Удаление глаз у живых личинок рыбок данио для изучения иннерваторно-зависимого роста и развития зрительной системы

Summary

В статье объясняется, как хирургически удалить глаза у живых личинок рыбок данио в качестве первого шага к исследованию того, как вход сетчатки влияет на рост и развитие зрительного тектума. Кроме того, в статье представлена информация об обезболивании личинок, фиксации и рассечении мозга с последующей иммуногистохимией и конфокальной визуализацией.

Abstract

Рыбки данио демонстрируют замечательный пожизненный рост и регенеративные способности. Например, специализированные ниши стволовых клеток, созданные во время эмбриогенеза, поддерживают непрерывный рост всей зрительной системы, как в глазу, так и в мозге. Скоординированный рост между сетчаткой и оптическим тектумом обеспечивает точное ретинотопическое картирование по мере добавления новых нейронов в глаза и мозг. Чтобы решить, предоставляют ли аксоны сетчатки важную информацию для регулирования поведения тектальных стволовых и клеток-предшественников, таких как выживание, пролиферация и / или дифференцировка, необходимо иметь возможность сравнивать иннервированные и денервированные тектальные доли внутри одного и того же животного и у разных животных.

Хирургическое удаление одного глаза у живой личинки рыбки данио с последующим наблюдением за оптическим тектумом достигает этой цели. В сопроводительном видео показано, как обезболить личинок, электролитически заточить вольфрамовые иглы, и использовать их для удаления одного глаза. Далее показано, как препарировать мозг у неподвижных личинок рыбок данио. Наконец, видео содержит обзор протокола иммуногистохимии и демонстрацию того, как монтировать окрашенные эмбрионы в агарозу с низкой температурой плавления для микроскопии.

Introduction

Целью этого метода является исследование того, как вход сетчатки влияет на рост и развитие оптического тектума, центра визуальной обработки в мозге рыбок данио. Удалив один глаз, а затем сравнив две стороны оптического тектума, можно наблюдать и нормализовать тектальные изменения в одном образце, что позволяет сравнивать несколько образцов. Современные молекулярные подходы в сочетании с этой техникой дадут представление о механизмах, лежащих в основе роста и развития зрительной системы, а также аксональной дегенерации и регенерации.

Сенсорные системы - зрительная, слуховая и соматосенсорная - собирают информацию от внешних органов и передаю....

Protocol

Методы в этой статье были проведены в соответствии с руководящими принципами и одобрением институциональных комитетов по уходу за животными и их использованию Рид-колледжа и Университетского колледжа Лондона. Смотрите Таблицу материалов для получения подробной информации о штаммах рыбок данио, используемых в этом исследовании.

1. Подготовка материалов и инструментов

1. Принимайте решения.
   1. Получают эмбриональную среду (E3¹⁴) путем разбавления 60-кратного запаса (300 мМ NaCl, 10,2 мМ KCl, 20 мМ CaCl 2-дигидрата и 20 мМ MgCl_{2-гексагидрата} в деионизированной вод....

Results

Чтобы подтвердить, было ли удаление глаз полным, и оценить, как изменяется оптический тектум, были проведены операции в штамме Tg[atoh7:RFP], который маркирует все RGC мембранно-целевым RFP и, таким образом, все аксоны, которые проецируются из сетчатки и образуют зрительный нерв²⁴. Хотя использование этого штамма не является абсолютно необходимым, оно позволяет легко наблюдать и визуализировать термин зрительного нерва в оптическом тектуме нейропила. Другие подходы к маркировке зрительног.......

