Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Анализ липидной сигнализации в фоторецепторах дрозофил с помощью масс-спектрометрии

1.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/63516

⸱

7 марта 2022 г.

 ,  ,  , 
1National Centre for Biological Sciences-TIFR, GKVK Campus, 2Department of Cell Biology, Yale University, 3Department of Neuroscience, Brown University

В этой статье

Краткое содержание

В рукописи представлены универсальные, надежные и чувствительные протоколы масс-спектрометрии для идентификации и количественного определения нескольких классов липидов фоторецепторов дрозофилы .

Аннотация

Активация фосфолипазы Cβ (PLCβ) является важным этапом во время сенсорной трансдукции в фоторецепторах дрозофилы . Активность PLCβ приводит к гидролизу мембранного липидного фосфатидилинозитола 4,5 бисфосфата [PI(4,5)P2], что в конечном итоге приводит к активации переходных рецепторных потенциалов (TRP) и TRP-подобных (TRPL) каналов. Активность PLCβ также приводит к образованию многих видов липидов, некоторые из которых, как предполагается, играют роль в активации TRP и TRPL. Кроме того, было предложено, чтобы несколько классов липидов играли ключевую роль в организации клеточной биологии фоторецепторов для оптимизации сигнальных реакций для оптимальной сенсорной трансдукции. Исторически сложилось так, что эти открытия были обусловлены способностью выделять мутантов дрозофилы для ферментов, которые контролируют уровни специфических липидов и выполняют анализ физиологии фоторецепторов у этих мутантов. В последнее время разработаны мощные методы масс-спектрометрии для выделения и количественного анализа липидов с высокой чувствительностью и специфичностью. Они особенно подходят для использования у дрозофил, где теперь возможен анализ липидов по фоторецепторам без необходимости мечения радионуклидами. В данной статье рассматриваются концептуальные и практические аспекты использования липидной масс-спектрометрии для надежной, чувствительной и точной количественной оценки различных сигнальных липидов в фоторецепторах дрозофилы . Наряду с существующими методами молекулярной генетики и физиологического анализа, такой липид, вероятно, усилит способность фоторецепторов в качестве модельной системы для открытий в биологии.

Введение

Фототрансдукция у дрозофил опосредована каскадом PLCβ, связанным с G-белком, что приводит к активации светоактивируемых каналов TRP и TRPL1. PLCβ гидролизует связанный с мембраной фосфолипид, фосфатидилинозитол 4,5 бисфосфат [PI(4,5)P2] и образует диацилглицерин (DAG) и инозитол 1,4,5 трисфосфат (IP3). Затем DAG фосфорилируется DAG-киназой с образованием фосфатидной кислоты (PA). Впоследствии, посредством ряда реакций, включающих образование липидных промежуточных продуктов, PI(4,5)P2 регенерируется2. Несколько компонентов этого цикла PI(4,5)P2 функционируют в фоторецепторах дрозофилы . Механизм, с помощью которого активация ПЛК приводит к гейтингу каналов TRP и TRPL, остается неразгаданным. Тем не менее, несколько линий данных свидетельствуют о том, что промежуточные липидные продукты, образующиеся при гидролизе PI(4,5)P2 , могут опосредутьэтот процесс3. Таким образом, очень важно идентифицировать и количественно определить эти липидные промежуточные продукты, чтобы пролить свет на механизм активации TRP и TRPL в фототрансдукции дрозофилы . В дополнение к своей роли в фототрансдукции как таковой, липиды также играют несколько важных ролей в клеточной организации фоторецепторов (рассмотрено впункте 3). Понимание этих функциональных ролей липидов облегчается способностью обнаруживать и количественно оценивать их уровни in vivo. В данной статье представлен обзор, а также протоколы выбора и реализации методов количественного определения липидов фоторецепторов дрозофилы .

Исторически сложилось так, что липидный анализ состоял из фракционирования по химическим классам с последующим анализом отдельных классов. Для успешной идентификации и количественного определения липидов было разработано множество аналитических методов, которые представляют собой либо целенаправленный, либо нецелевой анализ липидов 4,5,6,7,8,9,10. Целевой анализ сосредоточен на известных липидах и использует специальный метод с высокой чувствительностью для количественного анализа этих конкретных липидов. Нецелевой анализ липидов направлен на одновременное обнаружение многих видов липидов в образце. К таким аналитическим методам относятся тонкослойная хроматография (ТСХ)4, газовая хроматография (ГХ)5, жидкостная хроматография (ЖХ)6, иммуноферментный анализ (ИФА)7, ядерный магнитный резонанс (ЯМР)8, радионуклидное мечение и масс-спектрометрия (МС)9,10. Несмотря на то, что радиоактивное мечение является чувствительным методом обнаружения липидов и может быть использовано в контексте культивируемых клеток, его использование для анализа липидов в интактных организмах, таких как дрозофила, является сложной задачей из-за соображений безопасности радиоактивного мечения живых летающих животных. Другая проблема, связанная с радиоактивным мечением, заключается в том, что оно зависит от мечения всех пулов прекурсоров до состояния, близкого к равновесию, а это может быть сложно в контексте моделей in vivo.

Комплексный анализ липидов с использованием РС является недавним достижением, которое стало возможным благодаря развитию современных технологий РС11. Анализ липидов на основе МС имеет ряд преимуществ, к ним относятся небольшие размеры образцов, применимость к образцам из животных моделей, высокая чувствительность, специфичность, а также высокая пропускная способность. В частности, широкое использование ионизации электроспреем привело к улучшению характеристик МС для анализа липидов. Усовершенствование масс-анализаторов в масс-спектрометрах, в том числе комбинация различных масс-анализаторов, добавило дополнительных преимуществ, а разработка масс-анализатора высокого разрешения возродила исследования липидов11. Анализ, основанный на МС, характеризует липидные молекулы двумя основными способами: (1) нисходящая липидомика, где эксперименты с РС направлены на быструю количественную характеристику глобальных изменений внутри липидома и полагаются исключительно на точные массы интактных липидных предшественников12; (2) Восходящая липидомика, которая количественно определяет отдельные молекулярные виды путем обнаружения характерных ионов структурных фрагментов с использованием тандема MS13,14.

В целом, анализ липидов в фоторецепторах дрозофилы состоит из двух этапов: во-первых, экстракция липидов из тканей глаза/головы и во-вторых, анализ экстрагированных липидов методом МС. Это может быть выполнено с помощью одного из следующих методов: разделение липидов с помощью жидкостной хроматографии (ЖХ) в сочетании с МС или без хроматографической сепарации с помощью дробовой липидомики/прямой инфузии МС (ДИМС). Оба подхода к профилированию липидов основаны на использовании ионизационной системы электрораспылением МС (ESI-MS) и доказали свою чувствительность, количественную и эффективность10,15. При анализе DIMS идентификация липидов основана на массе ионов предшественников, сканировании нейтральных потерь и сигнатурах, специфичных для класса липидов 14,16,17,18. Несмотря на то, что этот подход сочетает в себе скорость анализа и надежность, нельзя избежать подавления ионов липидов с низким содержанием из-за присутствия в образце большого содержания и высокой поляризуемости липидов. Таким образом, малораспространенные липиды, такие как фосфоинозитиды и PA, часто не обнаруживаются или плохо обнаруживаются стандартными платформами DIMS, в том числе из-за подавления ионов19,20. Разделение жидкостной хроматографии перед МС (ЖХ-МС) может помочь преодолеть подавление ионов, а также сфокусировать анализ конкретных классов или видов липидов, представляющих интерес21.

