этом порядке глаз (ы), ухо, челюсть, пищеварительный тракт и спинную черепную кожу.
    1. Во-первых, удалите глаз, используя технику, аналогичную хирургическому удалению глаза на шаге 4. Затем открепите личинку и переверните ее в противоположную сторону, чтобы другой глаз был доступен и повторился. В качестве альтернативы, проткните иглу через челюсть на другую сторону и удалите глаз, не отстегивая.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Глаза могут быть собраны в этот момент, если требуется анализ этой ткани (аналогично 19).
    2. Затем используйте вольфрамовую иглу, чтобы поцарапать от височной до вентральной стороны уха. В том же действии / движении поднесите иглу сзади к челюсти и осторожно потяните кпереди, пока ухо и челюсть не будут удалены.
    3. Используйте щипцы, чтобы вытащить вентральные органы и любой оставшийся желток.
    4. Наконец, сделайте неглубокий разрез в дорсальной черепной коже вблизи соединения между задним мозгом и спинным мозгом. Подтяните кожу щипцами и потяните ее спереди и вокруг теленцефалона. Если это окажется слишком трудным, начните с начального разреза в заднем мозге и потяните кожу сначала латерально, а затем вентрально и спереди, стараясь не поцарапать боковые края тектума.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку средний мозг является объектом исследования, задний мозг может быть разрезан; однако глубокий разрез может привести к обезглавливанию.
    5. Удалите оставшуюся ткань щипцами. Открепите личинку и перенесите на PBS в микрофрагменной трубке объемом 1,5 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оставьте хвост прикрепленным к мозгу для лучшей видимости при выполнении протоколов wholemount.

8. Обезвоживание и хранение мозга

  1. Удалите PBS из мозга и добавьте 1 мл PBS, содержащего 0,1% TritonX-100 (PBST). Инкубировать в течение 5-10 мин при комнатной температуре.
  2. Удалите PBST и замените его раствором метанола: PBST 50:50. Инкубировать в течение 5-10 мин при комнатной температуре.
  3. Промывайте мозги 100% метанолом (MeOH) дважды по 5 мин при комнатной температуре.
  4. Храните мозг в 100% MeOH при -20 °C в течение не менее 16 ч перед выполнением иммуногистохимии или других процедур полного объема.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мозг может храниться в MeOH до 2 лет при -20 °C.

9. Иммуногистохимия

ПРИМЕЧАНИЕ: Установленные протоколы для многих полезных методов wholemount у рыбок данио можно найти на ZFIN20. В этой рукописи приведены примеры сравнения одноглазых и двухглазых личинок, которые были ослаблены антителами, которые распознают либо красный флуоресцентный белок (RFP), который экспрессируется в аксонах зрительного нерва в линии Tg[atoh7:RFP] (рисунок 2), либо фосфорилированный гистон H3 (PH3), который выделяет митотические клетки (рисунок 3). Стандартный протокол иммуногистохимии для цельных эмбрионов и личинок кратко изложен ниже.

  1. Сначала регидратируйте личиночный мозг градуированной серией промывок MeOH:PBST при комнатной температуре путем инкубации образцов в 50:50 MeOH:PBST в течение 5 мин, затем в 30:70 MeOH:PBST в течение 5 мин и заканчивая 3 промывками PBST.
  2. Чтобы проникнуть в мозг, инкубируют его в ПБСТ, дополненном протеиназой К (ФК) в конечной концентрации 20 мкг/мл ПК в течение 30 мин при 37 °C. Храните аликвоты 10 мг/мл ПК при -20 °C и размораживайте их перед использованием.
  3. Удалите раствор ФК и смойте оставшийся фермент, промыв мозг ПБСТ 3 раза в течение 15 минут.
  4. Рефиксируйте пермеабилизированный мозг, инкубируя их в 4% PFA в течение 20 мин при 25 °C (или комнатной температуре). Затем удалите PFA и смойте все оставшиеся фиксирующие средства, промывая мозг 3 раза в течение 15 минут PBST.
  5. Замените окончательную промывку PBST свежеприготовленным буфером иммуноблокировки (IB) (10% нормальной козьей сыворотки и 1% DMSO в PBST) и инкубируйте при комнатной температуре в течение не менее 1 ч.
  6. Разбавляют первичные антитела в буфер IB в соответствующей концентрации (например, 1:500 для RFP и 1:300 для антител PH3).
  7. Удалите буфер IB из мозга и замените его первичным разведением антител. Инкубировать в течение ночи при 4 °C на орбитальном шейкере с мягким раскачиванием. Убедитесь, что трубы надежно лежат по бокам.
  8. На следующее утро удалите раствор первичного антитела микропипеткой, промойте пару раз в ПБСТ, а затем промывайте мозги в ПБСТ при комнатной температуре в течение 4 х 30 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Первичные разведения антител могут быть повторно использованы один раз в течение ~ 7 дней при хранении при 4 °C.
  9. Промывайте мозг в буфере IB, разбавляя вторичные антитела в буфер IB в соответствующей концентрации (например, 1:500 для Alexa-fluor 568 против кролика).
  10. Удалите буфер IB и замените его вторичным разведением антител. Насиживайте в течение ночи при 4 °C на орбитальном шейкере с мягким раскачиванием трубок, опирающихся на их бока.
  11. На следующее утро удаляют раствор вторичных антител, смывают ПБСТ, а затем промывают мозги в ПБСТ при комнатной температуре в течение 4 х 30 мин.
  12. Противодействовать 4',6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) или ToPro3 (1:5,000 в ПБСТ при 4 °C в сутки).
  13. На следующее утро перенесите личиночный мозг в PBS и перейдите к этапам монтажа и визуализации, перечисленным ниже.