Discussion

Методы, описанные в этой статье, иллюстрируют один из многих подходов к изучению развития зрительной системы позвоночных у рыбок данио. Другие исследователи опубликовали методы рассечения эмбриональной сетчатки и проведения анализа экспрессии генов¹⁹ или визуализации активности нейронов в зрительном тектуме³⁰. В этой статье представлен подход к изучению того, как дифференциальный ввод сетчатки может влиять на поведение клеток в оптической тектуме.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Оборудование и расходные материалы:
Breed боксы	Aquaneering	ZHCT100
высоковакуумной смазкой Dow Corning	Sigma или эквивалентным поставщиком	Z273554
колбами Эрленмейера (125 мл)			Для изготовления модифицированных колб Marc's Ringer (MMR) с антибиотиками для послеоперационной инкубации.
Тонкие щипцы - Dumont #5	Fine Science Tools (FST)	11252-20
Стеклянные пипетки Пастера	DWK Lifescience	63A53 & 63A53WT	Для пипетирования эмбрионов и личинок.
Стеклянные предметные стекла для микроскопии	VWR или аналогичного поставщика	48311-703	Стандартные стеклянные предметные стекла для микроскопа можно заказать у многих различных поставщиков лабораторий.
Стеклянная посуда, включая градуированные бутылки и градуированные цилиндры,			для приготовления и хранения растворов.
2-компонентный эпоксидный смола	ACE Hardware или другой эквивалентный поставщик клея Gorilla или эквивалентный	шприц 0,85 унции	https://www.acehardware.com/departments/paint-and-supplies/tape-glues-and-adhesives/glues-and-epoxy/1590793
микроцентрифужной трубке (1,7 мл)	VWR или эквивалентный поставщик	22234-046
Никелированный держатель штифта (длина 17 см)	Fine Science Tools (FST)	26018-17	Для удержания вольфрамовой проволоки во время заточки и выполнения операций/вскрытий.
Нейлоновое сетчатое ситечко для чая или эквивалент	Ali Express или эквивалент		для сбора икры данио рерио после нереста; https://www.aliexpress.com/item/1005002219569756.html
Скрепка			для устройства для заточки вольфрамовых игл.
Чашки Петри 100 мм	Fischer Scientific или эквивалент поставщика	50-190-0267
Чашки Петри 35 мм	Fischer Scientific или эквивалентный поставщик	08-757-100A
Дозатор	SP Bel-Art или эквивалент	F37898-0000
Гидроксид калия (KOH)	Sigma	909122	Для устройства для заточки вольфрамовых игл. Приготовьте 10% w/v раствор KOH в вытяжке, добавив гранулы в деионизированную воду.
Источник питания (переменное напряжение)			Для устройства для заточки вольфрамовых игл. Подойдет любой источник питания с переменным напряжением (даже тот, который используется для гелевого электрофореза).
Sylgard 184 Набор эластомеров	Dow Corning	3097358
Вольфрамовая проволока (диаметр 0,125 мм)	World Precision Instruments (WPI)	TGW0515	Заточка для удаления глаз и препарирования личинок.
Термоблок с регулируемой температурой	Лабораторный склад или эквивалентный поставщик	BSH1001 или BSH1002	Установлено на 40-42 ° C опережает эксперименты.
Стеклянная банка с широким горлышком и крышкой (например, чистая банка из-под варенья или сальсы)			Для устройства для заточки вольфрамовых игл.
Провода с зажимом из кожи аллигатора Для			устройства для заточки вольфрамовых игл
<сильно>микроскопы:
Препарирующий микроскоп			Подойдет любой тип, но предпочтительнее иметь регулируемый проходящий свет на зеркальном основании.
Рекомендуется лазерный сканирующий конфокальный микроскоп			High NA, 20-25-кратный объектив с погружением в воду. Здесь используется программное обеспечение для управления микроскопом и захвата изображений (NIS-Elements от Nikon), но подойдет любой конфокальный микроскоп.
