Методическая статья

Хирургическая модель сердечной недостаточности с сохраненной фракцией выброса у тибетских минипигов

2.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/63526

⸱

18 февраля 2022 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute, 2Department of Cardiovascular Surgery, the First Affiliated Hospital, Jinan University, 3College of Veterinary Medicine, South China Agricultural University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В настоящем протоколе описана пошаговая процедура создания минипиговой модели сердечной недостаточности с сохраненной фракцией выброса с использованием сужения нисходящей аорты. Также представлены методы оценки морфологии, гистологии и функции данной модели заболевания.

Аннотация

Более половины случаев сердечной недостаточности (СН) во всем мире классифицируются как сердечная недостаточность с сохраненной фракцией выброса (СНпФВ). Модели крупных животных ограничены для изучения фундаментальных механизмов СНпФВ и определения потенциальных терапевтических мишеней. В данной работе представлено подробное описание хирургической процедуры сужения нисходящей аорты (DAC) у тибетских минипигов для создания модели HFpEF крупного животного. В этой модели использовалось точно контролируемое сужение нисходящей аорты, чтобы вызвать хроническую перегрузку давлением в левом желудочке. Эхокардиография использовалась для оценки морфологических и функциональных изменений в сердце. После 12 недель нагрузки DAC межжелудочковая перегородка была гипертрофирована, но толщина задней стенки значительно уменьшилась, что сопровождалось расширением левого желудочка. Тем не менее, фракция выброса ЛЖ у модельных сердец поддерживалась на уровне >50% в течение 12-недельного периода. Кроме того, модель DAC показала повреждение сердца, включая фиброз, воспаление и гипертрофию кардиомиоцитов. Уровни маркеров сердечной недостаточности были значительно повышены в группе DAC. Этот ДАК-индуцированный HFpEF у минипигов является мощным инструментом для изучения молекулярных механизмов этого заболевания и для доклинических испытаний.

Введение

Сердечная недостаточность с сохраненной фракцией выброса (HFpEF) составляет более половины случаев сердечной недостаточности и стала проблемой общественного здравоохраненияво всем мире1. Клинические наблюдения выявили несколько критических особенностей СНпФВ: (1) желудочковую диастолическую дисфункцию, сопровождающуюся повышением систолической ригидности, (2) нормальную фракцию выброса в покое с нарушением физической активности и (3) ремоделирование сердца2. Предложенные механизмы включают гормональную дисрегуляцию, системное микрососудистое воспаление, метаболические нарушения и аномалии в белках саркомерного и внеклеточного матрикса3. Однако экспериментальные исследования показали, что сердечная недостаточность со сниженной фракцией выброса (HFrEF) вызывает эти изменения. В клинических исследованиях изучены терапевтические эффекты ингибиторов рецепторов ангиотензина и препаратов для лечения СНрФВ при СНпФВ 4,5. Тем не менее, необходимы уникальные терапевтические подходы к лечению СНпФВ. По сравнению с пониманием клинических симптомов, изменения в патологии, биохимии и молекулярной биологии СНпФВ остаются плохо определенными.

Для изучения механизмов, диагностических маркеров и терапевтических подходов были разработаны животные модели СНпФВ. Лабораторные животные, включая свиней, собак, крыс и мышей, могут развиться СНпФВ, и в качестве факторов индукции были выбраны различные факторы риска, включая артериальную гипертензию, сахарный диабет и старение. Например, дезоксикортикостерона ацетат в отдельности или в сочетании с диетой с высоким содержанием жиров/сахара индуцирует СНпФВ у свиней 8,9. Перегрузка желудочковым давлением является еще одним методом, используемым для развития СНпФВ на моделях крупных и мелких животных10. Кроме того, в последние годы на разных континентах были приняты конкретные пороговые значения ФВ для определения СНпФВ, как видно из рекомендаций Европейского общества кардиологов, Фонда Американского колледжа кардиологов/Американской кардиологической ассоциации11, Японского общества кровообращения/Японского общества сердечной недостаточности12. Таким образом, многие ранее созданные модели могут стать подходящими для исследований СНпФВ, если будут приняты клинические критерии. Например, Youselfi et al. утверждали, что генетически модифицированная линия мышей Col4a3-/-, является эффективной моделью HFpEF. У этого штамма развились типичные сердечные симптомы HFpEF, такие как диастолическая дисфункция, митохондриальная дисфункция и ремоделирование сердца13. В предыдущем исследовании использовалась высокоэнергетическая диета для индуцирования сердечного ремоделирования со средним диапазоном ФВ у пожилых обезьян14, характеризующегося нарушением обмена веществ, фиброзом и снижением актомиозина MgATPase в миокарде. Поперечное сужение аорты у мышей (TAC) является одной из наиболее широко используемых моделей для имитации гипертоничевидной кардиомиопатии. Левый желудочек прогрессирует от концентрической гипертрофии с повышением ФВ до расширенного ремоделирования со снижением ФВ15,16. Переходные фенотипы между этими двумя типичными стадиями позволяют предположить, что техника сужения аорты может быть использована для изучения СНпФВ.