10. Монтаж и визуализация

  1. Закрепите камерный затвор в крышке 100-миллиметровой чашки Петри вакуумной смазкой.
  2. Перенесите иммуноокрашенные и обработанные личинки на пластину колодца или углубление, чтобы просмотреть их с помощью рассекающего микроскопа.
  3. Установите личинок на камерный затвор в колонны из 1% агарозы LMP.
    1. Используя стеклянную пипетку Пастера, положите одну личинку на камерную горку, отложив как можно меньше PBS. Той же пипеткой накройте личинку расплавленной 1% агарозой LMP (~40 °C).
    2. Тупой вольфрамовой иглой или щипцами втяните агарозу в столб, а затем расположите личинку как можно более симметрично, с видимой дорсальной поверхностью.
    3. Повторите эту процедуру для оставшихся личинок.
    4. После того, как агароза застыла, накройте ее несколькими каплями PBS, а затем поместите на сцену конфокального микроскопа.
  4. Выровняйте объектив с образцом, сфокусируйте микроскоп с помощью проходящего света и осветите образец соответствующими лазерами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом примере для возбуждения DAPI и RFP соответственно использовались длины волн 405 нм и 568 нм.
  5. Отрегулируйте коэффициент усиления, смещение и мощность лазера, переместив ползунки на соответствующий уровень относительно сигнала и используемого детектора. Проверьте гистограммы для каждого канала и нажмите кнопку индикатора состояния насыщенности над изображением, чтобы измерить уровень экспозиции, убедившись, что ни один из пикселей не насыщен и что отношение сигнал/шум высокое. Пример оптимальных параметров конфокальной визуализации для клеточного и субклеточного разрешения у рыбок данио см. 21.
  6. Установите верхний и нижний пределы стека z-плоскостей с помощью колеса прокрутки мыши, чтобы найти верхнюю и нижнюю части образца. Щелкните верхний и нижний пределы для получения изображений, а затем запустите захват z-стека, нажав кнопку Выполнить сейчас .
    ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от того, насколько симметрично установлен мозг, общая z-глубина для мозга личинок рыбок данио 9 dpf составит ~ 150-200 мкм.
  7. Обрабатывайте и раскрашивайте изображения с учетом доступности дальтонизма (например, используйте синий и оранжевый или пурпурный и зеленый цвета для двухцветных изображений). Установите таблицы подстановки в программном обеспечении, используемом для захвата изображений, или программном обеспечении для обработки изображений, таком как Photoshop от Adobe.
  8. В Photoshop цветные необработанные микрофотографии сохраняются в формате TIFF с 8-битными тегами путем (i) преобразования режима изображения в RGB и (ii) доступа к параметру «Кривые» в | Настраивает меню, а затем (iii) сдвигает соответствующие цветные световые выходы до 0 или 255 уровней для достижения желаемого цвета. Например, чтобы получить зеленый сигнал, выберите Красный канал и сдвиньте его выход до 0; затем выберите синий канал и сдвиньте его выход до 0 . Аналогично, чтобы получить пурпурный сигнал, выберите зеленый канал и сдвиньте его выход до 0; оставьте красный и синий каналы такими, какие они есть.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Аналогичные шаги могут быть выполнены в бесплатной программе Gnu Image Manipulation Program (GIMP).
  9. Вручную количественно оцените количество ячеек, отображающих определенный маркер, с помощью плагина счетчика ячеек в ImageJ22, доступного в разделе Анализ в меню Плагины. Примеры того, как использовать ImageJ для подсчета ячеек, можно найти во многих учебниках, включая 23.
  10. Создание графических представлений данных в статистическом программном обеспечении, таком как RStudio (см. дополнительные данные для . Rmd файл).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Чтобы подтвердить, было ли удаление глаз полным, и оценить, как изменяется оптический тектум, были проведены операции в штамме Tg[atoh7:RFP], который маркирует все RGC мембранно-целевым RFP и, таким образом, все аксоны, которые проецируются из сетчатки и образуют зрительный нерв24. Хотя использование этого штамма не является абсолютно необходимым, оно позволяет легко наблюдать и визуализировать термин зрительного нерва в оптическом тектуме нейропила. Другие подходы к маркировке зрительног...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Методы, описанные в этой статье, иллюстрируют один из многих подходов к изучению развития зрительной системы позвоночных у рыбок данио. Другие исследователи опубликовали методы рассечения эмбриональной сетчатки и проведения анализа экспрессии генов19 или визуализации активности нейронов в зрительном тектуме30. В этой статье представлен подход к изучению того, как дифференциальный ввод сетчатки может влиять на поведение клеток в оптической тектуме.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Благодарности