В этой статье описаны этапы, связанные с количественной оценкой основных липидов, представляющих интерес в фоторецепторах дрозофилы. В связи с этим были оптимизированы три различных подхода к МС: (1) DIMS с использованием масс-спектрометра с высоким разрешением, (2) обратная фазовая жидкостная хроматография-МС ПОСЛЕ ДЕРИВАТИЗАЦИИ (RPLC-MS) с использованием тройного четырехкратного масс-спектрометра и (3) нормальнофазная жидкостная хроматография с усилением мониторинга множественных реакций продукта ion scan-MS (NPLC-MRM-EPI-MS) с использованием тройного четырехкратного масс-спектрометра с расширенной функцией сканирования ионов продукта. Выбор между этими методами продиктован конкретными исследуемыми исследовательскими вопросами. Для глобального описания и анализа всех видов глицерофосфолипидов, участвующих в фототрансдукции, следует использовать DIMS. Однако следует отметить, что при таком подходе малополяризуемые и малораспространенные глицерофосфолипиды, такие как фосфоинозитиды, вряд ли будутобнаружены22. Для обнаружения этих липидов с низким содержанием следует провести постдериватизацию RPLC-MS. Используя этот подход, мы успешно обнаружили и количественно определили фосфатидную кислоту (PA)23,24,25, фосфатидилинозитол (PI), фосфатидилинозитол 5 фосфат (PI5P)26, фосфатидилинозитол 4 фосфат (PI4P) и PI(4,5)P 2 27. Методы DIMS и RPLC-MS после дериватизации генерируют информацию на уровне класса липидов. Например, используя эти два метода, можно количественно определить PA (34:2), m/z которого согласуется с несколькими молекулярными соединениями, включая: (i) PA (16:0/18:2), (ii) PA (18:2/16:0), (iii) PA (16:2/18:0), (iv) PA (18:0/16:2), (v) PA (16:1/18:1), (vi) PA (18:1/16:1), (vii) PA (14:2/20:0) и (viii) PA (20:0/14:2). Используя эти методы, невозможно получить информацию о составе жировой ацильной цепи ПА (34:2), присутствующей в образце. Эту проблему можно решить с помощью гибридного метода МС, который сочетает в себе разделение LC, мониторинг множественных реакций (MRM) и усиленное сканирование ионов продукта (EPI). Этот метод является как чувствительным, так и количественным и позволяет: проводить прямые измерения, т.е. без какой-либо предварительной маркировки или последующей обработки образца, и устанавливать молекулярные формы с точной информацией о жирной ацильной цепи25. С помощью этого метода мы идентифицировали большое количество молекулярных форм ПА и определили точный состав жировых ацильных цепей в SN1 и SN2 глицеринового каркаса. Такой подход будет полезен при анализе функции конкретных молекулярных форм любого класса липидов в фоторецепторах. Представленные здесь подробные протоколы для каждого из этих типов анализов могут быть адаптированы к другим сигнальным липидам, имеющим отношение к функции фоторецепторов дрозофилы (схемы см. на рисунке 1). Следует отметить, что подробные методы анализа липидомики нескольких других классов липидов (не рассматриваемых в данной статье) были описаны в другом месте. К ним относятся керамиды28,29, сфинголипиды30,31, нейтральные липиды, такие как диглицериды и триглицериды32,33, и стеролы15,33. В некоторых случаях методы анализа этих липидов были описаны для тканей личинок дрозофилы и могут быть адаптированы для использования в фоторецепторах.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Выращивание мух и приготовление химикатов

  1. Задние мухи (Drosophila melanogaster) на стандартном корме для мух в инкубаторе с относительной влажностью 50% при 25 °C без внутреннего освещения. Приготовьте корм для мух, добавив 80 г/л кукурузной муки, 20 г/л D-глюкозы, 40 г/л сахарозы, 8 г/л агара, 15 г/л дрожжевого экстракта, 4 мл пропионовой кислоты, 0,7 г/л TEGO (метилпарагидроксибензоата) и 0,6 мл ортофосфорной кислоты, как описано впункте 34 и также доступно в https:// bangalorefly.ncbs.res.in/drosophila-media-preparation. Вырастите одну парочку мух после эклосиции в охлаждаемом инкубаторе при температуре 25 °C с непрерывным белым светом ~ 2 000 люкс.
  2. Приготовьте фосфоинозитидный элюирующий буфер (ПЭБ), добавив хлороформ:метанол:2,4 М соляную кислоту в соотношении 250:500:200 (об./об./об.). Приготовьте промывочный буфер нижней фазы (LPWS), добавив метанол:1 М соляная кислота:хлороформ в соотношении 235:245:15 (об./об./об.). Приготовьте промывочный раствор после дериватизации, добавив хлороформ:метанол:вода в соотношении 8:4:3 (об./об./об.).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте растворители и химикаты класса MS. Не храните буфер PEB и LPWS более 3 месяцев.
  3. Используйте колонку C4 (1,7 мкм x 1 мм x 100 мм) для фосфоинозитидов, PI4P и PI(4,5)P2 и колонку C18 (1,0 мм x 100 мм x 1,7 мм) для PA, фосфатидилхолина (PC) и фосфатидилинозитола (PI). Для метода NPLC-MRM-EPI используйте колонку из диоксида кремния (1 мм x 150 мм x 3 мкм).
  4. Приготовьте элюент А, добавив гексан:изопропиловый спирт:100 мМ водный ацетат аммония в соотношении 68:30:2 (об./об./об.) и элюент В, добавив гексан:изопропиловый спирт:100 мМ водный ацетат аммония в соотношении 70:20:10 (об./об./об.) для PA, PC и PI. Готовят растворитель А для фосфоинозитидов путем добавления 0,1% муравьиной кислоты в воду и растворитель В путем добавления 0,1% муравьиной кислоты в ацетонитрил.

