Рутинный сбор наборов крио-ЭМ данных высокого разрешения с использованием просвечивающего электронного микроскопа 200 кВ

Краткое содержание

Крио-ЭМ карты макромолекул с высоким разрешением также могут быть получены с помощью микроскопов TEM 200 кВ. Этот протокол демонстрирует лучшие практики для установки точных оптических выравниваний, схем сбора данных и выбора областей изображения, которые необходимы для успешного сбора наборов данных высокого разрешения с использованием ТЕА 200 кВ.

Аннотация

Криоэлектронная микроскопия (крио-ЭМ) была создана в качестве рутинного метода определения структуры белка в течение последнего десятилетия, занимая все большую долю опубликованных структурных данных. Последние достижения в области технологий и автоматизации ТЕА повысили как скорость сбора данных, так и качество получаемых изображений, одновременно снижая требуемый уровень знаний для получения крио-ЭМ-карт с разрешением ниже 3 Å. В то время как большинство таких структур с высоким разрешением были получены с использованием современных крио-ТЕА 300 кВ, структуры высокого разрешения могут быть также получены с помощью крио-ТЕА-систем 200 кВ, особенно при оснащении энергетическим фильтром. Кроме того, автоматизация выравнивания микроскопов и сбора данных с оценкой качества изображения в режиме реального времени снижает сложность системы и обеспечивает оптимальные настройки микроскопа, что приводит к увеличению выхода высококачественных изображений и общей пропускной способности сбора данных. Этот протокол демонстрирует реализацию последних технологических достижений и функций автоматизации на электронном микроскопе криопропускания 200 кВ и показывает, как собирать данные для реконструкции 3D-карт, достаточных для построения атомной модели de novo . Мы фокусируемся на лучших практиках, критических переменных и общих проблемах, которые необходимо учитывать, чтобы обеспечить рутинный сбор таких наборов крио-ЭМ с высоким разрешением. В частности, подробно рассматриваются следующие важные темы: i) автоматизация выравнивания микроскопов, ii) выбор подходящих областей для сбора данных, iii) оптимальные оптические параметры для высококачественного, высокопроизводительного сбора данных, iv) настройка энергетического фильтра для визуализации с нулевыми потерями и v) управление данными и оценка качества. Применение лучших практик и улучшение достижимого разрешения с помощью энергетического фильтра будет продемонстрировано на примере апо-ферритина, который был реконструирован до 1,6 Å, и протеасомы Thermoplasma acidophilum 20S, реконструированной до разрешения 2,1-Å с использованием ТЭМ 200 кВ, оснащенного энергетическим фильтром и прямым электронным детектором.

Введение

Определение структуры белка имеет решающее значение для понимания молекулярной архитектуры, функции и регуляции белковых комплексов, участвующих в ключевых клеточных процессах, таких как клеточный метаболизм, трансдукция сигналов или взаимодействия хозяин-патоген. Криоэлектронная микроскопия (крио-ЭМ) стала мощным методом, способным решать 3D-структуру многих белков и их комплексов, которые были слишком сложными для традиционных структурных методов, таких как рентгеновская дифракция и ЯМР-спектроскопия. В частности, крио-ЭМ был доказан как метод выбора для мембранных белков, которые не могут быть легко кристаллизованы или приготовлены в достаточных количествах для традиционных структурных методов, и обеспечил новое понимание структуры и функции важных клеточных рецепторов и ионных каналов 1,2,3,4,5 . Совсем недавно крио-ЭМ сыграл важную роль в борьбе с пандемией Covid-19, определив механизм инфекции SARS-CoV-2 на молекулярном уровне, что прояснило происхождение болезни Covid-19 и обеспечило основу для быстрой разработки эффективных вакцин и терапевтических средств 6,7,8,9,10.

Как правило, высококачественные просвечивающие электронные микроскопы 300 кВ (ТЭМ) используются для определения структуры биомолекул с высоким разрешением путем крио-ЭМ-анализа одной частицы (SPA) для выявления их конформации и взаимодействий. Недавно метод SPA достиг нового рубежа, когда общий эталонный крио-ЭМ образец апо-ферритина был реконструирован с атомным разрешением (1,2 Å)^11,12 с использованием TEM 300 кВ, оснащенного эмиссионной пушкой холодного поля (E-CFEG), прямым электронным детектором и энергетическим фильтром. При этом решении удалось однозначно разрешить положения отдельных атомов в структуре, конформацию отдельных аминокислотных боковых цепей, а также водородные связи и другие взаимодействия, которые открывают новые возможности для структурного открытия новых мишеней и оптимизации существующих лекарственных средств-кандидатов.

Микроскопы среднего класса 200 кВ TEM часто используются для скрининга образцов и оптимизации образцов перед окончательным сбором данных высокого разрешения с использованием высококачественных микроскопов TEM, особенно на крупных крио-ЭМ-объектах. Как правило, изображенные образцы могут быть разрешены в диапазоне разрешения 3-4 Å, что достаточно для перехода на высококачественную ТЕА 300 кВ для окончательного сбора данных. Следовательно, сбор данных с использованием ТЕА 200 кВ часто не оптимизируется для достижения максимально возможных результатов разрешения. Более того, многие интересные биологические вопросы уже могут быть даны и опубликованы в этих разрешениях, поскольку все аминокислотные боковые цепи уже разрешены, и заполненность сайтов связывания лигандов также может быть надежно определена¹³. Уже было показано, что ТЭМ 200 кВ могут достигать разрешений выше 3 Å для многочисленных образцов 14,15,16,17,18. Изображения, сделанные при 200 кВ, демонстрируют по своей сути более высокую контрастность изображенных частиц, что может даже способствовать более точному начальному выравниванию частиц, несмотря на более ослабленный сигнал при высоком разрешении по сравнению с изображениями TEM 300 кВ. Важно отметить, что достигнутое разрешение реконструированных крио-ЭМ карт также ограничено структурной гибкостью и конформационной неоднородностью изображений образцов, что влияет как на реконструкции 200 кВ, так и на реконструкции 300 кВ. Фактически, гораздо больше крио-ЭМ реконструкций, полученных с использованием систем 300 кВ, было решено в диапазоне разрешения 3-4 Å, чем при более высоких разрешениях¹⁹. Поскольку микроскопы TEM 200 кВ менее сложны и помещаются в меньших помещениях, эти микроскопы представляют собой хороший, более дешевый вариант определения структуры биологических макромолекул крио-ЭМ при сохранении автоматизации длинных сборов данных из нескольких образцов, хранящихся в системе автозагрузчика микроскопа.

Сбор наборов крио-ЭМ данных для определения структуры высокого разрешения требует точного выравнивания оптики микроскопа. Выравнивание колонн систематически происходит от источника электронов до системы линз конденсатора, объектива и энергетического фильтра с электронным детектором. Полная последовательность выравниваний обычно не требуется. При необходимости пользователь направляется с помощью полуавтоматических процедур с надлежащим описанием каждого шага в контекстно-зависимом окне справки на протяжении всей процедуры выравнивания в пользовательском интерфейсе микроскопа (панель управления Direct Alignments). Как только микроскоп полностью выровнен, электронная оптика остается стабильной, и выравнивания не нужно менять в течение как минимум нескольких месяцев. Только наиболее чувствительные выравнивания, такие как параллельное освещение плоскости выборки, объективный астигматизм и выравнивание без комы, должны быть уточнены непосредственно перед началом сбора каждого набора данных. Затем качество собранных данных можно контролировать во время сбора данных с помощью различных программных пакетов, таких как EPU Quality Monitor, cryoSPARC Live²⁰, Relion²¹, Scipion²², WARP²³ или Appion²⁴.

Помимо точного выравнивания микроскопа, высокое качество хорошо очищенных образцов с минимальной конформационной и композиционной гетерогенностью также является необходимым условием для сбора наборов данных высокого разрешения и решения структур высокого разрешения. Более подробную информацию о типичных протоколах, частых проблемах и возможных средствах правовой защиты можно найти в других обзорах, посвященных этой теме ^25,26,27. По сути, крайне важно найти области на заданной крио-ЭМ-сетке, которая имеет достаточно тонкий лед для сохранения информации с высоким разрешением, а отдельные частицы плотно распределены в случайных ориентациях без перекрытий. Однако типичные крио-ЭМ сетки имеют неравномерную толщину льда, и поэтому важно найти и выбрать оптимальные области для визуализации. Различные средства оценки толщины льда в сетке доступны в пакетах программного обеспечения, предназначенных для автоматизированного сбора наборов крио-ЭМ данных, таких как EPU 2, Leginon²⁸ или SerialEM²⁹.

