Датчики натяжения троса для количественной оценки фактора роста, опосредованного интегрином, механики и адгезии

Краткое содержание

TGT surface - это инновационная платформа для изучения перекрестных помех фактор роста-интегрин. Гибкая конструкция зонда, специфичность лиганда адгезии и точная модуляция условий стимуляции позволяют проводить надежные количественные оценки взаимодействия EGFR-интегрин. Результаты выделяют EGFR как «механоорганизующую» механику настройки интегрина, влияющую на сборку фокальной адгезии и распространение клеток.

Аннотация

Многоклеточные организмы полагаются на взаимодействия между мембранными рецепторами и родственными лигандами в окружающем внеклеточном матриксе (ECM) для оркестровки нескольких функций, включая адгезию, пролиферацию, миграцию и дифференцировку. Механические силы могут передаваться от клетки через рецептор адгезии интегрин к лигандам в ECM. Количество и пространственная организация этих клеточных сил могут модулироваться рецепторами фактора роста, включая рецептор эпидермального фактора роста (EGFR). Инструменты, доступные в настоящее время для количественной оценки опосредованных перекрестными помехами изменений в клеточной механике и связывания их с фокальными спайками, клеточной морфологией и передачей сигналов, ограничены. Датчики молекулярной силы на основе ДНК, известные как тросы датчиков напряжения (TGT), были использованы для количественной оценки этих изменений. Зонды TGT уникальны своей способностью как модулировать базовый порог силы, так и сообщать о силах рецепторов масштаба пиконьютона по всей поверхности прилипшей клетки с дифракционным ограниченным пространственным разрешением. Используемые здесь зонды TGT основаны на необратимой диссоциации дуплекса ДНК силами рецептор-лиганд, которые генерируют флуоресцентный сигнал. Это позволяет количественно оценить кумулятивное напряжение интегрина (историю силы) клетки. В этой статье описывается протокол, использующий TGT для изучения влияния EGFR на механику интегрина и формирование адгезии. Сборка платформы механического зондирования TGT систематически детализируется, и описана процедура визуализации сил, фокальных спаек и распространения клеток. В целом, способность модулировать порог основной силы зонда, лиганд адгезии, а также тип и концентрацию фактора роста, используемого для стимуляции, делает его надежной платформой для изучения взаимодействия различных мембранных рецепторов в регуляции интегрин-опосредованных сил.

Введение

Клетки обладают внутренней способностью ощущать, генерировать и реагировать на механические силы, что приводит к изменениям клеточного фенотипа и ремоделированию местной микросреды ^1,2. Силы играют решающую роль в регулировании многих аспектов поведения клеток, включая адгезию, миграцию, пролиферацию, дифференцировку и заживление ран ^3,4. Аберрации в двунаправленном механическом обмене между клеткой и микросредой могут привести к болезненным состояниям, включая рак⁵. Многочисленные мембранные рецепторы участвуют в поддержании гомеостаза клеточного матрикса; из них интегрины и рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) имеют надежную синергию ^6,7. Классически, интегрины устанавливают механическую связь между микроокружением и внутриклеточным цитоскелетом, в то время как EGFR регулирует рост, пролиферацию и выживаемость клеток ^8,9. EGFR является высокоизученной терапевтической мишенью, ориентированной на внешнюю регуляцию, облегчающую внутриклеточную сигнализацию. Перекрестные помехи EGFR-интегрин были установлены генетически и биохимически для регулирования прогрессирования нескольких заболеваний, включая рак^10,11. Хотя исследования указывают на существование взаимодействия EGFR-интегрина, результаты объясняются сигнальными путями от плазматической мембраны 7,12,13,14. Влияние EGFR или других факторов роста на клеточную механику остается в значительной степени неисследованным отчасти из-за отсутствия инструментов для измерения клеточных сил и сигнальных результатов. Задача заключается в определении соответствующих инструментов для изучения связи между этими парадигмами параллельной сигнализации и количественной оценки их конкретного вклада в клеточную механику.