2. Выделение тканей

  1. Соберите 10 мух на образец с помощью анестезии углекислым газом (CO2) (мухи обездвиживаются в течение нескольких секунд) и обезглавьте мух с помощью острого лезвия на анестезирующей пластине CO2 .
  2. Соберите темных или светлых адаптированных мух определенного возраста (12-24 часа) в пробирки объемом 1,5 мл и заморозьте в жидком азоте. Обезвоживают мух в ацетоне при -80 °С в течение 48 ч в стеклянном флаконе35. Для ткани сетчатки соберите 100 сетчатки от лиофилизированных мух. С помощью скальпеля удалите глаза из остальной части головы и вычерпните сетчатку.
  3. Для анализа фосфоинозитидов PI4P и PI(4,5)P2 при работе со свежей сетчаткой используют 25 сетчатки на образец от мух, выращенных в условиях соответствующей освещенности, для измерения уровня липидов при освещении и от мух, выращенных без света, для измерения уровня липидов в темноте. Хранить в 50 мкл 1x PBS в гомогенизаторных пробирках на сухом льду до готовности к экстракции.

3. Экстракция липидов

ВНИМАНИЕ: Хлороформ является токсичным растворителем и является канцерогенным по своей природе. Он поражает репродуктивную систему и является раздражителем кожи и глаз. Следует соблюдать осторожность при обращении с этим химическим веществом. Все действия с использованием хлороформа должны выполняться в хорошо проветриваемом химическом колпаке.

  1. Для всех глицерофосфолипидов, кроме PI4P и PI(4,5)P2
    1. Для каждого образца гомогенизировать 10 голов мух или 100 сетчаток (собранных, как описано на шаге 2.2) в 0,1 мл 0,1 Н ледяного метанольного HCl и 30 мкл внутренней стандартной смеси (PA (17:0/14:1), PC (17:0/14:1), лизофосфатидной кислоте (LPA; 13:0), лизофотидилхолине (LPC; 13:0), LPC (17:1), PA (17:0/17:0), PA (16:0-D31/18:1), LPA (17:1), LPC (19:0), PI (12:0/13:0), PA (12:0/13:0) и PC (12:0/13:0)). Подготовьте стандарты таким образом, чтобы окончательное количество любого стандарта липидов попадало в пределах линейной кривой отклика масс-спектрометра.
    2. Гомогенизируйте ткани с помощью автоматизированного гомогенизатора, который позволяет быстро и одновременно обрабатывать все образцы. Кратковременно раскрутите пробирки в настольной центрифуге и убедитесь, что не образуются гранулы - это указывает на полную гомогенизацию. Перелейте метанольный гомогенат в микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл с крышкой.
    3. Добавьте 0,2 мл ледяной 0,1 Н метаноловой гидрохлориды для восстановления остатков в пробирке и соедините в пробирке объемом 2 мл. Добавьте 0,1 мл 0,1 Н ледяного метаноликового гидрохлора, а затем 0,8 мл хлороформа и тщательно перемешайте. Дать смеси, содержащей гомогенат тканей, постоять на льду в течение 10 мин, а затем добавить 0,4 мл 0,88% KCl и вортекс на 30 с.
    4. Центрифугируйте смесь при давлении 1 000 x g в течение 10 минут при 4 °C для разделения водной и органической фаз. Нижнюю органическую фазу, содержащую липиды, очень осторожно вынуть, не смешивая с водной фазой, и переложить в свежую микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во время экстракции липидов переносите нижнюю органическую фазу с особой осторожностью, чтобы избежать смешивания с водной фазой, что может затруднить последующий анализ липидов.
    5. Высушите этот липидный раствор в вакуумном испарителе при температуре 4 °C, визуально осмотрите образец, чтобы убедиться в полной сушке. Ресуспендируйте в 420 мкл смеси метанол:хлороформ 2:1 для анализа. Анализируйте образцы сразу без хранения.
  2. Для фосфоинозитидов PI4P и PI(4,5)P2
    1. Гомогенизировать 25 сетчатку в 950 мкл фосфоинозитидного элюирующего буфера (PEB; 250 мл CHCl3, 500 мл метанола и 200 мл 2,4 М HCl) и добавить внутренние стандарты (фосфатидилэтаноламин (ПЭ) 17:0/14:1; ПИ (17:0/14:1); PI4P (17:0/20:4); и смесь PI(4,5)P2 (16:0/16:0)), содержащую 50 нг PI, 25 нг PI4P, 50 нг PI(4,5)P2 и 0,2 нг PE на образец.
    2. Добавьте по 250 мкл хлороформа и 2,4 М HCl, после чего проводят ультразвук в течение 2 мин и центрифугирование при 1000 x g в течение 5 мин при 4 °C для разделения фаз. Выньте нижнюю органическую фазу в свежую пробирку, промойте 900 мкл LPWS и центрифугируйте при 1 000 x g в течение 5 минут при 4 °C.
    3. Извлеките липиды из оставшейся водной фазы, еще раз выполнив разделение фаз, как показано на шаге 3.2.2. Высушите собранные органические фазы в вакуумной центрифуге, установленной при температуре 4 °С, визуально осмотрите образцы для обеспечения полной сушки.

4. Анализ на органические фосфаты

  1. Сделайте стоковый раствор 7,34 мМ КН2ГО4. Стандартные разведения с использованием дистиллированной воды проводят в микроцентрифужных пробирках в соответствии с таблицей 1. Слегка закрутите пробирки и перенесите стандартные разведения в бесфосфатные стеклянные пробирки.
  2. Подготовьте отдельный набор стеклянных пробирок, содержащих образцы липидов. Оптимизируйте объем липидных образцов таким образом, чтобы абсорбция на длине волны 630 нм (после выполнения этого протокола) находилась в диапазоне стандартных KH2PO4 (от 0 до 20x).
  3. Нагрейте стеклянные трубки, содержащие стандартные разбавления, до 120 °C до полного высыхания. Нагрейте стеклянные трубки, содержащие образцы липидов (отнимите 1/8часть от общего объема образца, необходимого для получения абсорбции в пределах стандарта KH2PO4) при температуре 90 °C до полного высыхания.
  4. Добавьте 50 μL 70% хлорной кислоты во все пробирки и нагревайте при 180 °C в течение 30 минут. Охладите трубки до комнатной температуры. Добавьте в каждую пробирку 250 μл воды, 50 μл 2,5% молибдата аммония и 50 μл 10% аскорбиновой кислоты.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 2,5% молибдата аммония и 10% аскорбиновой кислоты являются массовыми/объемными концентрациями. Они должны быть свежеприготовленными и могут храниться при температуре 4 °C до 1 недели.
  5. Пробирки выдерживают в встряхивающем инкубаторе при температуре 37 °C в течение 1 ч. Внесите 130 мкл образца в 96-луночный планшет и измерьте поглощение на длине волны 630 нм с помощью спектрофотометра.

5. Дериватизация

ВНИМАНИЕ: Сообщается, что триметилсилилдиазометан (TMSD) оказывает множество токсикологических эффектов на человека. ТМСД в растворе нацелен на почки, печень, желудочно-кишечный тракт, скелетные мышцы, центральную нервную систему, дыхательную и репродуктивную системы. При работе с этим химическим веществом следует соблюдать крайнюю осторожность. Весь процесс должен выполняться в хорошо проветриваемом химическом колпаке.