Появление быстрых и чувствительных детекторов прямых электронов позволило собирать изображения во многих фракциях в виде фильмов, что позволило компенсировать движения, вызванные пучком, и привело к значительному увеличению качества и количества данных, используемых при обработке изображений и окончательной 3D-реконструкции³⁰. В то же время автоматизация и высокая пропускная способность сбора данных обеспечивают огромные наборы данных с тысячами изображений / фильмов, которые представляют собой проблемы для хранения данных и доступа к ним. Принятая модель с большими крио-ЭМ-объектами, обслуживающими от десятков до сотен пользователей, особенно требует организованного управления данными с надлежащим отслеживанием и обменом данными в установленных крио-ЭМ-трубопроводах^31,32.

Это исследование описывает протокол для рутинного сбора наборов крио-ЭМ высокого разрешения с использованием микроскопа Glacios TEM 200 кВ. Описаны необходимые выравнивания оптики микроскопа вместе с процедурами оценки крио-ЭМ образцов и выбора подходящих областей для сбора данных высокого разрешения. Организация собранных данных и связанных с ними метаданных с выборочной информацией демонстрируется в Athena - платформе управления данными, которая облегчает обзор выборочной информации и собранных данных. Используя образец апо-ферритина мыши, удалось достичь 3D-реконструкции с разрешением 1,6 Ź³. Используя описанный протокол, мы также реконструировали 3D-карту плотности протеасомы 20S из Thermoplasma acidophilum с разрешением 2,1 Å.

Протокол

Все этапы протокола описаны для системы 200 кВ Glacios TEM (далее именуемой TEM 200 кВ), оснащенной энергетическим фильтром Selectris-X (далее именуемым энергетическим фильтром) и детектором Falcon 4 (далее именуемым детектором прямых электронов). Этапы протокола специфичны для приложения EPU, которое является программным обеспечением для сбора SPA-данных по умолчанию, предустановленным в каждой системе Glacios. Приведенные ниже шаги протокола соответствуют версии EPU 2.14, и при использовании другой версии EPU ожидаются небольшие изменения. Предпосылками для этого протокола являются: i) выравнивание пушки и колонны хорошо выровнено, ii) калибровки ЭМ являются правильными и iii) автофункции EPU правильно откалиброваны.

1. Загрузка сеток в микроскоп

ПРИМЕЧАНИЕ: ТЭМ 200 кВ, используемая в этом эксперименте, может вмещать до 12 автосеток (т.е. обычные сетки ТЭМ, обрезанные в специальный картридж) в кассете, которая загружается внутрь автозарядчика микроскопа и постоянно поддерживается при температуре ниже -170 °C для предотвращения девитрификации образца.

1. Вставьте авторешетки в кассету автозагрузчика в условиях жидкого азота.
2. Вставьте кассету с авторешетками в переносную капсулу с жидкостным азотным охлаждением.
3. Вставьте капсулу в микроскоп и нажмите кнопку Dock в пользовательском интерфейсе микроскопа, чтобы загрузить кассету из капсулы в автозагрузчик микроскопа.
4. Нажмите на кнопку Inventory , чтобы проверить наличие автосеток в загруженной кассете.
5. Нажмите кнопки Загрузить и Выгрузить , чтобы вставить автосетки в столбец для визуализации TEM.

2. Настройка проекта в платформе управления данными (необязательно)

ПРИМЕЧАНИЕ: Выборочная информация и собранные данные могут быть организованы в предоставляемую платформу управления данными, которая позволяет хранить структурированные данные для всех подключенных инструментов. Может быть создан проект, для которого могут быть определены любые шаги рабочего процесса для упорядоченного захвата изображений и метаданных для просмотра и экспорта.

1. Запустите приложение портала управления данными и войдите в систему, используя имя пользователя и пароль.
2. В левой панели пользовательского интерфейса портала нажмите кнопку Добавить проект , чтобы создать новый проект, или нажмите кнопку существующего проекта в списке ниже, чтобы открыть проект.
3. Нажмите кнопку Добавить эксперимент , чтобы создать новый эксперимент в открытом проекте.
4. Заполните описание на панели «Метаданные » нового эксперимента и нажмите кнопку «Добавить рабочий процесс», чтобы создать новый рабочий процесс в эксперименте (например, «Анализ отдельных частиц»).
5. При необходимости нажмите кнопку Add Step на средней панели, чтобы создать пользовательский рабочий процесс или добавить дополнительные шаги к предопределенному рабочему процессу SPA (рисунок 1 и рисунок 2).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этапы могут представлять собой подготовку образца, характеристику образца методами биохимии, витрификацию образцов, скрининг крио-ЭМ-сетей, сеансы сбора данных и анализ данных.
6. При необходимости заполните описания в примечаниях к каждому шагу, которые могут включать изображения и фотографии.
7. Создайте шаг набора данных в рабочем процессе и выберите тип набора данных в качестве EPU.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это позволит аналитическому программному обеспечению автоматически размещать все данные/метаданные результатов в правильном месте на портале управления данными во время сбора данных и автоматически экспортировать данные в предпочтительное место назначения, сохраняя при этом полную запись всех этапов и передачи данных.
8. Заполните шаблоны о сетках Sample и EM на этапе Биохимия и свяжите каждую сетку с образцом (обратите внимание, что один образец может быть связан с несколькими сетками).
9. Свяжите комбинации образцов-сеток в разделе метаданных на шаге Набор данных .

3. Настройка пресетов изображений и калибровки сдвига изображения в аналитическом программном обеспечении

1. Задайте параметры изображения для отдельных режимов визуализации, как показано в таблице 1. Рекомендации по выбору конкретных параметров подробно описаны в разделе Обсуждение.
2. Установка параллельного освещения для выбранного увеличения в предустановке сбора данных аналитического программного обеспечения
   ПРИМЕЧАНИЕ: Существует только одна установка рассеивателя С2 для параллельного освещения образца при заданном размере ПЯТНА (т.е. предустановленная прочность рассеивателя С1) на 2-конденсаторных системах ТЕА, таких как ТЕА 200 кВ, используемая в настоящем исследовании. Таким образом, мощность дозы электронов на единицу площади (e^-/Ų/s) может быть отрегулирована только путем изменения настроек размера SPOT и корректировки силы C2 (интенсивности пучка) в соответствии с приведенными ниже шагами.
   1. Переместитесь в область с опорной углеродной фольгой и тонким льдом или без него.
   2. Выберите объективную диафрагму 100 мкм или 70 мкм в меню «Диафрагма» пользовательского интерфейса TEM.
   3. Нажмите кнопку Дифракция на панелях управления, чтобы переключиться в режим дифракции.
   4. Вставьте флуоресцентный экран и измените режим FluCam на высокое разрешение.
   5. Переместите центральное дифракционное пятно к краю диафрагмы. Если край диафрагмы не виден, увеличьте длину камеры (с помощью ручки увеличения).
   6. Осторожно поверните ручку фокусировки на панели управления, чтобы сфокусировать заднюю фокальную плоскость. Задняя фокальная плоскость фокусируется, когда край диафрагмы заметно острый.
   7. Уменьшите чувствительность FluCam до самого низкого уровня и переместите центральное дифракционное пятно в центр FluCam.
   8. Сведите к минимуму размер центрального пятна с помощью ручки интенсивности на панели управления.
   9. Уберите объективную диафрагму в пользовательском интерфейсе TEM и вернитесь в режим обработки изображений.
   10. Нажмите кнопку «Получить » в аналитическом программном обеспечении, чтобы сохранить настройки в стиле «Сбор данных».
3. Отрегулируйте мощность дозы электронов в предустановке Data Acquisition, оптимальной для используемого детектора:
   1. Перемещение в пустую область в сетке (например, квадрат сетки со сломанной углеродной фольгой)
   2. Нажмите кнопку «Измерить дозу» в аналитическом программном обеспечении, чтобы измерить мощность дозы электронов.
   3. Измените размер SPOT для достижения оптимальной мощности дозы. В случае прямого электронного детектора, используемого в этом протоколе, для сбора данных с высоким разрешением обычно используется мощность дозы 4-5 e^-/pixel/s. Обычно это соответствует размеру SPOT 4-6.
   4. Проверьте и отрегулируйте параллельную подсветку при новой настройке размера SPOT, как описано выше.
   5. Выберите опцию EER в разделе Фракции, чтобы использовать режим EER на прямом электронном детекторе³³.
   6. Нажмите кнопку «Получить » в аналитическом программном обеспечении, чтобы сохранить настройки в предустановке «Сбор данных».
   7. Переключитесь на предустановку автофокусировки и нажмите кнопку Получить , чтобы сохранить настройки подсветки для фокусировки. Вручную измените время экспозиции на 1 с и режим биннинга 2.
   8. Переключитесь на предустановку Thon Rings и нажмите кнопку Get , чтобы сохранить настройки освещения для этого пресета. Вручную измените время экспозиции до 1-2 с и режим биннинга 2.
   9. Переключитесь на предустановку Zero Loss и нажмите кнопку Get , чтобы сохранить настройки подсветки для этого пресета. Вручную измените время экспозиции до 0,5 с и режим биннинга 4.
4. Калибровка сдвигов изображения между заданными оптическими настройками, как описано в руководстве по программному обеспечению для анализа, с помощью задачи «Калибровка сдвига изображения » на вкладке «Подготовка» (дополнительный рисунок 1).