Финансирование этой работы было поддержано в основном стартовыми фондами от Reed College до KLC, фондами Исследовательской стипендии Хелен Стаффорд для OLH и стипендией Reed College Science Research Fellowship для YK. Этот проект начался в лаборатории Стива Уилсона как сотрудничество с HR, который был поддержан Wellcome Trust Studentship (2009-2014). Мы благодарим Мате Варгу, Стива Уилсона и других членов лаборатории Уилсона за первоначальные обсуждения этого проекта, и мы особенно благодарим Флоренсию Каводеасси и Кейт Эдвардс, которые первыми научили KLC, как вводить эмбрионы в агарозу и выполнять рассечение мозга рыбок данио. Мы также благодарим Грету Гловер и Джея Юинга за помощь в сборке нашего устройства для заточки вольфрамовой иглы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Оборудование и расходные материалы:
Breed боксыAquaneeringZHCT100
высоковакуумной смазкой Dow CorningSigma или эквивалентным поставщикомZ273554
колбами Эрленмейера (125 мл)Для изготовления модифицированных колб Marc's Ringer (MMR) с антибиотиками для послеоперационной инкубации.
Тонкие щипцы - Dumont #5Fine Science Tools (FST)11252-20
Стеклянные пипетки ПастераDWK Lifescience63A53 & 63A53WTДля пипетирования эмбрионов и личинок.
Стеклянные предметные стекла для микроскопииVWR или аналогичного поставщика48311-703Стандартные стеклянные предметные стекла для микроскопа можно заказать у многих различных поставщиков лабораторий.
Стеклянная посуда, включая градуированные бутылки и градуированные цилиндры,для приготовления и хранения растворов.
2-компонентный эпоксидный смолаACE Hardware или другой эквивалентный поставщик клея Gorilla или эквивалентныйшприц 0,85 унцииhttps://www.acehardware.com/departments/paint-and-supplies/tape-glues-and-adhesives/glues-and-epoxy/1590793
микроцентрифужной трубке (1,7 мл)VWR или эквивалентный поставщик22234-046
Никелированный держатель штифта (длина 17 см)Fine Science Tools (FST)26018-17Для удержания вольфрамовой проволоки во время заточки и выполнения операций/вскрытий.
Нейлоновое сетчатое ситечко для чая или эквивалентAli Express или эквивалентдля сбора икры данио рерио после нереста; https://www.aliexpress.com/item/1005002219569756.html
Скрепкадля устройства для заточки вольфрамовых игл.
Чашки Петри 100 ммFischer Scientific или эквивалент поставщика50-190-0267
Чашки Петри 35 ммFischer Scientific или эквивалентный поставщик08-757-100A
ДозаторSP Bel-Art или эквивалентF37898-0000
Гидроксид калия (KOH)Sigma909122Для устройства для заточки вольфрамовых игл. Приготовьте 10% w/v раствор KOH в вытяжке, добавив гранулы в деионизированную воду.
Источник питания (переменное напряжение)Для устройства для заточки вольфрамовых игл. Подойдет любой источник питания с переменным напряжением (даже тот, который используется для гелевого электрофореза).
Sylgard 184 Набор эластомеровDow Corning3097358
Вольфрамовая проволока (диаметр 0,125 мм)World Precision Instruments (WPI)TGW0515Заточка для удаления глаз и препарирования личинок.
Термоблок с регулируемой температуройЛабораторный склад или эквивалентный поставщикBSH1001 или BSH1002Установлено на 40-42 ° C опережает эксперименты.
Стеклянная банка с широким горлышком и крышкой (например, чистая банка из-под варенья или сальсы)Для устройства для заточки вольфрамовых игл.
Провода с зажимом из кожи аллигатора Дляустройства для заточки вольфрамовых игл
<сильно>микроскопы:
Препарирующий микроскопПодойдет любой тип, но предпочтительнее иметь регулируемый проходящий свет на зеркальном основании.
Рекомендуется лазерный сканирующий конфокальный микроскопHigh NA, 20-25-кратный объектив с погружением в воду.