Было разработано несколько подходов для измерения сил, генерируемых рецепторами клеточной адгезии, и читатель направляется к углубленному обзору этих методов ^15,16. Короче говоря, микроскопия силы тяги и обнаружение микростолповой решетки полагаются на деформацию подстилающей подложки для вывода сил наноньютона (nN), что на порядок больше, чем отдельные рецепторные силы^17,18. Одномолекулярные методы, включая AFM и оптический пинцет, чувствительны к силам пиконьютона (pN) одного белка, но измеряют только один рецептор за раз и не предлагают хорошего (или любого) пространственного разрешения. Зонды молекулярного напряжения на основе ДНК и датчики напряжения (TGT) обеспечивают разрешение силы pN с дифракционным ограниченным (или лучшим) пространственным разрешением, что дает им уникальную роль в изучении одноклеточных сил^19,20 из различных типов клеток, включая фибробласты, раковые клетки, тромбоциты и иммунные клетки 21,22,23,24 . В то время как молекулярные зонды напряжения имеют выдвижной «пружинный» элемент, идеально подходящий для визуализации в режиме реального времени, зонды TGT необратимо разрываются, оставляя после себя флуоресцентную «историю силы». ТГТ дополнительно модулируют порог натяжения подстилающей подложки; серия зондов с аналогичным химическим составом, но различными силами разрыва или допусками на растяжение (Т-тол), может быть_{использована} для количественной оценки минимального напряжения, необходимого для формирования фокальной адгезии и распространения клеток. Зонды TGT состоят из двух комплементарных нитей ДНК, одна из которых прикреплена к поверхности, а другая представляет лиганд клетке. Если рецептор связывает лиганд и оказывает силу, большую, чем_Т-тол зонда, нити будут разделены. T_tol определяется как постоянная сила, необходимая для разрыва 50% зондов с интервалом 2 с в идеальных условиях. В «включенных» зондах TGT гаситель на верхней нити может быть отделен от флуорофора на нижней нити. Только в том случае, если зонд TGT был разорван, предположительно силами, превышающими или равными T_tol, будет генерироваться флуоресцентный сигнал. Зонды TGT также могут быть зафиксированы, что позволяет легко манипулировать биологическими системами и тестировать несколько условий. По этим причинам в этой работе использовались зонды TGT.

Зонды TGT были использованы для изучения того, как интегрин-зависимая клеточная адгезия и механические силы модулируются активированным EGFR²¹. Эта работа утвердила EGFR в качестве «механоорганизатора», настраивающего координационную адгезионную организацию и генерацию напряжения. Кроме того, было обнаружено, что стимуляция EGF влияет на распределение и зрелость очаговых спаек и усиливает распространение клеток. Этот подход может быть использован в будущих исследованиях для изучения того, как факторы роста влияют на механические силы в прогрессировании и динамике опухоли. В то время как роль перекрестных помех EGFR-интегрина в регуляции эпителиального в мезенхимальный переход установлена, роль механических сил в этом процессе остается недостаточно изученной¹⁰.

Здесь представлен подробный протокол для этих экспериментов, охватывающий синтез и сборку 56 pN TGT зондов, генерацию поверхностей TGT на стеклянных крышках, нанесение клеток Cos-7 на поверхность TGT и стимуляцию eGF, фиксацию и окрашивание клеток фаллоидином, а также анти-паксиллиновое антитело, визуализацию полной внутренней флуоресценции внутреннего отражения высокого разрешения (TIRF) и интерференционной контрастной микроскопии отражения (RICM), и количественная оценка изображений. Этот протокол, хотя и написан для исследования стимуляции EGF клеток Cos-7, легко адаптируется для многих экспериментов на основе TGT. Различные лиганды,_Т-тол, типы клеток, параметры стимуляции, белки, помеченные после фиксации, и количественный анализ могут быть легко заменены, что делает этот протокол надежным и широко полезным.

Протокол

1. Олигонуклеотидный препарат TGT

ПРИМЕЧАНИЕ: Детали синтеза олигонуклеотидных зондов изложены здесь. Обратите внимание, что некоторые модификации и этапы очистки могут быть переданы на аутсорсинг для пользовательского синтеза.