Патологические особенности, клеточная сигнализация и профили мРНК модели HFpEF свиньи были опубликованы ранее17. Здесь представлен пошаговый протокол создания этой модели и подходы к оценке фенотипов этой модели. Процедура проиллюстрирована на рисунке 1. Вкратце, план операции был составлен совместно главным исследователем, хирургами, лаборантами и персоналом по уходу за животными. Минипиги прошли медицинское обследование, включая биохимические анализы и эхокардиографию. После операции были проведены противовоспалительные и обезболивающие процедуры. Для оценки фенотипов использовали эхокардиографию, гистологическое исследование и биомаркеры.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все исследования на животных были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Гуандунского института мониторинга лабораторных животных (разрешение No 1). IACUC2017009). Все эксперименты на животных проводились в соответствии с Руководством по уходу за лабораторными животными и их использованию (8-е изд., 2011 г., Национальные академии, США). Животные содержались в учреждении, аккредитованном AAALAC, в Гуандунском институте мониторинга лабораторных животных (лицензия No 1). SYXK (YUE) 2016-0122, Китай). Для разработки модели HFpEF были использованы шесть тибетцев-минипигов (n = 3 для бутафорской группы и DAC-группы, весом 25-30 кг).

1. Подготовка животных и инструментов

  1. Акклиматизируйте животных в учреждении за 14 дней до операции.
  2. Перед операцией проведите медицинское обследование, включая биохимические анализы и эхокардиографию. Исключить животных с нарушениями структуры сердца (дилатация желудочков или гипертрофия) и функции (ФВ <50%) в соответствии с T/CALAS85-2020 Лабораторные животные - Рекомендации по оценке здоровья основных органов, таких как сердце, печень, почки и мозг крупных лабораторных животных (Китайская ассоциация лабораторных животных, Китай).
  3. Голодайте животных более 12 часов до анестезии, не кормя их в день операции.
  4. Подготовьте операционную комнату и приборы (рис. 2). Проверьте аппарат искусственной вентиляции легких, ветеринарные мониторы и мониторы пациента, ветеринарную ультразвуковую систему, аспиратор и другие хирургические устройства. Автоклавируйте ножницы, щипцы, ретракторы, ручки скальпеля, головку аспиратора, хирургические иглы и т.д. (см. Таблицу материалов).

2. Седация, интубация трахеи и канюляция вен

  1. Взвесьте животных и рассчитайте обезболивающие препараты. Вводите минипигам 1 мг/кг золетила для инъекций (тилетамин и золазепам для инъекций) и 0,5 мг/кг ксилазина гидрохлорида для инъекций (см. таблицу материалов).
  2. Пристегните и поместите минипиги в правое боковое лежачее положение на операционном столе. Включите систему отопления для поддержания температуры тела животных.
  3. Выполните эхокардиографию (шаг 5) и соберите 2 мл образцов крови.
  4. Интубируйте минипигов с помощью эндотрахеальной трубки, подключенной к ветеринарному наркозному аппарату искусственной вентиляции легких (Рисунок 3A) (см. Таблицу материалов).
  5. Начните вентиляцию легких при объеме 8 мл/кг дыхательного пространства и 30 вдохов/мин. Поддерживайте животных 1,5%-2,5% изофлурана во время хирургического вмешательства.
  6. Установите внутривенную канюляцию с помощью периферического внутривенного катетера (26 G) (см. таблицу материалов) из ушной вены (обычно краевой ушной вены, рисунок 3B).
  7. Подключите животное к ветеринарному монитору.