Здесь используется программное обеспечение для управления микроскопом и захвата изображений (NIS-Elements от Nikon), но подойдет любой конфокальный микроскоп.
<сильно>реагенты для операций и вскрытий:
дигидрат хлорида кальцияSigmaC7902для модифицированных рингеров Марка (MMR) и эмбриональной среды (E3).
HEPESSigmaH7006для модифицированных звонков Марка (MMR).
Низкая температура плавления агарозыInvitrogen16520-050Сделайте 1% в среде эмбриона (E3) или Marc's Modified Ringers (MMR).
Магния хлорид гексагидратSigma1374248Для эмбриональной среды (Е3).
Сульфат магнияSigmaM7506для модифицированных рингеров Марка (MMR).
Параформальдегиднаяэлектронная микроскопия Sciences19210Разбавить 8% (w/v) запас с 2x концентрированным PBS (разбавленным из 10x PBS запаса).
Пенициллин/стрептомицинSigmaP4333-20MLРазведите 1:100 в модифицированных колпачках Marc's.
Фосфатно-солевой буфер (PBS) таблеткиDiagnostic BioSystemsDMR E404-01Сделать 10-кратный запас в деионизированной воде, автоклаве и хранить при комнатной температуре. Разбавьте до 1x рабочей концентрации.
Хлорид калияSigmaP3911для модифицированных кольцевых колец Марка (MMR) и эмбриональной среды (E3).
Хлорид натрияSigmaS9888для модифицированных Ringers Marc (MMR) и эмбриональной среды (E3).
Гидроксид натрияSigmaS5881Make 10 M и использовать для регулировки pH MMR до 7,4.
СахарозаSigma S9378
Tricaine-SPentair100G #TRS1рецепт: https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/pages/362220023/TRICAINE
Реагенты для иммуногистохимии:
Alexafluor 568 помечено Вторичное антитело для обнаружения кролика IgGInvitrogenA-11011Использование при разведении 1:500 для целого иммуногистохимия.
DAPI или ToPro3Invitrogen1306 или T3605Составлять 1 мг/мл растворов в ДМСО; разведение 1:5000 для противоокрашивания.
Диметилсульфоксид (ДМСО)SigmaD8418Компонент иммуноблочного буфера.
Метанол (MeOH)Sigma34860Смешивание MeOH с водными растворами, такими как PBST, является экзотермическим. Приготовьте растворы MeOH/PBST как минимум за несколько часов до начала использования или охладите их на льду перед использованием.
Нормальная козья сывороткаThermoFisher Scientific50-062ZКомпонент иммуноблок-буфера. Может быть аликвотирован в объемах 1-10 мл и храниться при температуре -20 °C.
Первичное антитело для обнаружения фосфогистона H3Millipore06-570Используйте в разведении 1:300 для полной иммуногистохимии.
Первичное антитело для обнаружения красного флуоресцентного белка (RFP; обнаруживает производные dsRed)MBL InternationalPM005Используйте в разведении 1:500 для иммуногистохимии в масштабе 1:500.
Протеиназа K (PK)SigmaP2308-10MGСоставлять 10 мг/мл стоковых растворов в PBS и использовать при 10 & микро; г/мл.
Triton X-100SigmaT8787Полезно для приготовления 20% (v/v) стокового раствора в PBS.
Software для анализа данных
ImageJ (Fiji)Бесплатное программное обеспечение для анализа изображений; https://imagej.net/software/fiji/
RStudioFreeware для статистического анализа и визуализации данных; https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/
Adobe Photoshop или GIMPДля компоновки фигур часто используются фирменные программы для обработки изображений (Adobe Photoshop и Illustrator). Бесплатной альтернативой является Gnu Image Manipulation Program (GIMP; https://www.gimp.org/)
Zebrafish strains. В этом исследовании использовались штаммы AB, TU, Tg[atoh7:RFP].Доступно из  Международные ресурсные центры по данио-рерио в США (https://zebrafish.org/home/guide.php) или в Европе (https://www.ezrc.kit.edu/). Специализированные трансгенные штаммы, которые еще не были депонированы ни в одном из ресурсных центров, могут быть запрошены в отдельных лабораториях после публикации.
.