1. Активировать первичный амин цикло[Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys(PEG-PEG)] пептида с помощью азид-NHS линкера, как описано Zhang et al²² , путем смешивания в соотношении 1:1,5 (100:150 нмолей) в конечном объеме 10 мкл диметилформамида. Добавляют 0,1 мкл триэтиламина органического основания и инкубируют в течение 12 ч при 4°С.
2. Очищают продукт методом ВЭЖХ обратной фазы с использованием 0,1 М ТЭА (растворитель А) и 100% ацетонитрила (растворитель В) со скоростью потока 1 мл/мин и начальным состоянием 10% растворителя В, установленного при градиенте 0,5%/мин. Объедините элюированные пики (поглощение при 203 нм) и проверьте с помощью масс-спектрометрии MALDI-TOF. Продукт представляет собой cRGDfK-азид.
3. Для получения верхней нити TGT соедините cRGDfK-азид и алкин-21-BHQ2 олигонуклеотид (верхняя нить TGT: 5 Гексинил/GTGAAATACCGCACAGATGCG/3BHQ_2) в соотношении 2:1 (͂200 мкМ: 100 мкМ) в 100 мкл 1x фосфатного буферного физиологического раствора (PBS) с 5 мМ аскорбата натрия и 0,1 мкМ преформированного Cu-THPTA. Дайте реакции продолжаться в течение как минимум 4 ч при комнатной температуре (RT) или в течение ночи при 4 °C.
4. Обработайте смесь через обессоливающий гель P2 для удаления избытка красителя, побочных продуктов, органического растворителя и непрореагировавших реагентов. Подготовьте колонку центрифуги с 650 мкл предварительно гидратированного геля P2, вращая его вниз при 18 000 х г в течение 1 мин. Отбросьте проточную жидкость и добавьте реакционную смесь. Снова вращайте при 18 000 х г в течение 1 мин и собирайте сквозной поток. Доведите реакционную смесь до конечного объема 300 мкл со сверхчистой водой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительно увлажняйте гель P2 водой в течение 6 ч.
5. Очищают обессоленную реакционную смесь обратнофазной ВЭЖХ. Органические растворители, используемые для этой очистки, включают 0,1 M TEAA в_H2O(растворитель A) и 100% MeCN (растворитель B, или подвижная фаза).
   1. Перед введением смеси уравновешивают колонку с начальным состоянием 10% растворителя В с градиентом 1%/мин. Отрегулируйте расход до 1 мл/мин. Вводят реакционную смесь в петлю ВЭЖХ инъекционной иглой объемом 500 мкл.
   2. Соберите продукт, визуализируя пик поглощения при 260 нм для ДНК и 560 нм для гасителя BHQ2. Высушите элюированный продукт в течение ночи в вакуумном центробежном концентраторе.
6. Используйте нуклеофильное замещение для соединения нижней нити TGT с эфиром Cy3B-NHS, как описано в Ma et. ал²⁵. Смешайте 100 мкМ нижней нити 56 pN TGT (5Biosg/TTTTTT/iUniAmM/CGCATCTGTGCGGTATTTCACTTT) с 50 мкг эфира Cy3B-NHS, предварительно растворенного в 10 мкл ДМСО. Отрегулируйте рН этой смеси до 9 с 0,1 М бикарбоната натрия и доведите конечный объем до 100 мкл с 1x PBS. Инкубировать реакционную смесь в течение ночи на РТ.
7. Очищают смесь последовательно, используя фильтрацию геля P2 и ВЭЖХ обратной фазы для разделения непрореагировавших реагентов, солей и органических растворителей (описанных в этапах 1.4 и 1.5).
8. Оценить концентрацию очищенных конъюгатов олигонуклеотид-краситель путем регистрации их поглощения при 260 нм с помощью спектрофотометра.
9. Охарактеризовать очищенные продукты масс-спектрометрией MALDI-TOF. Растворите избыток 3-гидроксипиполиновой кислоты в растворителе TA50 (50:50 v/v ацетонитрила и 0,1% TFA в ddH₂O) для получения свежей матрицы MALDI. Расчетные и измеренные молекулярные массы для маркированной продукции составляют: cRGDfK-1-BHQ2 - 8157,9 (рассчитано), 8160,1 (найдено); Cy3B с маркировкой 56 пН TGT - 10272,7 (рассчитано), 10295,8 (найдено).
10. Растворите верхнюю и нижнюю пряди отдельно в воде без нуклеаз в концентрации 30-50 мкМ. Используйте наконечники пипеток без ДНКазы, чтобы избежать загрязнения запасов. Хранить при температуре 4 °C для краткосрочного применения или -20 °C для длительного применения. На стабильность олигонуклеотидов не влияют повторяющиеся циклы замораживания-оттаивания.