  1. К нижней органической фазе образцов, полученных в конце стадии 3.2.3, добавляют 50 мкл 2 М ТМСД. Дайте реакции протекать при комнатной температуре в течение 10 минут при постоянном встряхивании при 250 об/мин. Через 10 мин добавьте 10 мкл ледяной уксусной кислоты для гашения реакции, о чем свидетельствует исчезновение желтого цвета в растворе.
  2. Постучайте по трубкам и осторожно откройте их, чтобы удалитьN2 , образовавшийся в реакции закалкивания. После того, как газ N2 выйдет, закройте трубки и поверните их вниз. Затем добавьте 600 μL раствора для промывки после дериватизации и вортексируйте в течение 2 минут в миксере при 250 об/мин.
  3. Выбросьте ~400 μL из верхней фазы, которая будет формироваться. Повторите шаг 5.2. Выбросьте всю верхнюю фазу и добавьте 50 μл 90% метанола в нижнюю фазу и перемешайте.
  4. Высушите образцы в течение 2 ч в центробежном концентраторе при давлении 800 x g , работающем в вакууме. После высыхания пробирки должны содержать ~20 мкл оставшегося образца. Добавьте 180 μл 100% метанола, хорошо перемешайте и храните при температуре 4 °C до 2-3 дней до LC-MS/MS.

6. Сбор и анализ данных

  1. Сбор данных при прямой инфузионной терапии МС (DIMS)
    ПРИМЕЧАНИЕ: МС может быть выполнен методом прямой инфузии или жидкостной хроматографии МС (ЖХ-МС). В этом разделе мы описываем РС на основе прямой инфузии.
    1. Перед началом эксперимента откалибруйте масс-спектрометр в соответствии с инструкциями производителя.
    2. Построить линейную кривую отклика для ряда разбавлений синтетических стандартов и на основе линейного отклика прибора разбавить образец таким образом, чтобы интенсивность липидного аналита попадала в пределах линейности прибора. Разбавьте общие липидные экстракты или нормы липидов смесью метанол:хлороформ 2:1 (об/об.). Подбирайте разведение общих липидных экстрактов и синтетические стандарты индивидуально для каждого эксперимента.
    3. Переложите экстракты и стандарты в отдельные флаконы. Избегайте образования пузырьков воздуха во время переноса образцов во флаконы с образцами РС. Пузырьки воздуха создадут высокое давление в колонке и затруднят анализ липидов.
    4. Перед анализом образцы центрифугируют в течение 9 минут при давлении 6 440 x g и загружают в 96-луночный планшет и герметизируют алюминиевой фольгой.
    5. Выполнение анализа МС на масс-спектрометре высокого разрешения методом прямой инфузии. Достижение стабильной ионизации глицерофосфолипидов на основе ESI с помощью роботизированного нанопроточного источника ионов с использованием чипов с распылительными форсунками диаметром 4,1 мкм.
    6. Управлять источником ионов с помощью заказного программного обеспечения масс-спектрометра и устанавливать напряжения ионизации на +1,2 кВ и -1 кВ в положительном и отрицательном режимах соответственно; противодавление при давлении 1 фунт на квадратный дюйм в обоих режимах; и температура ионного переноса капилляра на уровне 180 °C. Сбор данных выполняется с массовым разрешением, Rm/z400 = 100 000. На рисунке 2A показан программный интерфейс для настройки параметров масс-спектрометра.
    7. Повторно растворите высушенные общие липидные экстракты в 400 мкл хлороформа:метанола (1:2). Для анализа загрузите 60 мкл образцов на 96-луночный ионный источник и запечатайте алюминиевой фольгой. Анализируйте каждый образец в течение 20 минут в режиме положительных ионов для обнаружения ФХ, фосфатидилсерина (PS), фосфатидилэтаноламина, PE-O (связанного с эфиром фосфатидилэтаноламина), керамида (Cer) и керамидфосфата (Cer-P).
    8. Провести независимый сбор данных в режиме отрицательных ионов в течение 20 мин, где были обнаружены PA и PI. На рисунке 2B приведены конкретные сведения о настройке прибора для сбора данных для MS с высоким разрешением, а также целевой список видов PA, которые были включены в настройку сбора данных, зависящих от данных (DDA).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Программный интерфейс для настройки метода DDA показан на рисунке 2C. Список молекул PA, на которые нацелен этот подход, приведен в таблице 2. Скриншот экспериментального результата в подходе DDA показан на рисунке 2D.
  2. Анализ данных при прямой инфузионной терапии МС (ДИМС)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа массовых данных, генерируемых всеми типами масс-спектрометров, требуется автоматизированная платформа анализа липидов. LipidXplorer36 — это некоммерческое программное обеспечение, которое поддерживает все типы экспериментов с липидами DIMS. С этим программным обеспечением можно ознакомиться здесь: https://www.mpi-cbg.de/research-groups/current-groups/andrej-shevchenko/projects/lipidxplorer/
    1. После того, как данные были получены с помощью методов, описанных в шаге 6.1, определите формы липидов с помощью платформы для анализа липидов, сопоставив m/z их моноизотопных пиков с соответствующими ограничениями элементного состава. Пример импорта данных показан на рисунке 3A. Установите допуск по массе 10 ppm и порог интенсивности в соответствии с уровнем шума, сообщаемым программным обеспечением масс-спектрометра.
    2. После импорта скомпилируйте запросы на языке запросов молекулярной фрагментации (MFQL) для PA на основе химической структуры PA, которая показана на рисунке 3B. На рисунке 3C показана MFQL, настроенная на платформе анализа липидов.
    3. Используя аналогичный подход, скомпилируйте MFQL для других глицерофосфолипидов в программном обеспечении платформы анализа липидов. Каждый запрос нацелен на один класс липидов, и за одно выполнение может быть использовано множество запросов.
    4. Запустите все MFQL, нажав на кнопку «Выполнить ». Все идентифицированные виды липидов представлены в едином файле результатов в формате файла .csv с указанием содержания соответствующих ионов-предшественников и/или фрагментов для последующей количественной оценки липидов. Пример вывода приведен в таблице 3.