3. Хирургическое вмешательство

  1. Побрейте левую грудную область. Нанесите 0,7% йода и 75% спирта, чтобы асептически подготовить кожу от лопатки до диафрагмы (рисунок 3C).
  2. Наложите стерильные простыни на операционную область.
  3. Вводят пропофол (5 мг/кг) (см. таблицу материалов) внутривенно для поддержания общей анестезии.
  4. Отметьте разрез (длиной ~15 см) вдоль 4-го межреберья перед разрезом кожи с помощью электрокоагуляции.
  5. Вскрывают грудную клетку, используя комбинацию прижигания и тупого рассечения мышцы и соединительной ткани. Используйте аспиратор для удаления крови во время операции.
  6. Используйте втягивающее ребро, чтобы раздвинуть ребра (рис. 3D).
  7. Найдите грудной нисходящий сегмент аорты и определите место сужения (рис. 3E). Используйте два хирургических шва 3-0, чтобы дважды обхватить сегмент (Рисунок 3F). Поместите три слоя медицинской марли между швом и аортой, чтобы избежать повреждения тканей швами.
  8. Настройте единицы измерения давления для определения степени сужения (рис. 3F-H).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Устройство включает в себя катетер, который прокалывает стенку сосуда, соединительную трубку, датчик давления и монитор пациента.
  9. Постепенно затягивайте хирургический шов, окружающий нисходящий сегмент аорты, чтобы достичь желаемой степени сужения. Подождите, пока показания давления стабилизируются в течение 20 минут, и надолго затяните хирургические узлы.
  10. Используйте дренажную плевральную дренажную трубку для удаления воздуха и лишней жидкости из грудной полости.
  11. Послойно закрывают грудную стенку, ребра и разделенные мышцы рассасывающимися швами.
  12. Проверьте, нет ли кровотечений и обеспечьте хороший гемостаз.
  13. Нанесите флакон бензилпенициллина (800 000 единиц) (см. Таблицу материалов) на операционную область после операции.
  14. Следите за наличием моргания глаз и движения конечностей животного. Отключите аппарат искусственной вентиляции легких, но оставьте эндотрахеальную трубку. Следите за наличием спонтанного дыхания.
  15. Верните животное в комнату для содержания и дайте ему автоматически проснуться.

4. Послеоперационный уход

  1. Применяйте бензилпенициллин ежедневно в течение 1 недели (20 000 ЕД/кг).
  2. Применяют 1 мг/кг флуниксина меглумина (см. таблицу материалов) ежедневно в течение 1 недели.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Опиоидные и НПВП-анальгетики следует назначать во время и после операции.