2. Подготовка поверхности

День 1:

1. Поместите стеклянные крышки диаметром 25 мм (до 8) в стеллаж из политетрафторэтилена. Поместите стойку в 50 мл боросиликатного стакана, содержащий 40 мл 200-стойкого этанола. Накройте стакан парафиновой пленкой, чтобы избежать попадания воды, и храните ультразвуком на рабочей частоте 35 кГц в течение 10-15 мин при РТ (рисунок 1А).
2. Наполните стакан объемом 50 мл 40 мл свежеприготовленного раствора пираньи путем смешивания серной кислоты и перекиси водорода в соотношении 3:1 в стакане pyrex. Перемешать стеклянной пипеткой. Переложите крышку стойки в стакан и высиживайте в течение 30 минут при RT в вытяжном шкафу, чтобы вытравить поверхность крышки (рисунок 1B).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Носите полные СИЗ, включая лабораторное пальто, перчатки и очки, и работайте в химическом вытяжном шкафу. Медленно добавляйте перекись водорода в кислоту, чтобы предотвратить перегрев раствора.
3. После травления используйте пинцет для переноса стойки крышки на стакан со сверхчистой водой. Повторите этот шаг шесть раз с интервалом 15 с, чтобы полностью нейтрализовать кислоту (рисунок 1C).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Оставьте раствор пираньи в химическом вытяжном шкафу на ночь, прежде чем выбрасывать его в контейнер для кислотных отходов.
4. Визуально осмотрите крышки, чтобы убедиться, что поверхности выглядят чистыми без узоров или частиц пыли на поверхности стекла. Повторите шаги 2.1-2.4 при обнаружении узоров или пыли.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Испытайте гидрофильность поверхности, окунув обработанные крышки в воду и удалив их вертикально. Вода на обработанных покровных листах отступает в виде однородного листа, образуя кольца Янга по сравнению с необработанными покровными листами, которые образуют пятна.
5. Переложите крышку стойки на стакан с 200-стойким этанолом и дважды промыть в течение 15 с, чтобы уравновесить поверхности до органического растворителя. Переложите крышку стойки в 200-стойкий раствор этанола с 3% APTES в течение 1 ч на RT для силанизации крышек (рисунок 1D). Накройте стакан парафиновой пленкой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры осаждения APTES варьируются в зависимости от метода очистки поверхности, содержания растворителя воды, концентрации APTES, времени инкубации и температуры для отжига.
6. Погрузите стойку в чистый стакан с 200-стойким раствором этанола. Повторите эту промывку три раза в течение 15 с каждая (рисунок 1E).
7. Высушите крышки с использованием азота (_N2) газа с низким давлением выхода. Поместите крышки в 10-сантиметровую полистирольную посуду с куском парафиновой пленки, уложенным внутри. Убедитесь, что крышки сухие и отделены друг от друга (рисунок 1F).
8. Добавьте 100 мкл 2 мг/мл раствора NHS-биотина в ДМСО к четырем покровам, помещенным на парафиновую пленку. Установите «сэндвич» с другими четырьмя крышками сверху (два обшивка, обращенных друг к другу с раствором функционализации между ними) и высиживайте блюдо в течение ночи при 4 °C (рисунок 1G).
   ПРИМЕЧАНИЕ: При 4 °C реагент NHS более стабилен, что способствует равномерной функционализации поверхности. Кроме того, бутерброд консервирует реагенты. Избегайте добавления лишнего раствора в бутерброд, так как он может просочиться и привести к скольжению чехлов.