7. Жидкостная хроматография и тандемная МС дериватизированных образцов

  1. Отделите образцы, полученные на шаге 5.4, с помощью жидкостной хроматографии с использованием сверхэффективной системы жидкостной хроматографии. Выбирая эту систему, убедитесь, что ее программное обеспечение может быть интегрировано с программным обеспечением масс-спектрометра, используемого для анализа.
  2. Подключите систему к тройному квадрупольному масс-спектрометру. Выберите столбец разделения. Для разделения липидов, отличных от PI4P и PI(4,5)P2 , выберите колонку C18 (1,0 мм x 100 мм x 1,7 мм). Для PI4P и PI(4,5)P2 выберите колонну C4 размером 300 Å (1,0 мм x 100 мм x 1,7 μм).
  3. Приготовьте подвижную фазу, содержащую формиат аммония, растворив сначала формиат аммония в воде массового сорта, а затем в органических растворителях. Ультразвуком обрабатывают все растворители, которые используются в масс-спектрометрии, в течение 20 мин для удаления пузырьков воздуха.
  4. Уравновесить колонну путем настаивания раствора А, содержащего воду + 0,1% муравьиной кислоты, и раствора В, содержащего ацетонитрил + 0,1% муравьиной кислоты.
  5. Введите элюат из системы жидкостной хроматографии (объем впрыска в диапазоне 1-20 мкл) в масс-спектрометр для анализа. Установите расход на уровне 0,1 мл/мин и температуру колонны на уровне комнатной температуры. Введите весь объем элюирования, выходящий из колонки, в масс-спектрометр.
  6. В последовательности введения образца всегда начинайте с инъекции пустого растворителя (метанола) и периодически оставляйте аккуратные стандартные образцы между биологическими образцами для проверки качества масс-спектрометрии (каждый шестой запуск).
  7. Для экспериментальной установки гибридного масс-спектрометра с тройной квадрупольной ионной ловушкой перед началом эксперимента необходимо провести калибровку масс-спектрометра в соответствии с инструкциями производителя. Для PA, PC и PI используйте ионизацию электрораспылением (ESI) для генерации ионов и работу в положительном режиме для обнаружения положительно заряженных форм липидов. Собирайте данные и анализируйте их с помощью программного обеспечения для анализа данных, установленного в системе.
  8. Оптимизируйте параметры для анализа в соответствии с соответствующим используемым внутренним стандартом. Параметры масс-спектрометра следующие: время задержки = 30 мс; CAD (диссоциация, активируемая столкновением) = 3 фунта на квадратный дюйм; GS1 (исходный газ 1) = 24 фунта на квадратный дюйм и GS2 (исходный газ 2) = 21 фунт на квадратный дюйм; CUR (газовая завеса) = 30 фунтов на квадратный дюйм; IS (напряжение ESI) = 4,5 кВ; и TEM (температура источника) = 450°C.
  9. Для PI4P и PI(4,5)P2 используйте масс-спектрометр в положительном режиме. Параметры масс-спектрометра следующие: время задержки = 65 мс; CAD (диссоциация, активируемая столкновением) = 2 psi; GS1 (исходный газ 1) и GS2 (исходный газ 2) = 20 фунтов на квадратный дюйм; CUR (газовая завеса) = 37 фунтов на квадратный дюйм; IS (напряжение ESI) = 5,2 кВ; и ПЭМ (температура источника) = 350°С.

8. Жидкостная хроматография в нормальной фазе - мониторинг множественных реакций, усиленное ионное сканирование продукта МС (NPLC-MRM-EPI MS)