Ссылки

  1. Butler, A. B., Hodos, W. Optic tectum. Comparative Vertebrate Neuroanatomy: Evolution and Adaptation. , John Wiley & Sons, Inc. 311-340 (2005).
  2. Cang, J., Feldheim, D. A. Developmental mechanisms of topographic map formation and alignment. Annual Review of Neuroscience. 36 (1), 51-77 (2013).
  3. Basso, M. A., Bickford, M. E., Cang, J. Unraveling circuits of visual perception and cognition through the superior colliculus. Neuron. 109 (6), 918-937 (2021).
  4. Burrill, J. D., Easter, S. S. Development of the retinofugal projections in the embryonic and larval zebrafish (Brachydanio rerio). The Journal of Comparative Neurology. 346 (4), 583-600 (1994).
  5. Nona, S. Regeneration in the goldfish visual system. Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. , Available from: https://webvision.med.utah.edu/book/part-x-repair-and-regeneration-in-the-visual-system/regeneration-in-the-goldfish-visual-system/ (2021).
  6. Sauve, Y., Gaillard, F. Regeneration in the visual system of adult mammals. Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. , Available from: https://webvision.med.utah.edu/book/part-x-repair-and-regeneration-in-the-visual-system/regeneration-in-the-visual-system-of-adult-mammals/ (2021).
  7. Cerveny, K. L., Varga, M., Wilson, S. W. Continued growth and circuit building in the anamniote visual system. Developmental Neurobiology. 72 (3), 328-345 (2012).
  8. Lindsey, B. W., et al. Midbrain tectal stem cells display diverse regenerative capacities in zebrafish. Scientific Reports. 9 (1), 4420(2019).
  9. Soares, D., Yamamoto, Y., Strickler, A. G., Jeffery, W. R. The lens has a specific influence on optic nerve and tectum development in the blind cavefish Astyanax. Developmental Neuroscience. 26 (5-6), 308-317 (2004).
  10. White, E. L. An experimental study of the relationship between the size of the eye and the size of the optic tectum in the brain of the developing teleost, Fundulus heteroclitus. Journal of Experimental Zoology. 108 (3), 439-469 (1948).
  11. Raymond, P., Easter, S., Burnham, J., Powers, M. Postembryonic growth of the optic tectum in goldfish. II. Modulation of cell proliferation by retinal fiber input. The Journal of Neuroscience. 3 (5), 1092-1099 (1983).
  12. Sato, Y., Yano, H., Shimizu, Y., Tanaka, H., Ohshima, T. Optic nerve input-dependent regulation of neural stem cell proliferation in the optic tectum of adult zebrafish. Developmental Neurobiology. 77 (4), 474-482 (2017).
  13. Hall, Z. J., Tropepe, V. Visual experience facilitates BDNF-dependent adaptive recruitment of new neurons in the postembryonic optic tectum. The Journal of Neuroscience. 38 (8), 2000-2014 (2018).
  14. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish. , Oxford University Press. (2002).
  15. Cold Spring Harbor Protocols. Marc's modified Ringer's (MMR) (10X, pH 7.4). Cold Spring Harbor Protocols. , (2009).
  16. Turner, K. J., Bracewell, T. G., Hawkins, T. A. Anatomical dissection of zebrafish brain development. Brain Development. 1082, 197-214 (2014).
  17. Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).
  18. ZFIN Tricaine recipe. , Available from: https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/pages/362220023/TRICAINE (2018).
  19. Zhang, L., Leung, Y. F. Microdissection of zebrafish embryonic eye tissues. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (40), e2028(2010).
  20. ZFIN protocols. , Available from: https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/overview (2021).
  21. Engerer, P., Plucinska, G., Thong, R., Trovò, L., Paquet, D., Godinho, L. Imaging subcellular structures in the living zebrafish embryo. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (110), e53456(2016).