День 2:

9. Снимите блюдо с температуры 4 °C и отделите зажатые крышки. Ориентируйте скольжения в стойке с покрытой поверхностью, обращенной друг к другу, как показано на рисунке 2А. Промывайте их 200-стойким раствором этанола три раза по 15 с каждый. Высушите газом_N2 и поместите их в новую посуду с парафиновой пленкой внутри.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ориентация покровных прорезей по указанию помогает идентифицировать функционализированную поверхность.
10. Вымойте крышки 1 мл 1x PBS три раза, чтобы уравновесить их обратно в водную фазу. Добавьте 800 мкл 0,1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в 1x PBS (w/v) к каждому из обрывков крышки и инкубируйте на RT в течение 30 мин, чтобы пассивировать поверхность и блокировать неспецифическое связывание последующих реагентов функционализации (рисунок 2B).
11. После инкубации промыть крышки три раза 1 мл 1x PBS. Добавьте 800 мкл 1 мкг/мл стрептавидина в 1x PBS при RT в течение 45-60 мин для функционализации покровов (рисунок 2C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сохраните один обшивочный лист без стрептавидина для проверки эффективности пассивации (опционально). Добавьте 10 нМ биотинилированных молекул и изображение с использованием экспериментальных условий. Эта интенсивность поверхности должна быть близка к темному шуму камеры.
12. Одновременно со стадией 2.11 собирают зонды TGT (верхняя: нижняя нить при молярном соотношении 1:1) с конечной концентрацией 50 нМ в 100 мкл 1 М NaCl в ПЦР-трубке с помощью термоциклера. Диссоциируют пряди при 95 °C в течение 5 мин, и постепенно отжигают, снижая температуру до 25 °C и выдерживая ее в течение 25 мин (рисунок 2D). Избегайте длительного воздействия датчиков TGT на свет.
13. После инкубации стрептавидина используйте 1x PBS, чтобы промыть крышки три раза. Добавьте 100 мкл предварительно собранных датчиков TGT к четырем чехловочным листам и сделайте сэндвичи, используя оставшиеся 4 обшивки с функционализированной стороной, обращенной к зондам (для восьми поверхностей требуются четыре трубки гибридизированных зондов TGT). Накройте алюминиевой фольгой и инкубируйте в течение 1 ч на RT, чтобы обеспечить связывание зонда с поверхностью (рисунок 2E).
14. После инкубации отделите бутерброды и трижды вымойте крышки 1x PBS. Поверхности TGT теперь готовы к визуализации. Тщательно соберите крышки в предварительно очищенные камеры визуализации и добавьте 1 pBS, чтобы сохранить поверхности гидратированными (рисунок 2F).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чрезмерное уплотнение камер приведет к растрескиванию поверхности. Предотвращает высыхание поверхностей.