  1. Хроматографические условия
    1. Используйте метод нормальной фазы LC с использованием кремнеземной колонки, которая способна отделять PA от других фосфолипидов. Используйте гексан:изопропиловый спирт:100 мМ водный NH4COOH в соотношении 68:30:2 в качестве подвижной фазы А и изопропиловый спирт:гексан:100 мМ водный NH4COOH в соотношении 70:20:10 в качестве подвижной фазы В.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта комбинация обеспечила наилучшее разделение и пиковую селективность различных молекулярных форм ПА.
    2. Используйте хроматографическое поведение эталонных соединений (внутренние стандарты) с точки зрения разрешения и формы пика, чтобы выбрать оптимальные условия.
    3. Выполняйте хроматографическое разделение на колонке с нормальным кремнеземом (1 мм x 150 мм x 3 мкм) при комнатной температуре на сверхпроизводительной колонке жидкостной хроматографии. Установите объем впрыска автосамплера на 6 μL и скорость потока элюента на 210 μL/мин.
    4. После 5 минут уравновешивания со 100% подвижной фазы А линейно увеличивайте подвижную фазу В до 30% в течение 5 минут, далее до 80% в течение 5 минут, затем до 100% в течение 5 минут и удерживайте ее постоянной на уровне 100% в течение 5 минут. Наконец, восстановите равновесие столбца в течение 9 минут.
  2. Масс-спектрометрия
    1. Используйте гибридный масс-спектрометр с тройной квадрупольной ионной ловушкой, работающий в отрицательном режиме ЭСИ. Управляйте работой системы и сбором данных с помощью предоставленного программного обеспечения для анализа. Перед началом эксперимента откалибруйте масс-спектрометр в соответствии с инструкциями производителя.
    2. Оптимизируйте параметры источника с помощью анализа впрыска потока внутренней стандартной смеси. Соответственно, установите напряжение ионного распыления = -4,5 кВ, температуру источника (TEM) = 450 °C, столкновение активированного диссоциационного газа (CAD) = 3 psi. Используйте газообразный азот в качестве газа столкновения и установите газ небулайзера (GS1) = 24 фунта на квадратный дюйм, вспомогательный газ (GS2) = 21 фунт на квадратный дюйм и газ завесы (CUR) = 30 фунтов на квадратный дюйм.
    3. Установите следующие параметры пути ионно-зависимых соединений: потенциал декластеризации (DP) = -42 В, входной потенциал (EP) = -6 В и потенциал выхода из ячейки коллизии (CXP) = -12 В, оптимизированные с помощью непрерывной инфузии внутреннего раствора стандартной смеси. Записывайте полные спектры продуктов вместе с MRM-переходами прекурсоров с переменной энергией столкновения (CE) в диапазоне от 12 эВ до 40 эВ для анализа фрагментации с помощью функции сканирования EPI, доступной в масс-спектрометре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: EPI, запускаемый MRM, на основе IDA одновременно регистрирует ион-продукт прекурсора, сканирование ионов и получение MS/MS на лету. MRM сузила диапазон сканирования ионов в квадруполе 1 (Q1), а ионная ловушка усилила количество ионных фрагментов, проходящих через Q2, тем самым значительно улучшив качественные возможности квадрупольных MS/MS, особенно для захвата всех фрагментов, возникающих из иона-предшественника. В режиме EPI в Q3 обнаруживаются множественные фрагменты-ионы, возникающие из ионов-предшественников, с лучшим соотношением сигнал/шум.
    4. Проводите эксперименты MRM с CE 39 эВ для получения высокой чувствительности. Ограничьте максимальное количество MRM до 75 и время пребывания до 30 мс, чтобы обнаружить и записать MRM любой конкретной молекулы, которая выделяется из хроматографической колонки в любое время во время прогона. Это увеличивает рабочий цикл станка.
    5. Выполните экспериментальную настройку, чтобы определить наилучшие параметры ионизации для PA, как описано выше. Для этого эксперимента установите напряжение ионного распыления = -4,5 кВ, температуру источника (TEM) = 450 °C, газ диссоциации при столкновении (CAD) = 3 psi. Используйте газообразный азот в качестве газа столкновения. Установите небулайзерный газ (GS1) = 24 фунта на квадратный дюйм, вспомогательный газ (GS2) = 21 фунт на квадратный дюйм и газ для завесы (CUR) = 30 фунтов на квадратный дюйм.
    6. Вручную изучите все данные настройки, чтобы обеспечить правильный выбор параметров ионизации и ионов продукта. При выборе продукта учитывайте минимизацию потенциальных помех между каналами MRM. Экспериментальные параметры, использованные для анализа всех молекулярных форм PA, приведены в таблице 4.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Гибридный тройной квадрупольный масс-спектрометр с линейной ионной ловушкой позволяет нам сочетать режим сканирования MRM с функцией сканирования ионной ловушки, тем самым обеспечивая быстрое и высокое сканирование с использованием таких методов, как сканирование EPI, для записи полезных тандемных масс-спектров каждого обнаруженного предшественника. В этом исследовании, чтобы идентифицировать различные молекулярные виды PA, мы использовали этот подход MS/MS на основе MRM-EPI, основанный на традиционном тройном квадрупольном ионном тракте со свойством сканирования EPI ионной ловушки, контролируемым аналитическим программным обеспечением.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Определение линейности измерений в МС. Линейность – это способность метода МС давать результаты, которые прямо пропорциональны концентрации липидного аналита. Линейность зависит от (а) ионизационной эффективности липидного аналита и (б) ионизационного поведения липидного аналита при различных концентрациях в зависимости от используемого источника ионов. В ионизации электрораспылением (ESI), которая используется в данном исследовании, линейность сохраняется при более низких концентрациях в зависимости от ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Ряд доказательств сходится в том, что сигнальные липиды играют важную роль в регуляции организации и функции фоторецепторов дрозофилы. В дополнение к хорошо изученной роли липидов в регуляции фототрансдукции3, сигнальные липиды также участвуют в транспортировке белка и субклеточной организации 23,30,39,40,41.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Работа, описанная в данной рукописи, была поддержана Департаментом атомной энергии правительства Индии (Project Identification No. RTI 4006), Департамент биотехнологии правительства Индии (BT/PR4833/MED/30/744/2012) и старший стипендиат Индийского альянса (IA/S/14/2/501540) для PR. Мы благодарим Центр масс-спектрометрии NCBS, особенно доктора Дхананджая Шинде и сотрудников PR-лаборатории за их вклад в разработку этих методов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,1 Н метанольная гидрохлоридная кислотаДля полной изоляции липидов