Таблица 1: Типичные настройки изображения для сбора данных с высоким разрешением с использованием крио-ТЭМ 200 кВ, оснащенного энергетическим фильтром и прямым электронным детектором. Настройки показаны для каждого оптического пресета, используемого при настройке автоматизированного сбора данных (раздел 3 Протокола). Эти настройки специфичны для микроскопа ТЕА 200 кВ и прямого электронного детектора, используемого в этом исследовании. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

4. Картирование сетки и выбор лучших крио-ЭМ сеток для сбора данных

1. Выберите вкладку Atlas и нажмите кнопку New Session (Новый сеанс ), чтобы открыть новый сеанс.
2. Заполните такие сведения, как имя сеанса и место хранения данных, и нажмите кнопку Применить , чтобы открыть новое окно задачи скрининга , в котором отображается список всех сеток в инвентаре автозагрузчика. При необходимости измените имена сеток.
3. Выберите интересующие сетки, установив флажок рядом с соответствующим номером сетки.
4. Нажмите кнопку Пуск , чтобы начать полностью автоматизированную коллекцию атласов всех выбранных сеток.
5. Когда коллекция будет завершена, нажмите на метки сетки, чтобы просмотреть приобретенные атласы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Отдельные квадраты сетки классифицируются в соответствии с их относительной толщиной льда, которая основана на оценке относительного значения оттенков серого в каждом атласе. Классифицированные квадраты сетки изображены в различных цветовых схемах, которые можно использовать для руководства выбором областей сбора данных. Сетка, изготовленная с помощью Vitrobot Mk IV, обычно отображает градиент толщины льда по всей сетке, что может помочь определить идеальную толщину льда для сбора данных. Оптимальная сетка должна содержать как можно меньше переносного загрязнения льдом и иметь достаточное количество непрерывных и свободных от трещин квадратов сетки (рисунок 3). Сетки с подходящим распределением льда могут быть дополнительно исследованы для оценки распределения частиц во льду при большом увеличении (т.е. плотности и ориентации отдельных частиц).
6. Нажмите кнопку Загрузить образец в верхнем меню, чтобы вставить выбранную сетку с подходящим распределением льда в столбец микроскопа.
7. Выберите вкладку Атлас , щелкните правой кнопкой мыши подходящий квадрат сетки на изображении атласа и выберите опцию Переместить этап сюда из раскрывающегося меню, чтобы переместить этап в квадрат сетки.
8. Перейдите на вкладку Автофункции , чтобы задать квадрат сетки на высоту Эйцентрика. Переключитесь на предустановку Eucentric Height , нажмите на автофункцию Auto-Eucentric by Beam Tilt в середине выбранного квадрата сетки и нажмите кнопку Пуск .
9. Переключитесь на предустановку «Квадрат сетки » и получите изображение. Переместите сцену в отверстие со льдом и без или с минимальным загрязнением щелчком правой кнопки мыши и опцией Переместить сцену сюда .
10. Переключитесь на предустановленную высоту отверстия/эйцентрика и получите изображение. Переместите рабочую область в область углерода рядом с интересующим отверстием щелчком правой кнопкой мыши и параметром «Переместить этап сюда ».
11. Нажмите на функцию автофокусировки и установите значения для требуемой расфокусировки на 0 мкм и итерации на -2 мкм. Переключитесь на предустановку автофокусировки и нажмите кнопку Пуск .
12. Снова выберите вкладку Подготовка и переключитесь на предустановку Отверстие/Эйцентрическая высота . На ранее полученном изображении отверстия выберите интересующую область внутри отверстия и переместите сцену в это положение, щелкнув правой кнопкой мыши и выбрав опцию Переместить этап сюда .
13. Переключитесь на предустановленную настройку «Сбор данных» и установите время ожидания после смещения луча на 0,5 с, а время ожидания после этапа — на 20 с. Получение изображения с использованием расфокусировки от -3 мкм до -5 мкм для повышения контрастности низкого разрешения для лучшей визуализации отдельных частиц.
14. При необходимости повторите шаги 4.7-4.13 для получения изображения частиц в разных отверстиях и различных квадратах сетки с различной толщиной льда.
15. После определения и выбора наиболее подходящей сетки для сбора данных с высоким разрешением нажмите кнопку Загрузить образец в верхнем меню, чтобы загрузить выбранную сетку в ТЕА.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, если требуется дополнительная информация и/или требуется автоматизация этого процесса отбора, выполните раздел 5.

5. Настройка сеанса сбора данных в программном обеспечении для анализа отдельных частиц

ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании сеток из золотой фольги уточнение объективного астигматизма и выравнивания комы (раздел 6) может не работать надежно. Рекомендуется загрузить сетку из углеродной фольги или сетку с поперечной решеткой и выполнить эти окончательные выравнивания перед настройкой сбора данных.