3. Подготовка и окрашивание клеток

1. Чтобы исследовать влияние стимуляции эпидермальным фактором роста (EGF) на механику Cos-7, адгезию и распространение клеток, трипсинизируют клетки Cos-7 с 0,05% трипсина-ЭДТА в течение 2 мин. Нейтрализуют трипсин промывкой HBSS и центрифугированием при 800 х г в течение 5 мин. Повторите шаг нейтрализации еще раз.
2. Пластинчатые ячейки плотностью 4 x 10⁴ ячейки на собранных поверхностях TGT в модифицированной орлиной среде Dulbecco (DMEM), дополненной 50 нг/мл EGF или DMEM без EGF. Дайте клеткам распространиться в течение 60 мин при 37 °C с 5% CO₂ в инкубаторе клеточной культуры (рисунок 3A).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки инкубируются в DMEM без сыворотки, чтобы избежать стимуляции от факторов роста. EGF разбавляют в 10 мМ уксусной кислоты, чтобы получить запас 1 мг/мл. Он используется при 50 нг / мл в DMEM для экспериментов по визуализации.
3. После инкубации промыть клетки три раза 1x PBS и зафиксировать 2 мл 4% параформальдегида в течение 12 мин при RT (рисунок 3B).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы инкубации выполняются на ротационном шейкере при ~35 об/мин для равномерного распределения растворов. Защитите поверхности TGT от света, покрыв их до тех пор, пока они не будут готовы к визуализации.
4. Аспирировать фиксатор и промыть крышки пять раз с 1x PBS с интервалом 5 мин при RT. Необязательно инкубировать крышки с 50 мМ NH₄Cl в 1x PBS в течение 30 мин при 37 °C для гашения параформальдегид-ассоциированной автофлуоресценции и промыть три раза с 1x PBS с интервалом 5 минут (рисунок 3B).
5. Добавьте буфер A (1x PBS, 5% нормальной конской сыворотки, 5% нормальной козьей сыворотки, 1% BSA, 0,025% Triton X-100) и инкубируйте в течение 30 мин при 37 °C для блокирования и пермеабилизации клеток. Промывайте три раза с 1x PBS с интервалом в 5 минут (рисунок 3B).
6. Поместите камеры визуализации с крышками в контейнер влажности. Разбавляют первичное анти-паксиллиновое антитело (очаговый маркер адгезии) при 1:250 в блокирующем буфере (1x PBS, 5% нормальная конская сыворотка, 5% нормальная козья сыворотка, 1% BSA, 0,005% Triton x-100). Инкубировать с 200 мкл раствора первичного антитела на крышку в течение 2 ч при 37 °C (рисунок 3B).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не позволяйте поверхностям высохнуть.
7. Вымойте крышки пять раз с 1x PBS с интервалом в 5 минут и верните их в контейнер влажности. Метки клеток одновременно со смесью красителя конъюгированного козьего анти-кроликового вторичного антитела в разведении 1:800 и красителя конъюгированного фаллоидина (актина) в разведении 1:400 в 200 мкл блокирующего буфера на крышку. Инкубировать при 37 °C в течение 60 мин (рисунок 3B).
8. Вымойте поверхности пять раз с 1x PBS с интервалом в 5 минут и храните при 4 °C до готовности к визуализации (рисунок 3B).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы изображений в течение 3 дней после подготовки поверхности во избежание деградации сигнала.

4. Получение изображений

1. Используйте масляный погружной объектив 60x с высокой числовой апертурой (1,49) на инвертированном микроскопе с возбуждением 488, 561 и 647 TIRF, возбуждением RICM, идеальной системой фокусировки и цифровой камерой.
   1. Добавьте масло к объективу, очистите нижнюю часть пробоотборника и поместите образец на ступеньку. Сосредоточьтесь на клетке и задействуйте идеальный фокус.
2. Переведите микроскоп в режим визуализации RICM с возбуждением эпифлуоресценции и куб фильтра GFP со снятым эмиссионным фильтром. Выровняйте RICM, закрыв и центрировав диафрагму с эпиосвещенной диафрагмой.
3. Переведите микроскоп в режим TIRF с лазерным возбуждением и четырехпроходным фильтрующим кубом TIRF. Сфокусируйте 488-нм лазер на небольшом пятне на потолке помещения и увеличьте угол падения до тех пор, пока не превысите критический угол, отслеживая флуоресценцию на камере в режиме реального времени. Наблюдайте резкое снижение фоновой флуоресценции и одну плоскость в фокусе, когда критический угол превышен.
   ПРИМЕЧАНИЕ: TIRF возбуждает тонкую область (~100 нм), ближайшую к интерфейсу образец-крышка, выделяя открытые зонды TGT и фокальные спайки, устраняя при этом флуоресценцию вне фокуса внутри ячейки. Если TIRF недоступен, может использоваться эпифлуоресценция; однако отношение сигнал/шум будет ниже.
4. Идентификация клеток для визуализации с помощью «живого» режима камеры с помощью RICM.
5. Получите изображения RICM и TIRF актина (640 нм ex), напряжения интегрина (561 нм ex) и паксиллина (488 нм ex). Получайте изображения последовательно, используя время экспозиции 200 мс.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Время экспозиции зависит от многих факторов, включая объектив, мощность лазера, эмиссионные фильтры и чувствительность камеры. Сигнал должен быть как минимум в 2 раза больше фонового. Фон составляет около 1000 а.е., поэтому сигнал должен быть не менее 2000-3000 а.е.
6. Повторите 4,4-4,5 по крайней мере для 30 клеток. Измените обшивки, фокусировку и повторите 4.4-4.5.