0,88% KClSigma AldrichP9541Для полной изоляции липидов
1,5 мл / 2 мл LoBind Eppendorf tubesEppendorf,022431081/022431102Для полной изоляции липидов
2.3.18 16:0/18:1 Diether PEAvanti полярные липиды999974Внутренний стандарт липидов
37% чистых HClSigma Aldrich320331Для полного выделения липидов
96-луночный планшетАнализ на общий органический фосфат
АцетонFisher Scientific32005Для вскрытия
Анализ молибдатаОбщий органический фосфат
Анализ аскорбиновой кислотыОбщий органический фосфат
Ультразвуковойаппарат для ванны
Колонна BEH300 C18 [1,0 мм x 100 мм x 1,7 мм]Waters India Pvt. Ltd.186002352LC
Держатель лезвияFine Scientific Tools10052-11Для вскрытия
инкубатор БПКАнализ на общий органический фосфат
Ломающиеся лезвияFine Scientific Tools10050-00Для вскрытия
Масляная бумагаGE healthcare10347671Для вскрытия
C4, 300 A0, [1.7 μ м х1 мм х 100 мм] колоннаWaters India Pvt. Ltd.186004623
LC хроматография флаконы янтарного цвета стеклянные флаконы со вставкамиMerck27083-U
d18:1/17:0)Avanti полярные липиды860517Lipid Internal Standard
d5-Phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate [PI(3,5)P2]-16:0/16:0Avanti полярные липиды850172Lipid Internal
Standard Препарирующие микроскопыOlympusSZ51Для рассечения
Ванна с сухим жаром.
Элюент АГексан:Изопропиловый спирт:100 мМ водный ацетат аммония (68:30:2) , для ЖК
Элюент ВГексан:Изопропиловый спирт:100 мМ водный ацетат аммония (70:20:10), для ЖК
Фильтровальная бумагаIndica-HM274039Для вскрытия
КолбыБоросилДля вскрытия
Мухи NANARaghu Padinjat lab
Fly foodNANANCBS lab кухня, состав: кукурузная мука 80 г/л, D-глюкоза 20 г/л, сахароза 40 г/л, агар 8 г/л, экстракт дрожжей 15 г/л, пропионовая кислота 4 мл, TEGO (метилпарагидроксибензоат) 0,7 г/л, ортофосфорная кислота 0,6 мл)
ЩипцыFine Scientific Tools11254-20Для вскрытия
вытяжного шкафа
ВоронкаБоросилДля рассечения
ледяной уксусной кислотойFisher ScientificA35-500Для дериватизации
Стеклянные бутылки: прозрачные и янтарного цветаДля полной изоляции липидов
Высокотемпературные бесфосфатные стеклянные трубки.Анализ на общий органический фосфат
Гомогенизационные пробирки с шарикамиДля выделения общего липида
ГомогенизаторPrecellys
Увлажненный CO2 подключенный к подушечкамдля мух Для толкания мух
Инкубаторы с подсветкойPanasonic SanyoMIR-553Для мух
выращивание Исходная органическая смесьметанол:хлороформ (2:1), Для полного выделения липидов
Хлороформ марки LC-MS SigmaAldrich650498Для полного выделения липидов
Метанол марки LC-MSSigma Aldrich34860Для полного выделения липидов
Вода класса LC-MS SigmaAldrich34877Для полной изоляции липидов
Light измерительHTC instrumentsLX-103
Наконечники с низким удержаниемEppendorf0030072006/72014/72022/72030Для полной изоляции липидов
LTQ Orbitrap XL инструментThermo Fisher Scientific, Бремен, Германия
Лизофосфатидная кислота (LPA) - 13:0Avanti полярные липидыLM-1700Липидный внутренний стандарт
Лизофосфатидная кислота (LPA) - 17:1Avanti полярные липидыLM 1701Внутренний липидный стандарт
лизофосфатидилхолин (LPC) -13:0Avanti полярные липидыLM-1600Внутренний липидный стандарт
лизофосфатидилхолин (LPC) -17:1Avanti полярные липиды855677Внутренний липидный стандарт
лизофосфатидилхолин (LPC) - 19:0Avanti полярные липиды855776Внутренний стандарт
хлорная кислота.Общий органический фосфат
Фосфат стандартный дигидрофосфатОбщий органический фосфат
Фосфатный буферный раствор (PBS)NAСостав: 137mMNaCl, 2,7mM KCl, 10 mM Na2HPO4 и 1,8 мМ KH2PO4, pH 7,4
Фосфатидная кислота (PA) - 12:0/13:0Avanti полярные липиды, LM-1400  Внутренние липиды Стандартная
фосфатидная кислота (PA) - 17:0/14:1Avanti полярные липидыLM-1404Внутренние липиды Внутренняя стандартная
фосфатидная кислота (PA) -(17:0/17:0)Avanti полярные липиды830856Внутренняя липидная
стандартная фосфатидная кислота (PA) -16:0-D31/18:1Avanti полярные липиды860453Внутренний липидный стандартный
фосфатидилхолин (PC) -12:0/13:0Avanti полярные липидыLM-1000Внутренний липидный стандартный
фосфатидилхолин (PC) - 17:0/14:1Avanti полярные липидыLM-1004Внутренний липидный
стандартный фосфатидилэтаноламин (PE) - 17:0/14:1Avanti полярные липидыLM-110Внутренний липидный стандартный
фосфатидилинозитол (PI) - 17:0/14:1Avanti полярные липидыLM-1504Внутренний стандарт липидов
Фосфатидилинозитол 4,5-бисфосфат [PI(4,5)P2)]-17:0/20:4Avanti полярные липидыLM-1904Липидный внутренний стандартный
фосфат фосфатидилинозитол 4-фосфат (PI4P) - 17:0/20:4Avanti полярные липидыLM-1901Липидный внутренний стандартный роботизированный
нанопоточный ионный источникTriVersa NanoMate (Advion BioSciences, Итака, Нью-Йорк, США)
Rotospin инструмент Tarsons3090X
СиликоновыеДля препарирования
растворителем А0,1% муравьиной кислоты в воде, для ЖК
растворителем В0,1% муравьиной кислоты в ацетонитриле, для ЛК
Настольная центрифуга
Термомиксер
ТМС-диазометанAcrosAC385330050Для дериватизации
Тройной квадрупольный масс-спектрометрAB SciexQTRAP 6500
UPLC системаWaters Acquity
Вакуумный центробежный концентраторScanvac , Labogene
Vortex машина
аммония оксида циркония липидов калия прокладки