1. Выберите вкладку EPU и нажмите кнопку Создание сеанса , чтобы создать новый сеанс в левой панели. Выберите параметр «Новый сеанс», чтобы использовать текущие оптические пресеты, или параметр «Создать из настроек» для загрузки ранее экспортированных настроек сеанса.
2. Введите имя сеанса и место хранения данных.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это расположение будет использоваться для сохранения интегрированных изображений и метаданных из сеанса сбора данных во вложенной папке с именем сеанса. Хотя эти данные не будут занимать значительный объем места для хранения, рекомендуется сохранять эти данные в хранилище данных разгрузки Falcon на сервере DMP, поскольку кадры камеры EER всегда хранятся в корневом каталоге этого хранилища данных в каталоге с именем сеанса.
3. Выберите ручной тип сеанса, чтобы иметь контроль над выбором отдельных отверстий в квадратах сетки, выбранных для сбора данных позже в протоколе.
4. Выберите режим более быстрой съемки, чтобы использовать сдвиг изображения без аберрации (AFIS) для сбора данных, чтобы уменьшить перемещения ступеней между отдельными отверстиями, уменьшить общий дрейф выборки и увеличить пропускную способность сбора данных без ухудшения качества изображения.
5. Выберите формат mrc по умолчанию для сохраненных интегрированных изображений.
6. Укажите используемую сетку и ее тип. Этот протокол использовал R-1.2/1.3 UltraAufoil для апо-ферритина и сетку R-2/1 Quantifoil для протеасомы 20S. Выберите Quantifoil в разделе Носитель образца и R1.2/1.3 или 2/1 в разделе Quantifoil Type.
7. НЕОБЯЗАТЕЛЬНО: Нажмите кнопку Athena Login в правом нижнем углу, чтобы использовать EPU Quality Monitor (EQM).
   1. Введите данные для входа во всплывающее окно браузера, чтобы активировать раздел настроек в обзоре настройки сеанса .
   2. Нажмите кнопку Выбрать в разделе настроек и найдите ранее созданный набор данных (раздел 2 протокола), чтобы связать его с текущим сбором данных. Установите флажок Включить монитор качества .
8. Нажмите кнопку Применить , чтобы создать новый сеанс.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это действие откроет новые задачи в меню левого столбца. В любой момент во время сеанса, если некоторые детали неверны, можно вернуться к задаче «Настройка сеанса», изменить/обновить детали и снова нажать « Применить», чтобы обновить сеанс.
9. Выберите задачу «Выделение квадрата» на левой панели, чтобы отобразить собранный атлас сетки.
10. При желании дважды щелкните по любой плитке атласа, чтобы увидеть изображение более высокого качества, чтобы лучше судить о качестве льда в квадратах сетки. Дважды щелкните еще раз по изображению, чтобы вернуться к атласу сетки.
11. Определите квадраты сетки со следующими характеристиками (рисунок 4): (i) Опорная фольга в квадрате сетки неповреждена без повреждений, (ii) стекловидный тонкий лед в фольгированных отверстиях (отверстия кажутся ярче, чем опорная углеродная фольга), (iii) Как можно меньше загрязнения кристаллическим льдом (черные пятнышки) в квадрате сетки, (iv) Минимальный градиент яркости по всему квадрату сетки и в пределах отдельных отверстий фольги.
    ПРИМЕЧАНИЕ: С выбранными предустановками и с хорошей сеткой крио-ТЭМ 200 кВ, используемый в этом исследовании, может отображать со скоростью ~ 200-300 фильмов / ч. Имея это в виду, выберите столько квадратов, сколько необходимо, или добавьте больше позже, вернувшись к задаче выбора квадрата в соответствии с количеством доступного времени микроскопа. Для справки, было собрано 3000 фильмов для достижения разрешения 1,6 Å апо-ферритина.
12. Выбор квадратов сетки для сбора данных либо в полном атласе, либо в высококачественных изображениях плиток
    1. Щелкните правой кнопкой мыши интересующий квадрат сетки и выберите опцию Выбрать в контекстном меню
    2. Кроме того, удерживайте клавишу Ctrl на клавиатуре и щелкните левой кнопкой мыши нужные квадраты сетки
    3. И наоборот, щелкните правой кнопкой мыши и отмените или удерживайте клавишу Shift , а затем щелкните левой кнопкой мыши, чтобы удалить квадраты.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги имеют решающее значение для обеспечения того, чтобы сбор данных привел к реконструкции с высоким разрешением. Начните выделение отверстий в квадратной сетке с тонким слоем льда. Щелкните правой кнопкой мыши этот квадрат сетки и выберите опцию Выбрать отверстия , чтобы начать задачу «Выделение отверстий ».
13. Выберите задачу «Выделение отверстий» на левой панели, чтобы выделить отверстия в выделенных квадратах сетки.
14. Нажмите кнопку Auto-Eucentric , чтобы автоматически перейти к первому выбранному квадрату сетки, отрегулировать высоту Eucentric и получить квадратное изображение сетки для поиска отверстий в фольге.
15. Нажмите кнопку «Найти отверстия», чтобы найти отверстия в фольге на изображении.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если поиск отверстий не сработал (т.е. на изображении есть либо пропущенные отверстия, либо отверстия неправильного размера), проверьте, что в записи Quantifoil Type задачи «Настройка сеанса» были введены правильные значения, и снова найдите отверстия. Если отверстия все еще не найдены правильно, нажмите кнопку «Измерить размер отверстия», чтобы вручную установить диаметр и расстояние отверстий и снова найти отверстия.
16. Нажмите кнопку «Удалить отверстия» рядом с кнопкой панели сетки, чтобы отменить выделение отверстий рядом с полосами сетки.
17. Отрегулируйте пределы яркости в гистограмме фильтра Ice (в правом нижнем углу окна программного обеспечения), чтобы удалить все отверстия со слишком толстым льдом (используя левую предельную линию), а также все пустые отверстия (с помощью правой предельной линии), как показано на рисунке 4.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для уточнения конкретные значения интенсивности также могут быть введены в соответствующие текстовые поля рядом с кнопкой Применить .
18. При необходимости используйте кисть выделения для уточнения выбора отверстий вручную: щелкните левой кнопкой мыши и перетащите кисть, чтобы отменить выделение ненужных отверстий. Удерживайте клавишу Ctrl и щелкните левой кнопкой мыши, чтобы повторно выбрать отверстия в фольге. Удерживайте клавишу Shift и прокрутите колесиком мыши, чтобы настроить размер кисти.
19. Выберите отверстие для установки и тестирования шаблона сбора данных, который будет многократно использоваться во время сбора данных: щелкните правой кнопкой мыши отверстие в квадратном изображении сетки и выберите опцию Переместить этап в местоположение.
20. Выберите задачу «Определение шаблона » на левой панели.
21. Выберите предустановку «Отверстие/Эйцентрик » и нажмите кнопку « Получить », чтобы получить изображение.
22. Нажмите кнопку «Найти и центрировать отверстие», чтобы отцентрировать отверстие на изображении.
23. Установите значения для параметра Задержка после сдвига изображения равным 0,5 с (по умолчанию) и Задержка после сдвига этапа равным 20 с.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку диаметр параллельного пучка зафиксирован на крио-ТЭМ-системе 200 кВ, используемой в данном исследовании, и обычно соответствует 1,6-1,7 мкм с диафрагмой 50 мкм, только 1 изображение может быть получено на отверстие с использованием сеток R-1.2/1.3 и 2 изображения на отверстие (почти противоположные края) с использованием сеток R-2/1 или R-2/2. Обратите внимание, что размер заданных площадей захвата на экране не соответствует фактическому диаметру луча. Шкала масштаба изображения может быть использована для оценки соответствующего расстояния размещения.
24. Нажмите кнопку «Добавить область сбора» и нажмите на изображение, чтобы выбрать место в центрированном отверстии, откуда будет получено изображение с высоким увеличением.
25. Нажмите кнопку «Добавить область автофокусировки» и нажмите на изображение, чтобы выбрать место на опорной фольге рядом с центрированным отверстием, где будет выполняться автофокусировка изображения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Размер луча для фокусировки составляет 1,6-1,7 мкм и должен быть расположен на равном расстоянии от соседних отверстий на углероде.
26. Нажмите на зеленую область сбора, чтобы задать последовательность значений расфокусировки в списке расфокусировки в верхней части окна программного обеспечения. Сначала введите наибольшую расфокусировку, чтобы улучшить визуализацию частиц в тестовом запуске следующей задачи «Выполнение шаблона ».
27. Нажмите на синюю область автофокусировки, чтобы установить настройки автофокусировки в той же области:
    1. Выберите параметр После центрирования для автофокусировки в начале каждого кластера AFIS.
    2. Выберите опцию Объектив для более быстрой автофокусировки и уменьшенного дрейфа ступени.
28. Выберите задачу Выполнение шаблона и нажмите на кнопку Выполнить.
    1. Соблюдайте отдельные этапы процедуры сбора данных (центрирование отверстия, автофокусировка в выбранной области и получение изображения в заданных областях) и проверяйте качество изображенных частиц в конечном изображении с высоким увеличением.
    2. Нажмите кнопку FFT в правом нижнем углу окна изображения с большим увеличением, чтобы проверить изображение FFT и визуально оценить, показывают ли кольца Thon несколько колебаний и распространяются ли они на высокое разрешение на изображении FFT.
29. Если выполнение шаблона завершено успешно, нажмите кнопку «Подготовить все квадраты» в задаче «Выбор отверстий », чтобы сбор данных автоматически устанавливался во всех других выбранных квадратах сетки в соответствии с используемыми настройками в этом первом квадрате сетки.

6. Окончательное выравнивание микроскопа перед началом сбора данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения наилучших результатов с высоким разрешением наиболее чувствительные выравнивания должны выполняться точно в тех же настройках, что и режим сбора данных в программном обеспечении для сбора данных, и непосредственно перед началом фактического сбора данных. Эти выравнивания должны быть выполнены в положении с тонким опорным углеродом сетки, достаточно удаленном от любых стержней сетки, и выровнены по эйцентрической высоте.