5. Анализ данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполнение количественного анализа изображений с использованием программного обеспечения Фиджи и анализа с использованием статистического программного обеспечения.

1. Откройте набор изображений для одной ячейки.
2. Создайте маску области ячейки (маску RICM), проследив границу ячейки в изображении RICM с помощью инструмента выделения ImageJ Freehand. Сохраните интересующий регион (ROI) для менеджера ROI (Analyze > Tools > ROI manager) (Рисунок 4A1,2).
3. Выберите репрезентативную область за пределами ячейки на изображении натяжения интегрина и нарисуйте рентабельность инвестиций не менее 200 x 200 пикселей. Исключите любые другие клетки или флуоресцентный мусор из ROI. Измерьте фоновую флуоресценцию в ROI с помощью инструмента измерения (Analyze > Measure) (рисунок 4A3).
4. Вычтите среднюю фоновую флуоресценцию, полученную на шаге 5.2, из изображения натяжения (Process > Math > Subtract) (Рисунок 4A4).
5. Используйте маску RICM, установленную на шаге 5.2, для определения сигнала натяжения внутри ячейки (менеджер ROI > Выберите > Применить маску > Edit > Clear outside) (рисунок 4A5).
6. Создайте пороговую маску для изображения натяжения, используя метод Хуана для автоматического порогового значения (Image > Adjust > Threshold) (рисунок 4A6). Убедитесь, что пороговая маска наилучшим образом представляет область для создаваемого напряжения интегрина. Как правило, установите пороговое значение в 2 раза от средней фоновой флуоресценции.
7. Создайте выборку пороговой маски натяжения (Edit > Selection > Create) (рисунок 4A7).
8. Перенесите выбранную маску на изображение натяжения, полученное на шаге 5.4, и измерьте интегрированную интенсивность открытых зондов (менеджер ROI > Select (маска натяжения) > Analyze > Measure > RawIntDen) (Рисунок 4C).
9. Измерьте область морфометрических свойств ячейки, цикличность и соотношение сторон с помощью маски RICM (менеджер ROI > Select (маска RICM) > Применить маску > Analyze > Measure) (рисунок 4B).
10. Измерьте плотность механического разрыва, определяемую как процент площади ячейки с разорванными зондами, выбрав изображение маски натяжения и применив маску RICM (менеджер ROI > Select (RICM Mask) > Analyze > Measure > % Area) (рисунок 4C).
11. Экспортируйте измерения для дальнейшего анализа и визуализации в статистическое программное обеспечение.
12. Повторите 5.1-5.11 для каждой ячейки.

Результаты

Включенные TGT-зонды были использованы для исследования влияния лиганд-активированного рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) на интегрин-опосредованную клеточную механику и образование адгезии в клетках Cos-7²¹. Зонды представляют лиганд циклический Arg-Gly-Asp-Phe-Lys (cRGDfK)^21,23,25,26, который является селективным для интегринового гетеродимера αVβ3 с небольшим сродством к интегринам α5β1 27,28,29,30. Зонд TGT содержит дуплексную ДНК, функционализированную на стеклянной покровной поверхности через нижнюю цепь с использованием связывания биотин-стрептавидин. Верхняя нить отображает лиганд интегрина и доступна для связывания с родственным рецептором интегрина на клеточной мембране (рисунок 5А). Нижняя прядь помечена флуорофором, а верхняя прядь — склепкой, что приводит к минимальной фоновой флуоресценции, когда дуплекс TGT неповрежден. Если интегрин связывает лиганд и применяет силу с величиной, превышающей_T-тол зонда, дуплекс ДНК будет отделяться, что приведет к флуоресценции (рисунок 5A). Любой зонд TGT, который не был разорван механической силой, останется нефлуоресцентным. Эта силовая селективная флуоресценция при включении позволяет систематически и количественно отображать силы, генерируемые интегрином в масштабе pN, при дифракционно-ограниченном разрешении. Датчики TGT дополнительно модулируют порог натяжения подложки.