5. Трансторакальная эхокардиография

  1. Успокойте животное 1 мг/кг золетила.
  2. Поместите животное в передвижную удерживающую установку с брезентовым чехлом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Передвижной удерживающий блок (см. Таблицу материалов) имеет четыре отверстия, предназначенные для выдвижения передних и задних конечностей животного.
  3. Побрейте левую грудь животного.
  4. Положите пальцы на левый центр грудной клетки, чтобы прощупать апикальный пульс. Нанесите ультразвуковой гель на окружающий участок.
  5. Поместите фазированный решетчатый преобразователь ультразвуковой системы (3-8 Гц) в третье межреберье. Переместите датчик в переднем или заднем направлении и отрегулируйте угол надреза.
  6. Определите предсердия, желудочки и аорту. Запишите изображения парастернальных осей B-mode и M-mode.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Изображение в В-режиме представляет собой поперечное сечение левого желудочка на уровне папиллярной мышцы, а изображение в М-режиме показывает движение левого желудочка с течением времени.
  7. Поверните головку датчика на 90° по часовой стрелке, чтобы получить парастернальный обзор с короткой осью. Определите левый желудочек, правый желудочек и папиллярную мышцу. Запись изображений в B-режиме и M-режиме.
  8. Используйте рабочую станцию, предоставленную производителем ультразвуковой системы, для оценки структуры и функции сердца.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Эхокардиография
Структуру и функцию сердца оценивали на 0, 2, 4, 6, 8, 10 и 12 неделях. Записи в В-и М-режимах парастернального изображения с короткой осью показаны на рисунке 4А. Эхокардиографическое измерение включало толщину межжелудочковой перегородки (VST), толщину задней стенки (PWT) и внутренний размер левого желудочка (LVID). VST в конце диастолы увеличивалась в сердцах с DAC, в то время как PWT при конечной диастоле увеличивалась, а затем уменьшалась в течение пе...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этом исследовании использовались методы DAC для разработки модели HFpEF для тибетских минипигов. Здесь представлен пошаговый протокол подготовки животных и инструментов, включая седацию, интубацию трахеи, канюляцию вен, хирургическое вмешательство и послеоперационный уход. Также представлены методы регистрации эхокардиографических изображений сердца в В-и М-режимах. После DAC сердце подверглось гипертрофии левого желудочка на 4-й и 6-й неделях и дилатации после 8-й недели. ФВЛЖ сохранялся в течение 12-недельного период...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана Гуандунской научно-технической программой (2008A08003, 2016A020216019, 2019A030317014), Гуанчжоуской научно-технической программой (201804010206), Национальным фондом естественных наук Китая (31672376, 81941002) и Ключевой лабораторией лабораторных животных провинции Гуандун (2017B030314171).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Рассасывающийся хирургический шовный материалPutong Jinhua Medical Co. Ltd, Китай4-0
Станция искусственной вентиляции легких AesthesiaShenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd, КитайАспиратор WATO EX-35vet
Shanghai Baojia Medical Apparatus Co., Ltd, КитайYX930D
БензилпенициллинSichuan Pharmaceutical. INC, КитайH5021738
Утилизация эндотрахеальной трубки с манжетойShenzhen Verybio Co., Ltd, Китай20 см, ID 0.9
Утилизация преобразователяGuangdong Baihe Medical Technology Co., Ltd, Китай
Диссекционное лезвиеШанхай  Медицина  Instruments (Group) Co., Ltd, China
ElectrocauteryShanghai  Hutong Medical Instruments (Group) Co., Ltd, КитайGD350-B
Иммуноферментный анализ ИФА наборCusabio Biotech Co., Ltd, КитайCSB-E08594r
EosinSigma-Aldrich Corp.E4009
Флуниксин меглуминShanghai Tongren Pharmaceutical Co., Ltd., КитайШоуяоцзы (2012)-090242103
ЩипцыШанхай  Медицина  Инструменты (Группа) Co., Ltd.,China
HematoxylinSigma-Aldrich Corp.H3136
ИзофлуранRWD Life Science Co., Ltd, КитайVeteasy для животных
Ларингоскоп TaixingSimeite Medical Apparatus and Instruments Limited Co., Ltd,Китай Для взрослых
светодиодные хирургические фонариMingtai Medical Group, КитайZF700
Считыватель микропланшетовThermo Fisher Scientific, СШАMultiskan FC
МикроскопLeica, ГерманияDM2500
Мобильный удерживающий блокИндивидуальный Н/ДМобильный удерживающий блок, изготовленный из металлической рамы и колес, с брезентовым чехлом
КислородМестные поставщики, Гуанчжоу, Китай
ПараформальдегидSigma-Aldrich Corp.
Монитор пациентаШэньчжэнь Mindray Bio-Medical Electronics Company, КитайBeneview T5
Shenzhen Yima Pet Industry Development Co., Ltd., Китай26G X 16 мм
ПропофолGuangdong Jiabo Phamaceutical Co., Ltd.
Реберный втягивающий Шанхай  Медицина  Инструменты (Группа) Co., Ltd.,China
RulerDeli  Производство  Компания, Китай
Скальпель ручки Шанхай  Медицина  Инструменты (Группа) Co., Ltd.,Китайские
ножницы (g)Шанхай  Медицина  Инструменты (Группа) Co., Ltd., China
SutureMedtronic-Coviden Corp.3-0, 4-0
Ультразвуковой гельТяньцзинь Производственный институт Сиюаньси, КитайTM-100
Ветеринарный мониторШэньчжэнь Компания Mindray Bio-Medical Electronics, КитайePM12M Vet
Ветеринарная ультразвуковая системаЭсатоэ,Италия MyLab30Оснащен датчиком с фазированной решеткой (3-8 Гц)
Введение гидрохлорида ксилазина для инъекцийShenda Animal Phamarceutical Co., Ltd., КитайШоуяоцзы (2016)-07003
Золетил для инъекцийВирбак,Франция Золетил 50тилетамин и золазепам для инъекций
V900894 Периферический внутривенный (IV) катетер H20051842