1. Выберите задачу «Выполнение шаблона », получите новое изображение и перейдите со сценой в чистую область на углеродной фольге щелчком правой кнопкой мыши и выберите пункт меню «Переместить этап сюда».
2. Выберите вкладку Автоматические функции и установите для параметра Требуемая расфокусировка значение 0 мкм, а для параметра Итерация - -2 мкм. Переключитесь на предустановку автофокусировки и нажмите кнопку Пуск , чтобы запустить функцию автофокусировки.
3. Опустите флуоресцентный экран вниз и откройте меню Прямые выравнивания в пользовательском интерфейсе TEM.
4. Для достижения наилучших результатов опытные пользователи могут проверить выравнивание точек разворота: выберите задачу nP Beam Tilt pp X в меню «Прямое выравнивание » и максимально перекрывайте отскакивающие лучи с помощью многофункциональных ручек на панелях управления. Повторите это для задачи np Beam Tilt pp Y .
5. Нажмите кнопку EF в меню камеры с флуоресцентным экраном, чтобы отобразить зеленый круг, указывающий на входную апертуру фильтра энергии, и центрировать луч над зеленым кругом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что турбонасос остановлен перед продолжением; вибрации от него уменьшают количество видимых тональных колец и часто приводят к сбою автоматических функций.
6. Вернитесь в окно программного обеспечения и выберите вкладку Автофункции в строке меню.
7. Выберите задачу Autostigmate , переключитесь на стиль Thon Ring и нажмите кнопку Пуск . Наблюдайте за процессом, чтобы убедиться, что (i) сделанные изображения сделаны на углероде, (ii) кольца Тон хорошо видны и (iii) рассчитанное соответствие CTF (пунктирные линии) хорошо расположены в минимумах тон-кольца (дополнительный рисунок 2).
8. Выберите задачу Автокома и нажмите кнопку Пуск . Понаблюдайте за процессом, чтобы убедиться, что сделанные изображения сделаны на углероде и что кольца Тона хорошо видны, а рассчитанные припадки (пунктирные линии) хорошо расположены в минимумах тон-кольца. Увеличьте масштаб каждого изображения тон-кольца с помощью колеса прокрутки мыши (дополнительный рисунок 3).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если микроскоп оснащен энергетическим фильтром, настройка энергетического фильтра должна выполняться как часть последовательности выравнивания, чтобы центрировать щель фильтра до пика с нулевыми потерями и исправить любые искажения в призме энергетического фильтра (шаги 6.9-6.14). Эти выравнивания должны быть выполнены в пустой области сетки, например, внутри сломанного квадрата сетки.
9. Откройте пользовательский интерфейс Sherpa и выберите приложение Energy Filter (дополнительный рисунок 4).
10. Установите для камеры значение EF-Falcon, bin 4x, время экспозиции 0,2 с в окне настроек .
11. Нажмите кнопку «Центр » в опции «Нулевые потери », чтобы центрировать щель фильтра энергии с нулевыми потерями.
12. Нажмите на кнопку Tune в опции Isochromaticity (Дополнительный рисунок 4).
13. Нажмите на Tune Увеличение и Настройка Искажений в опции Геометрические и Хроматические Искажения (Дополнительный Рисунок 5, Дополнительный Рисунок 6)
14. Если результаты не соответствуют указанным спецификациям и отображаются красным цветом в выходном отчете, повторите выравнивания из шага 6.11 еще раз.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя прямая ссылка на усиление детектора электронов может быть стабильной в течение нескольких месяцев, новая ссылка на усиление должна быть получена с помощью диспетчера контрольных изображений Falcon 4 , если изображения пустых областей не показывают равномерную интенсивность, но демонстрируют полосы или другие отличительные особенности. Кроме того, можно вычислить быстрое преобразование Фурье (FFT) такого изображения и убедиться, что линии не видны.
15. В окне программного обеспечения выберите вкладку Подготовка и переключитесь на пресет Сбор данных .
16. Установите для параметра дозы значение 40 e^-/Ų и нажмите кнопку Измерить мощность дозы .
17. Перейдите на вкладку EPU , выберите задачу Автоматическое получение и при необходимости проверьте функцию Auto Zero Loss ; нажмите кнопку Начать запуск , чтобы начать полностью автоматизированный сбор данных.

7. Мониторинг и оптимизация качества данных при сборе данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Пока продолжается сбор данных, собранные данные можно отслеживать с помощью EQM через портал управления данными. EQM выполняет коррекцию движения и определение CTF на лету и отображает результаты на портале. Затем пользователь может судить о качестве отдельных приобретений, просматривать графики по различным показателям качества, отфильтровывать нежелательные приобретения и экспортировать данные в их окончательное хранилище либо на лету, либо в виде пакетного задания.

1. Перейдите к набору данных, в который программное обеспечение для анализа помещает данные с помощью веб-браузера.
2. В обзоре набора данных карты сбора отображают информацию о коррекции движения и определении CTF в графическом формате. Нажмите на отдельные карты, чтобы получить дополнительную информацию.
3. Включите панель DataViz для отображения агрегированных графиков из полного набора данных, которые показывают расфокусировку, астигматизм и диапазон достоверности CTF на одно приобретение (дополнительный рисунок 7).
4. Используйте фильтры в верхней части панели, чтобы выбрать только те данные, которые находятся в требуемом диапазоне расфокусировки, имеют астигматизм, близкий к нулю, и CTF может быть определен до указанного (целевого) разрешения. После настройки фильтров нажмите кнопку Применить , чтобы отобразить только выбранные данные в окне обзора набора данных.
5. Когда большинство полученных изображений находятся в пределах заданных критериев, пусть сеанс сбора данных продолжится до завершения. Если только очень небольшая часть полученных изображений соответствует заданным критериям, либо перенастройте параметры программного обеспечения для анализа, перейдите в другую область на образце (нажмите кнопку Next Grid Square в аналитическом программном обеспечении) или остановите сбор данных.

Результаты

Портал управления данными обеспечивает эффективное структурированное хранение собранных изображений, данных и метаданных из нескольких экспериментальных рабочих процессов на единой программной платформе. Каждый определенный эксперимент в созданном проекте состоит из рабочего процесса с заданными заказчиком шагами для сбора образцовой информации, собранных данных и связанных метаданных без каких-либо ограничений, чтобы обеспечить максимальную гибкость и удобство использования для любых возможных экспериментов и всех вариантов использования (рисунок 1, рисунок 2). Портал управления данными также имеет функциональность лабораторной заметки для иллюстрации этапов рабочего процесса, включая обработку изображений с промежуточными результатами, которые могут быть все вместе связаны с проектом и предоставлять как можно более полную запись для анализа и создания отчетов и публикаций.

Рисунок 1: Пример возможной организации данных и метаданных в платформе управления данными. Каждый проект может состоять из нескольких экспериментов, таких как крио-ЭМ или масс-спектроскопия (т.е. этап протокола 2.3). Каждый эксперимент может включать в себя несколько пользовательских рабочих процессов (например, шаг протокола 2.5), каждый из которых состоит из нескольких настраиваемых шагов (например, шаг протокола 2.7). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Просмотр открытого рабочего процесса проекта в платформе управления данными. На рисунке показаны метаданные и заметки, связанные с открытым шагом в рабочем процессе. Левая панель со значками обеспечивает быстрый доступ к различным опциям и меню платформы управления данными. Левая панель содержит список сохраненных рабочих процессов (показан только один сохраненный рабочий процесс «Exp2_ApoF_EFTEM_Grid7») и синюю кнопку для добавления нового рабочего процесса. Центральная панель показывает отдельные шаги в открытом рабочем процессе, как показано для рабочего процесса SPA здесь. Синяя кнопка в правом верхнем углу может добавить дополнительный шаг к открытому рабочему процессу. Правая панель содержит место для записанных метаданных или пользовательских примечаний рабочего процесса, которые могут включать текст, таблицы и изображения. Доступны различные параметры форматирования текста. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Крио-ЭМ сетки, изготовленные с помощью традиционных устройств погружной заморозки, таких как Vitrobot, обычно отображают градиент толщины льда над поверхностью сетки. Некоторые сетки также могут быть повреждены (согнуты) после ручного обращения и /или обрезания в кольцевой носитель с авторешеткой. На рисунке 3 показаны примеры различных сеток, как показано в обзоре атласа. Сетки с толстым льдом или повреждениями должны быть исключены из дальнейшего исследования.

Рисунок 3: Галерея различных сеток, как показано в обзоре Атласа. (A) Плохая сетка с толстым льдом, (B) изогнутая сетка с плохим льдом и ледяным загрязнением, (C) приемлемая сетка с хорошим градиентом льда, (D) типичная сетка с хорошим тонким льдом и небольшим градиентом льда. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Выбор квадратов сетки без повреждений и оптимальной толщины льда имеет решающее значение для сбора наборов данных с высоким разрешением. Толщина льда может варьироваться даже на уровне отдельных квадратов сетки, и поэтому важно выбирать из каждого выбранного квадрата сетки только отверстия с оптимально тонким льдом. На рисунке 4 показан подходящий квадрат сетки с неповрежденной фольгой и тонким льдом в центре. Показанный квадрат сетки хорош для установки фильтра для автоматического выбора отверстий с тонким льдом во всех выбранных квадратах сетки, поскольку он содержит диапазон различной толщины льда, а также пустые отверстия без льда, что чрезвычайно полезно для установки соответствующего диапазона интенсивности в ледяном фильтре в задаче выбора скважины.