Ссылки

  1. Hardie, R. C. C., Raghu, P. Visual transduction in Drosophila. Nature. 413 (6852), 186-193 (2001).
  2. Raghu, P., Yadav, S., Mallampati, N. B. N. Lipid signaling in Drosophila photoreceptors. Biochimica et Biophysica Acta. 1821 (8), 1154-1165 (2012).
  3. Hardie, R. C. TRP channels and lipids: from Drosophila to mammalian physiology. The Journal of Physiology. 578 (1), 9-24 (2007).
  4. Fuchs, B., Süss, R., Teuber, K., Eibisch, M., Schiller, J. Lipid analysis by thin-layer chromatography--a review of the current state. Journal of Chromatography. A. 1218 (19), 2754-2774 (2011).
  5. Tang, B., Row, K. Development of gas chromatography analysis of fatty acids in marine organisms. Journal of Chromatographic Science. 51 (7), 599-607 (2013).
  6. Kinsey, C., et al. Determination of lipid content and stability in lipid nanoparticles using ultra high-performance liquid chromatography in combination with a Corona Charged Aerosol Detector. Electrophoresis. , (2021).
  7. Gandhi, A. S., Budac, D., Khayrullina, T., Staal, R., Chandrasena, G. Quantitative analysis of lipids: a higher-throughput LC-MS/MS-based method and its comparison to ELISA. Future Science OA. 3 (1), 157(2017).
  8. Ouldamer, L., et al. NMR-based lipidomic approach to evaluate controlled dietary intake of lipids in adipose tissue of a rat mammary tumor model. Journal of Proteome Research. 15 (3), 868-878 (2016).
  9. Li, L., et al. Mass spectrometry methodology in lipid analysis. International Journal of Molecular Sciences. 15 (6), 10492-10507 (2014).
  10. Welti, R., Wang, X. Lipid species profiling: a high-throughput approach to identify lipid compositional changes and determine the function of genes involved in lipid metabolism and signaling. Current Opinion in Plant Biology. 7 (3), 337-344 (2004).
  11. Köfeler, H. C., Fauland, A., Rechberger, G. N., Trötzmüller, M. Mass spectrometry based lipidomics: an overview of technological platforms. Metabolites. 2 (1), 19-38 (2012).
  12. Schwudke, D., Liebisch, G., Herzog, R., Schmitz, F., Shevchenko, A. Shotgun lipidomics by tandem mass spectrometry under data-dependent acquisition control. Methods in Enzymology. 433, 175-191 (2007).
  13. Ejsing, C., et al. Automated identification and quantification of glycerophospholipid molecular species by multiple precursor ion scanning. Analytical Chemistry. 78 (17), 6202-6214 (2006).
  14. Schwudke, D., et al. Top-down lipidomic screens by multivariate analysis of high-resolution survey mass spectra. Analytical Chemistry. 79 (11), 4083-4093 (2007).
  15. Carvalho, M., et al. Effects of diet and development on the Drosophila lipidome. Molecular Systems Biology. 8, 600(2012).
  16. Han, X., Gross, R. W. Global analyses of cellular lipidomes directly from crude extracts of biological samples by ESI mass spectrometry a bridge to lipidomics. Journal of Lipid Research. 44 (6), 1071-1079 (2003).
  17. Schwudke, D., et al. Lipid profiling by multiple precursor and neutral loss scanning driven by the data-dependent acquisition. Analytical Chemistry. 78 (2), 585-595 (2006).
  18. Ejsing, C. S., et al. Global analysis of the yeast lipidome by quantitative shotgun mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2136-2141 (2009).
  19. Fauland, A., et al. A comprehensive method for lipid profiling by liquid chromatography-ion cyclotron resonance mass spectrometry. The Journal of Lipid Research. 52 (12), 2314-2322 (2011).
  20. Schuhmann, K., et al. Shotgun lipidomics on a LTQ Orbitrap mass spectrometer by successive switching between acquisition polarity modes. Journal of Mass Spectrometry. 47 (1), 96-104 (2012).
  21. Pitt, J. J. Principles and applications of liquid chromatography-mass spectrometry in clinical biochemistry. The Clinical Biochemist. Reviews. 30 (1), 19-34 (2009).
  22. Blanksby, S. J., Mitchell, T. W. Advances in mass spectrometry for lipidomics. Annual Review of Analytical Chemistry. 3 (1), Palo Alto, Calif. 433-465 (2010).
  23. Thakur, R., et al. Phospholipase D activity couples plasma membrane endocytosis with retromer dependent recycling. eLife. 5, 18515(2016).
  24. Donaldson, K. The inhalation toxicology of p-aramid fibrils. Critical Reviews in Toxicology. 39 (6), 487-500 (2009).
  25. Panda, A., et al. Functional analysis of mammalian phospholipase D enzymes. Bioscience Reports. 38 (6), (2018).
  26. Ghosh, A., Sharma, S., Shinde, D., Ramya, V., Raghu, P. A novel mass assay to measure phosphatidylinositol-5-phosphate from cells and tissues. Bioscience Reports. 39 (10), (2019).
  27. Balakrishnan, S. S., et al. Regulation of PI4P levels by PI4KIIIα during G-protein-coupled PLC signaling in Drosophila photoreceptors. Journal of Cell Science. 131 (15), (2018).
  28. Masood, M. A., Yuan, C., Acharya, J. K., Veenstra, T. D., Blonder, J. Quantitation of ceramide phosphorylethanolamines containing saturated and unsaturated sphingoid base cores. Analytical Biochemistry. 400 (2), 259-269 (2010).
  29. Acharya, U., et al. Modulating sphingolipid biosynthetic pathway rescues photoreceptor degeneration. Science. 299 (5613), New York, N.Y. 1740-1743 (2003).
  30. Hebbar, S., Schuhmann, K., Shevchenko, A., Knust, E. Hydroxylated sphingolipid biosynthesis regulates photoreceptor apical domain morphogenesis. The Journal of Cell Biology. 219 (12), (2020).
  31. Abhyankar, V., Kaduskar, B., Kamat, S. S., Deobagkar, D., Ratnaparkhi, G. S. Drosophila DNA/RNA methyltransferase contributes to robust host defense in aging animals by regulating sphingolipid metabolism. The Journal of Experimental Biology. 221, Pt 22 (2018).
  32. Subramanian, M., et al. Altered lipid homeostasis in Drosophila InsP3 receptor mutants leads to obesity and hyperphagia). DMM Disease Models and Mechanisms. 6 (3), 734-744 (2013).
  33. Guan, X. L., et al. Biochemical membrane lipidomics during Drosophila development. Developmental Cell. 24 (1), 98-111 (2013).
  34. Caravaca, J. M., Lei, E. P. Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (109), e53756(2016).
  35. Fujita, S. C., Inoue, H., Yoshioka, T., Hotta, Y. Quantitative tissue isolation from Drosophila freeze-dried in acetone. TheBiochemical Journal. 243 (1), 97-104 (1987).
  36. Herzog, R., et al. LipidXplorer: a software for consensual cross-platform lipidomics. PloS One. 7 (1), 29851(2012).
  37. Itoh, Y. H., Itoh, T., Kaneko, H. Modified Bartlett assay for microscale lipid phosphorus analysis. Analytical Biochemistry. 154 (1), 200-204 (1986).
  38. Hsu, F. F., Turk, J. Charge-driven fragmentation processes in diacyl glycerophosphatidic acids upon low-energy collisional activation. A mechanistic proposal. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 11 (9), 797-803 (2000).
  39. Acharya, J. K., et al. Cell-nonautonomous function of ceramidase in photoreceptor homeostasis. Neuron. 57 (1), 69-79 (2008).
  40. Dasgupta, U., et al. Ceramide kinase regulates phospholipase C and phosphatidylinositol 4, 5, bisphosphate in phototransduction. Proceeding of the National Academy of Science of the United States of America. 106 (47), 20063-20068 (2009).
  41. Yonamine, I., et al. Sphingosine kinases and their metabolites modulate endolysosomal trafficking in photoreceptors. The Journal of Cell Biology. 192 (4), 557-567 (2011).
  42. Katz, B., Gutorov, R., Rhodes-Mordov, E., Hardie, R., Minke, B. Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (124), e55627(2017).
  43. Pak, W. L. Drosophila in vision research. The Friedenwald Lecture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 36 (12), 2340-2357 (1995).
  44. Shevchenko, A., Simons, K. Lipidomics: coming to grips with lipid diversity. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (8), 593-598 (2010).
  45. Garcia-Murillas, I., et al. lazaro encodes a lipid phosphate phosphohydrolase that regulates phosphatidylinositol turnover during Drosophila phototransduction. Neuron. 49 (4), 533-546 (2006).
  46. Raghu, P., et al. Rhabdomere biogenesis in Drosophila photoreceptors is acutely sensitive to phosphatidic acid levels. TheJournal of Cell Biology. 185 (1), 129-145 (2009).
  47. Ogiso, H., Suzuki, T., Taguchi, R. Development of a reverse-phase liquid chromatography electrospray ionization mass spectrometry method for lipidomics, improving detection of phosphatidic acid and phosphatidylserine. Analytical Biochemistry. 375 (1), 124-131 (2008).
  48. Raghupathy, R., et al. Transbilayer lipid interactions mediate nanoclustering of lipid-anchored proteins. Cell. 161 (3), 581-594 (2015).
  49. Randall, A. S., et al. Speed and sensitivity of phototransduction in Drosophila depend on degree of saturation of membrane phospholipids. The Journal of Neuroscience. 35 (6), 2731-2746 (2015).
  50. Schuhmacher, M., et al. Live-cell lipid biochemistry reveals a role of diacylglycerol side-chain composition for cellular lipid dynamics and protein affinities. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (14), 7729-7738 (2020).
  51. Raghu, P. Functional diversity in a lipidome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (21), 11191-11193 (2020).
  52. Khandelwal, N., et al. Fatty acid chain length drives lysophosphatidylserine-dependent immunological outputs. Cell Chemical Biology. 28 (8), 1169-1179 (2021).
  53. Piper, M. D. W., et al. A holidic medium for Drosophila melanogaster. Nature Methods. 11 (1), 100-105 (2014).
  54. Wang, F., et al. FlyVar: a database for genetic variation in Drosophila melanogaster. Database: The Journal of Biological Databases and Curation. 2015, (2015).
  55. Hammond, G. R. V., Balla, T. Polyphosphoinositide binding domains: Key to inositol lipid biology. Biochimica et Biophysica Acta. 1851 (6), 746-758 (2015).
  56. Chakrabarti, P., et al. A dPIP5K dependent pool of phosphatidylinositol 4,5 bisphosphate (PIP2) is required for G-protein coupled signal transduction in Drosophila photoreceptors. PLoS Genetics. 11 (1), 1004948(2015).
  57. Hardie, R. C., Liu, C. -H., Randall, A. S., Sengupta, S. In vivo tracking of phosphoinositides in Drosophila photoreceptors. Journal of Cell Science. 128 (23), 4328-4340 (2015).
  58. Yadav, S., Garner, K., Georgiev, P., Li, M., Gomez-espinosa, E. RDGB, a PI-PA transfer protein regulates G-protein coupled PtdIns (4, 5)P2 signalling during Drosophila phototransduction. Journal of Cell Science. 128 (17), 3330-3344 (2015).
  59. Unsihuay, D., Mesa Sanchez, D., Laskin, L. Quantitative Mass Spectrometry Imaging of Biological Systems. Annual Review of Physical Chemistry. 72, 307-329 (2021).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Фосфолипаза C бетагидролиз PI(45)P2каналы TRPканалы TRPLколичественное определение липидовмолекулярная генетикасенсорная трансдукция

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.