  22. ImageJ with batteries included. Fiji. , Available from: https://figi.sc/ (2021).
  23. O'Brien, J., Hayder, H., Peng, C. Automated quantification and analysis of cell counting procedures using ImageJ plugins. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54719(2016).
  24. Poggi, L., Vitorino, M., Masai, I., Harris, W. A. Influences on neural lineage and mode of division in the zebrafish retina in vivo. The Journal of Cell Biology. 171 (6), 991-999 (2005).
  25. Karlstrom, R. O., et al. Zebrafish mutations affecting retinotectal axon pathfinding. Development. 123 (1), 427-438 (1996).
  26. Harvey, B. M., Baxter, M., Granato, M. Optic nerve regeneration in larval zebrafish exhibits spontaneous capacity for retinotopic but not tectum specific axon targeting. PLOS ONE. 14 (6), 0218667(2019).
  27. Robles, E., Filosa, A., Baier, H. Precise lamination of retinal axons generates multiple parallel input pathways in the tectum. Journal of Neuroscience. 33 (11), 5027-5039 (2013).
  28. Vargas, M. E., Barres, B. A. Why Is Wallerian degeneration in the CNS so slow. Annual Review of Neuroscience. 30 (1), 153-179 (2007).
  29. Hughes, A. N., Appel, B. Microglia phagocytose myelin sheaths to modify developmental myelination. Nature Neuroscience. 23 (9), 1055-1066 (2020).
  30. de Calbiac, H., Dabacan, A., Muresan, R., Kabashi, E., Ciura, S. Behavioral and physiological analysis in a zebrafish model of epilepsy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (176), e58837(2021).
  31. Adams, S. L., Zhang, T., Rawson, D. M. The effect of external medium composition on membrane water permeability of zebrafish (Danio rerio) embryos. Theriogenology. 64 (7), 1591-1602 (2005).
  32. Fredj, N. B., et al. Synaptic activity and activity-dependent competition regulates axon arbor maturation, growth arrest, and territory in the retinotectal projection. Journal of Neuroscience. 30 (32), 10939-10951 (2010).
  33. Alberio, L., et al. A light-gated potassium channel for sustained neuronal inhibition. Nature Methods. 15 (11), 969-976 (2018).
  34. Kay, J. N., Finger-Baier, K. C., Roeser, T., Staub, W., Baier, H. Retinal ganglion cell genesis requires lakritz, a zebrafish atonal homolog. Neuron. 30 (3), 725-736 (2001).
  35. Gnuegge, L., Schmid, S., Neuhauss, S. C. F. Analysis of the activity-deprived zebrafish mutant macho reveals an essential requirement of neuronal activity for the development of a fine-grained visuotopic map. The Journal of Neuroscience. 21 (10), 3542-3548 (2001).
  36. Jeffery, W. R. Astyanax surface and cave fish morphs. EvoDevo. 11 (1), 14(2020).
  37. Sieger, D., Peri, F. Animal models for studying microglia: The first, the popular, and the new. Glia. 61 (1), 3-9 (2013).
  38. Svahn, A. J., et al. Development of ramified microglia from early macrophages in the zebrafish optic tectum. Developmental Neurobiology. 73 (1), 60-71 (2013).
  39. Herzog, C., et al. Rapid clearance of cellular debris by microglia limits secondary neuronal cell death after brain injury in vivo. Development. 146 (9), (2019).
  40. Chen, J., Poskanzer, K. E., Freeman, M. R., Monk, K. R. Live-imaging of astrocyte morphogenesis and function in zebrafish neural circuits. Nature Neuroscience. 23 (10), 1297-1306 (2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

зрительный холмретинальные аксоныразвитие нервной системыдиссекция мозгаиммуногистохимиявизуализация живых клетокВаллеровская дегенерацияниши стволовых клеток
Удаление глаз у живых личинок рыбок данио для изучения иннерваторно-зависимого роста и развития зрительной системы
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.