Ссылки

  1. Dunlay, S. M., Roger, V. L., Redfield, M. M. Epidemiology of heart failure with preserved ejection fraction. Nature Reviews Cardiology. 14 (10), 591-602 (2017).
  2. Redfield, M. M. Heart failure with preserved ejection fraction. New England Journal of Medicine. 375 (19), 1868-1877 (2016).
  3. Lam, C. S. P., Voors, A. A., de Boer, R. A., Solomon, S. D., van Veldhuisen, D. J. Heart failure with preserved ejection fraction: From mechanisms to therapies. European Heart Journal. 39 (30), 2780-2792 (2018).
  4. Solomon, S. D., et al. Angiotensin receptor neprilysin inhibition in heart failure with preserved ejection fraction: Rationale and design of the PARAGON-HF trial. JACC-Heart Failure. 5 (7), 471-482 (2017).
  5. Cunningham, J. W., et al. Effect of sacubitril/valsartan on biomarkers of extracellular matrix regulation in patients with HFpEF. Journal of the American College of Cardiology. 76 (5), 503-514 (2020).
  6. Conceição, G., Heinonen, I., Lourenço, A. P., Duncker, D. J., Falcão-Pires, I. Animal models of heart failure with preserved ejection fraction. Netherlands Heart Journal. 24 (4), 275-286 (2016).
  7. Noll, N. A., Lal, H., Merryman, W. D. Mouse models of heart failure with preserved or reduced ejection fraction. American Journal of Pathology. 190 (8), 1596-1608 (2020).
  8. Schwarzl, M., et al. A porcine model of hypertensive cardiomyopathy: Implications for heart failure with preserved ejection fraction. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 309 (9), 1407-1418 (2015).
  9. Reiter, U., et al. Early-stage heart failure with preserved ejection fraction in the pig: A cardiovascular magnetic resonance study. Journal of Cardiovascular Magnetic Resonance. 18 (1), 63(2016).
  10. Silva, K. A. S., et al. Tissue-specific small heat shock protein 20 activation is not associated with traditional autophagy markers in Ossabaw swine with cardiometabolic heart failure. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 319 (5), 1036-1043 (2020).
  11. Ponikowski, P., et al. 2016 ESC Guidelines for the diagnosis and treatment of acute and chronic heart failure: The Task Force for the diagnosis and treatment of acute and chronic heart failure of the European Society of Cardiology (ESC)Developed with the special contribution of the Heart Failure Association (HFA) of the ESC. European Heart Journal. 37 (27), 2129-2200 (2016).
  12. Tsutsui, H., et al. JCS 2017/JHFS 2017 guideline on diagnosis and treatment of acute and chronic heart failure - Digest version. Circulation Journal. 83 (10), 2084-2184 (2019).
  13. Yousefi, K., Dunkley, J. C., Shehadeh, L. A. A preclinical model for phenogroup 3 HFpEF. Aging (Albany NY). 11 (13), 4305-4307 (2019).
  14. Zheng, S., et al. Aged monkeys fed a high-fat/high-sugar diet recapitulate metabolic disorders and cardiac contractile dysfunction. Journal of Cardiovascular Translational Research. 14 (5), 799-815 (2021).
  15. Shirakabe, A., et al. Drp1-dependent mitochondrial autophagy plays a protective role against pressure overload-induced mitochondrial dysfunction and heart failure. Circulation. 133 (13), 1249-1263 (2016).
  16. Zhabyeyev, P., et al. Pressure-overload-induced heart failure induces a selective reduction in glucose oxidation at physiological afterload. Cardiovascular Research. 97 (4), 676-685 (2013).
  17. Tan, W., et al. A porcine model of heart failure with preserved ejection fraction induced by chronic pressure overload characterized by cardiac fibrosis and remodeling. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 677727(2021).
  18. Beznak, M. Changes in heart weight and blood pressure following aortic constriction in rats. Canadian Journal of Biochemistry and Physiology. 33 (6), 995-1002 (1955).
  19. Bikou, O., Miyashita, S., Ishikawa, K. Pig model of increased cardiac afterload induced by ascending aortic banding. Methods in Molecular Biology. 1816, 337-342 (2018).
  20. Hiemstra, J. A., et al. Chronic low-intensity exercise attenuates cardiomyocyte contractile dysfunction and impaired adrenergic responsiveness in aortic-banded mini-swine. Journal of Applied Physiology. 124 (4), 1034-1044 (2018).
  21. Massie, B. M., et al. Myocardial high-energy phosphate and substrate metabolism in swine with moderate left ventricular hypertrophy. Circulation. 91 (6), 1814-1823 (1995).
  22. Melleby, A. O., et al. A novel method for high precision aortic constriction that allows for generation of specific cardiac phenotypes in mice. Cardiovascular Research. 114 (12), 1680-1690 (2018).
  23. Charles, C. J., et al. A porcine model of heart failure with preserved ejection fraction: magnetic resonance imaging and metabolic energetics. ESC Heart Failure. 7 (1), 92-102 (2020).
  24. Olver, T. D., et al. Western, diet-fed, aortic-banded ossabaw swine: A Preclinical model of cardio-metabolic heart failure. JACC Basic to Translational Science. 4 (3), 404-421 (2019).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

I

Похожие статьи