<сильно>реагенты для операций и вскрытий:
дигидрат хлорида кальция	Sigma	C7902	для модифицированных рингеров Марка (MMR) и эмбриональной среды (E3).
HEPES	Sigma	H7006	для модифицированных звонков Марка (MMR).
Низкая температура плавления агарозы	Invitrogen	16520-050	Сделайте 1% в среде эмбриона (E3) или Marc's Modified Ringers (MMR).
Магния хлорид гексагидрат	Sigma	1374248	Для эмбриональной среды (Е3).
Сульфат магния	Sigma	M7506	для модифицированных рингеров Марка (MMR).
Параформальдегидная	электронная микроскопия Sciences	19210	Разбавить 8% (w/v) запас с 2x концентрированным PBS (разбавленным из 10x PBS запаса).
Пенициллин/стрептомицин	Sigma	P4333-20ML	Разведите 1:100 в модифицированных колпачках Marc's.
Фосфатно-солевой буфер (PBS) таблетки	Diagnostic BioSystems	DMR E404-01	Сделать 10-кратный запас в деионизированной воде, автоклаве и хранить при комнатной температуре. Разбавьте до 1x рабочей концентрации.
Хлорид калия	Sigma	P3911	для модифицированных кольцевых колец Марка (MMR) и эмбриональной среды (E3).
Хлорид натрия	Sigma	S9888	для модифицированных Ringers Marc (MMR) и эмбриональной среды (E3).
Гидроксид натрия	Sigma	S5881	Make 10 M и использовать для регулировки pH MMR до 7,4.
Сахароза		Sigma S9378
Tricaine-S	Pentair	100G #TRS1	рецепт: https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/pages/362220023/TRICAINE
Реагенты для иммуногистохимии:
Alexafluor 568 помечено Вторичное антитело для обнаружения кролика IgG	Invitrogen	A-11011	Использование при разведении 1:500 для целого иммуногистохимия.
DAPI или ToPro3	Invitrogen	1306 или T3605	Составлять 1 мг/мл растворов в ДМСО; разведение 1:5000 для противоокрашивания.
Диметилсульфоксид (ДМСО)	Sigma	D8418	Компонент иммуноблочного буфера.
Метанол (MeOH)	Sigma	34860	Смешивание MeOH с водными растворами, такими как PBST, является экзотермическим. Приготовьте растворы MeOH/PBST как минимум за несколько часов до начала использования или охладите их на льду перед использованием.
Нормальная козья сыворотка	ThermoFisher Scientific	50-062Z	Компонент иммуноблок-буфера. Может быть аликвотирован в объемах 1-10 мл и храниться при температуре -20 °C.
Первичное антитело для обнаружения фосфогистона H3	Millipore	06-570	Используйте в разведении 1:300 для полной иммуногистохимии.
Первичное антитело для обнаружения красного флуоресцентного белка (RFP; обнаруживает производные dsRed)	MBL International	PM005	Используйте в разведении 1:500 для иммуногистохимии в масштабе 1:500.
Протеиназа K (PK)	Sigma	P2308-10MG	Составлять 10 мг/мл стоковых растворов в PBS и использовать при 10 & микро; г/мл.
Triton X-100	Sigma	T8787	Полезно для приготовления 20% (v/v) стокового раствора в PBS.
Software для анализа данных
ImageJ (Fiji)			Бесплатное программное обеспечение для анализа изображений; https://imagej.net/software/fiji/
RStudio			Freeware для статистического анализа и визуализации данных; https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/
Adobe Photoshop или GIMP			Для компоновки фигур часто используются фирменные программы для обработки изображений (Adobe Photoshop и Illustrator). Бесплатной альтернативой является Gnu Image Manipulation Program (GIMP; https://www.gimp.org/)
Zebrafish strains. В этом исследовании использовались штаммы AB, TU, Tg[atoh7:RFP].			Доступно из  Международные ресурсные центры по данио-рерио в США (https://zebrafish.org/home/guide.php) или в Европе (https://www.ezrc.kit.edu/). Специализированные трансгенные штаммы, которые еще не были депонированы ни в одном из ресурсных центров, могут быть запрошены в отдельных лабораториях после публикации.