Рисунок 4: Пример квадрата сетки с градиентом толщины льда, из пустых квадратов сетки в центре и толстого льда возле полос сетки. Фильтр качества льда может быть использован для выбора диапазона интенсивностей внутри отверстий с идеальной толщиной льда, которые соответственно выбираются в квадрате сетки (отверстия с зеленым наложением). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Результаты бенчмарка с использованием описанного протокола были получены с использованием образца мышиного апо-ферритина (апоФ) из группы Киккавы¹¹. ApoF представляет собой очень α-спиральный белок, который образует очень стабильную октаэдрическую клетку. Высокая стабильность и высокая симметрия делают apoF оптимальным образцом для крио-ЭМ-визуализации и обработки изображений с высоким разрешением. Таким образом, ApoF стал стандартным образцом для оценки производительности крио-ЭМ приборов 11,12,13. Замороженную аликвоту, содержащую 15 мг/мл очищенного образца апоФ, размораживали на льду и осветляли центрифугированием при 10 000 х г в течение 10 мин. Супернатант разбавляли до 5 мг/мл с 20 мМ HEPES pH 7,5, 150 мМ NaCl. 3 мкл разбавленного образца наносили на тлеющие разряженные R-1.2/1.3, 300 сетчатые золотые решетки в течение 30 с. Затем сетки промокли на 5 с перед погружением-замораживанием в жидкий этан, охлажденный жидким азотом. Погружная заморозка проводилась с использованием полностью автоматизированной системы витрификации при 100% влажности и 4 °C. Все решетки были обрезаны в авторешетки и загружены в Крио-ТЭМ 200 кВ. Было собрано около 3000 фильмов с пропускной способностью 300 фильмов в час. Данные обрабатывались с использованием методов, описанных¹¹, со следующими модификациями: i) вместо Relion 3.1 использовалась версия Relion 3.1, ii) автоматизированный отбор частиц осуществлялся с использованием средних значений 2D-класса предыдущих реконструкций apoF в качестве ссылок, и iii) исходная 3D-модель была сгенерирована из предыдущей реконструкции apoF с низким разрешением до 15-Å. Группировка оптики не была выполнена для этого набора данных, поскольку было доказано, что используемая процедура³⁴ AFIS эффективно и надежно минимизирует фазовые сдвиги, вызванные наклоном луча, которые не ограничивают качество данных, для реконструкции 3D-карт с указанными разрешениями. 3D-доработка после байесовской полировки и уточнение CTF привели к отображению карты с разрешением 1,68 Å. Разрешение было дополнительно улучшено с помощью коррекции сферы Эвальда, в результате чего карта разрешения 1,63 Å. Обзор параметров сбора и обработки данных показан в таблице 2, а окончательная реконструированная карта плотности показана на рисунке 5, а кривая корреляции фурье shell (FSC) показана на дополнительном рисунке 8.

Таблица 2: Параметры сбора данных и обработки изображений, используемые для 3D-реконструкции апоферритина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Рисунок 5: Крио-ЭМ реконструкция апо-ферритина. (Левая панель) 3D-рендеринг реконструированной крио-ЭМ карты апоФ с разрешением 1,6 Å. (Правая панель) Детальный вид реконструированной карты на уровне отдельных аминокислотных боковых цепей. Плотность аминокислотных боковых цепей хорошо разрешена, и атомная модель может быть однозначно построена в рамках этой карты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Эффекты и преимущества использования энергетического фильтра в SPA-реконструкциях оценивали с использованием прокариотической протеасомы 20S, выделенной из T. acidophilum. Прокариотическая протеасома 20S также использовалась в качестве стандартного крио-ЭМ-образца, поскольку она представляет собой стабильное каталитическое ядро протеасомного комплекса с симметрией D7. Сетки готовили путем добавления 4,5 мкл очищенного образца протеасомы T. acidophilum 20S на тлеющую разряженную 200-ячеистую медную сетку R2/1. Образцы остекливали в жидкой смеси этан/пропан с использованием полностью автоматизированной системы витрификации, установленной на 4 °C и 100% влажности с силой пятна 20 и временем пятнистости 4,5 с.

Три различных набора данных были собраны из одной и той же крио-ЭМ сетки с аналогичными квадратами сетки с использованием разной ширины щели энергетического фильтра в следующем порядке: i) щель полностью открыта (без щели), ii) щель 20 эВ и iii) щель 10 эВ. Квадраты сетки были выбраны с помощью фильтра качества льда в аналитическом программном обеспечении. Все остальные параметры сбора и обработки данных остались прежними. Наборы данных собирали в течение 15 ч с общим количеством 4000 фильмов и обрабатывали с использованием методов, описанных¹¹ , с использованием Relion 3.1 с модификацией, что алгоритм отбора частиц Лапласиана Гаусса использовался для получения начальных средних значений 2D-класса для выборки частиц на основе эталонов из полных наборов данных. Такое же количество (102 200) случайно выбранных частиц было выбрано и использовано для окончательной итерации и 3D-реконструкции каждого набора данных. Переменные обработки данных описаны в таблице (таблица 3) ниже для получения окончательной реконструированной карты плотности ЭМ, показанной на рисунке 6 , с кривой FSC, показанной на дополнительном рисунке 9. Группировка оптики и коррекция сферы Эвальда также не были выполнены для этих наборов данных.

Таблица 3: Параметры сбора данных и обработки изображений, используемые для 3D-реконструкции протеасомы T. acidophilum 20S. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Таблица 4: Сводка достигнутого разрешения и В-фактора для крио-ЭМ реконструкций протеасомы T. acidophilum 20S с использованием наборов данных с различной шириной энергетической щели. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Рисунок 6: Влияние фильтрации энергии на крио-ЭМ изображения. (А) Крио-ЭМ изображения при различных значениях расфокусировки, собранные с щелью 10 эВ или без нее. (B) Обзор крио-ЭМ карты протеасом 20S с сегментированными субъединицами. (C) Масштабирование карты протеасом 20S с установленной атомной моделью. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный рисунок 1: Задача калибровки сдвигов изображения (желтый эллипс) для выравнивания сдвигов изображения между различными оптическими пресетами (красными эллипсами) в аналитическом программном обеспечении с использованием кристалла шестиугольного льда, который виден в полном диапазоне увеличения от 100x до 165 000x. (Вверху) Калибровка между предустановками «Сбор данных» и «Высота отверстий/эвцентриков», (средняя) калибровка между предустановками «Высота отверстия/эвцентрика» и «Квадрат сетки», (внизу) калибровка между предустановками «Квадрат сетки» и «Атлас». Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 2: Функция autostigmate в аналитическом программном обеспечении (желтый эллипс). (Изображение слева) Полученное изображение. (Правое изображение) Передача Фурье полученного изображения, показывающего концентрические кольца Тона и их соответствие CTF, показанное в радиальных пучках. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 3: Пользовательский интерфейс функции Autocoma в аналитическом программном обеспечении (желтый эллипс) для выравнивания комы. На панели изображений показаны изображения передачи Фурье, полученные при различных наклонах луча, и их соответствия CTF, которые используются для расчета комы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 4: Пользовательский интерфейс настройки энергетического фильтра. Пример хорошего отчета о настройке изохромности энергетического фильтра со всеми параметрами (показан зеленым текстом) в спецификациях. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 5: Пользовательский интерфейс настройки энергетического фильтра. Пример хорошего отчета о настройке искажений увеличения энергетического фильтра со всеми параметрами (показан зеленым текстом) в спецификациях. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 6: Пользовательский интерфейс настройки энергетического фильтра. Пример хорошей настройки хроматических искажений энергетического фильтра со всеми параметрами (показанными зеленым текстом) в рамках спецификаций. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 7: Панель DataViz монитора качества EPU с обзором качества данных в собранном наборе данных крио-ЭМ. Графики с агрегированными данными из всех собранных изображений / фильмов показывают значения (точечные графики) и распределение (гистограммы) выбранных критических показателей качества, таких как достоверность соответствия CTF (синий), расфокус (оранжевый) и астигматизм (зеленый). Подмножество собранных изображений/фильмов можно выбрать, установив фильтры параметров в верхней части панели DataViz. После применения фильтров выбранные изображения/фильмы могут быть экспортированы для дальнейшей обработки в другой пакет обработки изображений, такой как Relion или CryoSpark. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 8: Кривая FSC окончательной реконструкции apoF до разрешения 1,6 Å, как сообщает Relion 4-beta. Синяя кривая показывает FSC замаскированных 3D-карт из двух независимо уточненных 3D-реконструкций из двух взаимоисключающих полунаборов данных. Согласно золотому стандарту FSC на уровне 0,143, разрешение окончательной 3D-карты, реконструированной из полного набора данных, соответствует 1,6 Å. Оранжевая кривая показывает FSC замаскированных 3D-реконструкций с рандомизированными фазами. Быстрое падение кривой FSC указывает на то, что используемая маска не способствовала наблюдаемому FSC исходных реконструированных карт (синяя кривая) сверх разрешения ~2 Å. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 9: Кривые FSC окончательной реконструкции протеасомы T. acidophilum 20S с использованием различной ширины щели энергетического фильтра, как сообщается в Relion 3.1. Синие кривые показывают FSC маскированных 3D-карт из двух независимо уточненных реконструкций из двух полусетов данных каждого набора данных соответственно. Золотой стандарт FSC в 0,143 указывает на достигнутые разрешения окончательных 3D-карт, реконструированных из соответствующих полных наборов данных (разрешение 2,3 Å, 2,2 Å и 2,1 Å соответственно). Красные кривые показывают FSC маскированных карт с рандомизированными фазами. Быстрое падение красных кривых FSC указывает на то, что используемая маска не способствовала FSC исходных реконструированных карт сверх разрешения ~3 Å. Зеленые кривые показывают FSC незамаскированных 3D-карт, которые находятся под влиянием шума во всем реконструированном 3D-объеме и, следовательно, падают раньше, чем FSC замаскированных 3D-карт. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Наличие данных: Карты плотности крио-ЭМ были депонированы в банке данных ЭМ под номерами присоединения: апоферритин: EMD 14173, EMPIAR-10973. Протеасома 20S: EMD 14467, EMPIAR-10976.

Обсуждение

Описанный протокол предполагает, что оптика используемого микроскопа ТЭМ находится в хорошо выровненном состоянии. Для ТЕА 200 кВ, используемой в настоящем Протоколе, такие выравнивания колонн выполняются, проверяются и сохраняются опытным сервисным инженером после установки микроскопа или любого значительного сервисного вмешательства. Эти настройки выравнивания можно вспомнить в любое время в пользовательском интерфейсе микроскопа. Пользователи могут использовать процедуры прямого выравнивания в пользовательском интерфейсе микроскопа для повторной настройки критических параметров. Некоторые выравнивания, такие как наклон пистолета и сдвиг пистолета, стабильны и не нуждаются в ежедневной регулировке пользователями. Проверка и повторное выравнивание (при необходимости) наклона и сдвига пистолета супервайзером микроскопа рекомендуется два раза в год. С другой стороны, некоторые выравнивания имеют решающее значение и должны быть выровнены перед каждым сбором данных, как описано в протоколе выше (например, объективный астигматизм и выравнивание без комы). Если функция Автокома в аналитическом программном обеспечении не сходится, следует проверить и отрегулировать выравнивание точек поворота наклона луча и/или центра вращения, а также подтвердить правильное центрирование диафрагмы С2. После этого должна быть запущена функция Autostigmate, поскольку объективные стигматоры также используются для коррекции комы. Эти выравнивания должны быть итерированы до тех пор, пока Autostigmate и Autocomafunctions не преуспеют в своей первой итерации. При необходимости может быть выбрана другая область (например, поддержка углеродной фольги без льда), корректировка расфокусировки изображения или увеличение времени получения изображения для оптимизации отношения сигнал/шум на полученных изображениях и видимости нескольких колец Тона в преобразовании Фурье полученных изображений.

Современные крио-ЭМ микроскопы генерируют огромные объемы данных, которые часто превышают 1 ТБ на набор данных для достижения 3D-реконструкций с высоким разрешением, особенно для белков с низкой симметрией. Крио-ЭМ данные и результаты также обычно дополняются данными и результатами ортогональных методов для полного понимания структурно-функциональных отношений в каждом научном проекте. Организация собранных данных, их передача в конвейер обработки изображений и совместное использование полученной крио-ЭМ-реконструкции между сотрудниками предъявляют дополнительные требования к новым последователям методологии крио-ЭМ для создания своей локальной ИТ-инфраструктуры. Программное обеспечение для управления данными, такое как Athena, облегчает централизованное хранение данных, полученных любым подключенным инструментом или программным обеспечением, управляемым зарегистрированным пользователем. Сохраненные данные и метаданные доступны с помощью простого интерфейса веб-браузера нескольким пользователям, которые могут иметь разные роли в проекте с различными правами доступа (в качестве владельца, соавтора или зрителя) на основе их учетных данных для входа и определения совместного использования данных в настройке эксперимента. Такая оцифровка экспериментальных рабочих процессов обеспечивает средства для обмена данными и метаданными между сотрудниками без ненужного дублирования и повышает производительность и прослеживаемость используемых рабочих процессов. Реализация общей и настраиваемой структуры проектов, экспериментов и рабочих процессов в программном обеспечении для управления данными является универсальной и позволяет настраивать и интегрировать ортогональные эксперименты с использованием дополнительных методов в единую базу данных проекта.

Выбор областей для сбора данных в крио-ЭМ-сетке имеет решающее значение для успешного получения наборов данных с высоким разрешением. Крио-ЭМ сетки, изготовленные с помощью традиционных устройств погружной заморозки, таких как Vitrobot (полностью автоматизированная система витрификации), обычно отображают градиент толщины льда над поверхностью сетки (рисунок 4). Это может быть полезно, поскольку сетка содержит участки с различной толщиной льда; однако районы с идеальной толщиной льда для сбора данных должны быть идентифицированы, как описано в протоколе выше. Оптимальная крио-ЭМ сетка должна содержать как можно меньше переносного загрязнения льдом и содержать достаточное количество квадратов сетки с неповрежденной дырявой опорной фольгой. Сбор данных о квадратах сетки, имеющих трещины или разбитые участки, не рекомендуется, так как на собранные изображения повлияет значительно более сильный общий дрейф при освещении электронным пучком по сравнению с квадратами сетки с неповрежденной опорной фольгой. Избыток кристаллического льда может перекрыть большинство отверстий в фольге и / или помешать автофокусировке, и таких квадратов сетки также следует избегать. Квадраты сетки с тонким льдом обычно демонстрируют большие участки стекловидного тела и множество ярких фольгированных отверстий, которые видны на изображении, сделанном с использованием предустановки Atlas. Появление более толстого льда вблизи стержней сетки является ожидаемым и некритическим, поскольку фольгированные отверстия в этих областях квадрата сетки исключаются во время процедуры выбора отверстий. Наличие нескольких пустых отверстий в квадрате сетки может означать, что стекловидный лед в окружающих отверстиях чрезвычайно тонкий и может содержать поврежденные частицы или вообще не содержать частиц. Как правило, разумно выбирать квадраты сетки с различной толщиной льда в разных регионах сетки для первоначального скрининга и оценки, чтобы понять, какие районы имеют наилучшие условия для сбора данных с высоким разрешением и продемонстрировать идеальную плотность частиц и распределение ориентации. Для образцов протеасом apoF и 20S, используемых в этом исследовании, области с самым тонким наблюдаемым льдом содержат наилучшие условия для визуализации этих образцов с высоким разрешением.

При автоматическом выборе отверстий во всех выбранных квадратах сетки с помощью программного обеспечения для сбора данных рекомендуется выполнить задачу выполнения шаблона на репрезентативном отверстии в каждом квадрате сетки, чтобы проверить и убедиться, что для сбора данных не были выбраны ни чрезмерно толстые, ни чрезмерно тонкие, ни неожиданно нестеклевидные квадраты. Во время сбора данных ключевые показатели качества собранных изображений, такие как дрейф изображения и подгонка CTF, могут контролироваться с помощью EQM. Затем сбор данных можно оптимизировать, пропуская области, которые дают изображения низкого качества. Тем не менее, изображения с высоким разрешением CTF могут по-прежнему содержать изображения с частицами в нескольких предпочтительных ориентациях или частицами, денатурированными в слишком тонком слое льда. Выбор частиц в режиме реального времени и 2D-классификация по собранным изображениям предоставят дополнительную информацию о качестве структурных данных в изображенных частицах и выявят как предпочтительные ориентации неповрежденных частиц во льду, так и непоследовательную структуру (частично) денатурированных частиц. Таким образом, расчет средних классов может помочь в дальнейшем уточнении соответствующих регионов для сбора данных, как это уже было реализовано и показано в других пакетах программного обеспечения^23,28.

Выбор параметров визуализации для сбора данных, таких как увеличение, мощность дозы электронов и диапазон расфокусировки, зависит от нескольких критериев, таких как целевое разрешение, размер белка, концентрация образца, желаемая пропускная способность микроскопа и т. Д. Для камеры с прямым детектором электронов, используемой в этих экспериментах, мощность дозы электронов была выбрана в диапазоне 4-5 e^-/pix/s путем выбора соответствующего размера и интенсивности SPOT для поддержания параллельного освещения. Как показано в таблице 1, в предустановленной установке Hole/Eucentric Height может быть использован другой размер SPOT для обеспечения достаточного отношения сигнал/шум на изображении для центрирования отверстий во время сбора данных. Увеличение должно быть выбрано таким образом, чтобы размер пикселя был по крайней мере в 2-3 раза меньше целевого разрешения для крио-ЭМ реконструкции. Однако, чем большее увеличение (т. Е. Меньший размер пикселя) используется, тем меньшее поле зрения захватывается на изображениях, и на изображении меньше частиц, что в конечном итоге приводит к увеличению времени сбора данных для сбора изображений с достаточным количеством частиц для реконструкции 3D-карт с высоким разрешением. Для образца apoF мы использовали размер пикселя 0,43 Å, так как у нас была достаточная концентрация образца для высокой плотности частиц на изображениях и направленное разрешение реконструкции ниже 2 Å. Для образца протеасомы 20S мы использовали размер пикселя 0,68 Å, чтобы покрыть большее поле зрения на полученных изображениях. Обычно для микроскопов ТЭМ 200 кВ крио-ЭМ изображения получаются в диапазоне расфокусировки от 0,8 до 2,0 мкм. Однако благодаря улучшенной контрастности и соотношению сигнал/шум с использованием энергетического фильтра сбор данных может быть выполнен гораздо ближе к фокусировке, чтобы лучше сохранить информацию с высоким разрешением в полученных изображениях из-за меньших аберраций и, соответственно, уменьшенного распада функции оболочки CTF. Мы также не используем объективную диафрагму, так как диафрагма может привести к дополнительным аберрациям изображения, в то время как контрастность изображения уже достаточно усилена с помощью энергетического фильтра. Для образцов протеасом apoF и 20S мы использовали настройки расфокусировки 0,5 мкм, 0,7 мкм и 0,9 мкм. Для небольших белков (<200 кДа) мы использовали настройки расфокусировки -0,5 мкм, -0,7 мкм и -0,9 мкм для улучшения контрастности частиц и облегчения отбора частиц и начального грубого выравнивания на этапе 3D-уточнения 3D-реконструкции, что привело к 3D-картам с разрешением ~ 2,5 Å (неопубликованные результаты).

Мы уже показали, что визуализация с помощью энергетического фильтра улучшает отношение сигнал/шум (SNR) в крио-ЭМ-изображениях, собранных на высококлассных микроскопах 300 кВ TEM¹¹. Фактически, когда электроны проходят через образец, происходят два основных типа взаимодействий: i) Упруго рассеянные электроны сохраняют свою энергию и способствуют образованию изображения путем интерференции с нерассредоточенным падающим пучком через фазово-контрастный механизм ii) неэластично рассеянные электроны теряют некоторую энергию в образце и способствуют в основном шуму на изображениях. Таким образом, SNR может быть значительно улучшен путем фильтрации неэластично рассеянных электронов, которые имеют более низкую энергию, чем падающий пучок и упруго рассеянные электроны, используя узкую энергетическую щель. Тем не менее, крайне важно использовать достаточно стабильный энергетический фильтр, такой как Selectris или Selectris-X, чтобы иметь возможность использовать очень узкие (10 эВ или меньше) щели в течение длительного (более 12 часов) автоматического сбора данных наборов данных криоЭМ с высоким разрешением.

Крио-ЭМ-изображения, полученные с помощью микроскопов TEM 200 кВ в тех же условиях, что и с микроскопами TEM 300 кВ, демонстрируют меньший SNR при высоком разрешении (особенно <4 Å) из-за более быстрого распада функций оболочки CTF. Следовательно, для достижения определенного разрешения при использовании ТЭМ 200 кВ требуется большее количество частиц (и, следовательно, большее количество собранных изображений). Кроме того, глубина резкости (10-25 нм в диапазоне разрешения 2-3 Å) также примерно на 20% меньше на изображениях³⁵ 200 кВ, что означает, что меньшее количество частиц в слое льда (обычно толщиной 20-50 нм) будет полностью в фокусе и конструктивно способствовать всем особенностям высокого разрешения расчетной 3D-реконструкции, если значения расфокусировки не будут уточнены для каждой частицы независимо на более поздних этапах процедуры 3D-реконструкции. Для более крупных частиц (таких как икосаэдрические вирионы или другие макромолекулярные сборки) размер частиц может превышать глубину резкости при высоком разрешении и вносить фазовые погрешности из-за планарного приближения сферы Эвальда в стандартных алгоритмах 3D-реконструкции³⁶. Эти ошибки могут быть исправлены передовыми алгоритмами, которые уже реализованы в обычных крио-EM пакетах обработки изображений 37,28,39. Поскольку сфера Эвальда имеет большую кривизну в данных 200 кВ, чем в данных 300 кВ, коррекция сферы Эвальда необходима при относительно более низких разрешениях и/или для относительно меньших макромолекулярных сборок при использовании ТЭМ 200 кВ. С другой стороны, изображения 200 кВ демонстрируют более высокую контрастность частиц в тонком льду (20-50 нм), что значительно тоньше, чем средний свободный путь электрона 200-300 кэВ (220-280 нм). Более высокая контрастность помогает улучшить правильное глобальное выравнивание отдельных частиц, особенно для слабого рассеяния меньших белков, структура которых еще не известна, а эталонная 3D-модель еще не установлена.

Здесь мы продемонстрировали на примере протеасомы 20S, что контрастность и качество изображения могут быть аналогичным образом улучшены с помощью энергетического фильтра при использовании микроскопа TEM 200 кВ. Используя то же количество частиц, данные, собранные с использованием щели 20 эВ, были реконструированы до разрешения 2,26 Å по сравнению с данными, собранными с помощью полностью открытой энергетической щели, которая была реконструирована только до разрешения 2,34 Å. Наилучшая реконструкция была достигнута на основе данных, собранных с использованием щели 10 эВ, которая была реконструирована до разрешения 2,14 Å. Эти результаты согласуются с теоретическим предсказанием о том, что фильтрация неэластично рассеянных электронов увеличивает SNR в собранных изображениях и способствует более высокому разрешению в крио-ЭМ реконструкциях из заданного числа частиц, как показано в таблице 4. Эти результаты были дополнительно подтверждены B-факторами, рассчитанными на основе этих наборов данных, которые указывают на более высокое качество изображений в наборах данных с фильтрацией энергии.

Таким образом, мы можем заключить, что в то время как микроскопы 300 кВ TEM обеспечивают высочайшую пропускную способность и максимально возможное разрешение при криоэм-реконструкциях, микроскопы TEM 200 кВ также обеспечивают высококачественные наборы данных для крио-ЭМ реконструкций высокого разрешения. Здесь мы показали, что качество полученных изображений и, следовательно, общее время до структуры могут быть дополнительно улучшены с помощью ТЭМ 200 кВ, оснащенного энергетическим фильтром и прямым электронным детектором. Представленный протокол описывает все необходимые шаги по регулярному получению крио-ЭМ данных высокого разрешения с использованием этой установки и раскрывает тонкие структурные детали макромолекулярных 3D-структур, которые необходимы для понимания ключевых структурно-функциональных отношений в структурной биологии и структурно-ориентированном проектировании лекарств.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Кольца AutoGrid	Thermo Fisher Scientific	1036173	Пакет из 100x колец AutoGrid для стандартных электромагнитных сеток.
C-Clip	Thermo Fisher Scientific	1036171	Упаковка из 100 зажимов, которые фиксируют стандартные электромагнитные решетки <> внутри колец AutoGrid.
Платформа управления данными	Thermo Fisher Scientific	1160939	Входит в базовую конфигурацию Glacios; включает в себя программное обеспечение Athena
Quality Monitor EPU	Thermo Fisher Scientific	1179770
программное обеспечение EPU	Thermo Fisher Scientific	1025080	Часть базовой конфигурации Glacios
Ethane 3.5	Westfalen	A06010110	Газ этан, используемый для производства жидкого этана (чистота не менее N35, т.е. 99,95% об.)
Falcon 4 200 кВ	Thermo Fisher Scientific	1166936	Детектор прямых электронов
Glacios	Thermo Fisher Scientific	1149551	200 кВ TEM
GloQube Plus Система тлеющего разряда для TEM Grids и модификации поверхности	Quorum	N/A	также доступен через Thermo Fisher Scientific (PN 1160602)
Сетки QuantiFoil		N/A	R-2/1, 300 меш; сетка из углеродной фольги
Relion	MRC Лаборатория молекулярной биологии	N/A	с открытым исходным кодом: https://relion.readthedocs.io/en/release-3.1/
Selectris с Falcon 4 для 200 кВ	Thermo Fisher Scientific	1191753	Энергетический фильтр
Selectris X с Falcon 4 для 200 кВ	Thermo Fisher Научно-1191755		Энергетический фильтр
UltrAuFoil решетки	Quantifoil	N/A	R-1.2/1.2, 300 меш; сетки из золотой фольги
Vitrobot Mk. IV Thermo	Fisher Scientific	1086439	Автоматизированная система остекловывания
Ватман 595 фильтровальная бумага	Thermo Fisher Scientific	AA00420S