Здесь показан репрезентативный пример поверхности TGT с T_tol 56 pN. Клетки Cos-7 были покрыты на этой поверхности TGT со стимуляцией EGF или без нее для изучения влияния активации EGFR со стимуляцией лигандов на адгезию клеток и механику интегрина (рисунок 5A, B). Клетки инкубировали с EGF или без него на поверхностях TGT в течение 60 минут, фиксировали и окрашивали иммуноактивно для отображения распределения фокальной адгезии (паксиллин) и организации цитоскелета (F-актин) (рисунок 5B). Затем клетки были визуализированы с использованием микроскопии RICM и TIRF. Как ясно видно на изображении RICM, распространение клетки Cos-7 на поверхности 56 пН TGT было значительно усилено стимуляцией EGF по сравнению с без стимуляции. Это было количественно определено для 50 клеток в каждом состоянии путем измерения размера области контакта между ячейкой и субстратом из изображения RICM (рисунок 5C). Стимуляция EGF привела к более круговой морфологии, репрезентативной для клеток Cos-7, распространяющихся и растущих в их естественной физиологической среде (рисунок 5D). Флуоресценция от открытых зондов также выше при стимуляции EGF, как это наблюдается на изображении флуоресценции напряжения. Интегральная интенсивность открытых зондов, пропорциональна количеству открытых зондов, была намного выше при стимуляции EGF по сравнению с без (рисунок 5B, E). Это представление всех взаимодействий рецептор-лиганд, где интегрины прикладывают силу, превышающую T_tol (56 пН).

Окрашивание паксиллином показало, что на распределение, количество, созревание (размер) и организацию очаговых спаек также влияла стимуляция EGF. Фокальные спайки в клетках, стимулируемых EGF, оказались более зрелыми и радиально ориентированными по сравнению с отсутствием контроля EGF. Организация F-актина цитоскелета также была усилена стимуляцией EGF, оцениваемой окрашиванием фаллоидином (рисунок 5B). Эти качественные оценки были сделаны путем визуального сравнения изображений из обеих групп лечения. Количественный анализ очаговой адгезии может быть проведен, но выходит за рамки данного протокола. В этом эксперименте поверхность TGT обеспечила платформу для систематического детализации влияния активации EGFR на распространение клеток, механику интегрина и формирование фокальной адгезии.

Рисунок 1: Схема для 1-го дня подготовки поверхности TGT. (A) Очистите крышки. (B) Травление поверхности крышки. (C) Нейтрализовать раствор пираньи. D) силанизировать поверхность для образования реакционноспособных аминных групп. (E) Уравновешивать покровы до органической фазы. F) Высушите крышки инертным газом. (G) Биотинилат поверхностных аминных групп. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Схема для 2-го дня подготовки поверхности TGT. (A) Очистите и высушите крышки, чтобы удалить остаточный биотин с предыдущего дня. (B) Пассивировать с BSA для предотвращения неспецифического связывания реагента на последующих этапах. (C) Функционализировать обшивки стрептавидином. (D) Гибридизация зондов в термовелоуборнике. (E) Приложите синтезированные зонды к покровным листам (F) Соберите крышку в камере визуализации клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Общий рабочий процесс, выделяющий широкие этапы всей экспериментальной установки. (A) Процесс отслоения клеток и покрытия на поверхности TGT в базальных средах (DMEM) со стимуляцией EGF или без нее. (B) Блок-схема этапов, связанных с фиксацией и иммуноокраслением после прикрепления и распространения на поверхности TGT. (C) После окрашивания клетки визуализируются на инвертированном флуоресцентном микроскопе с микроскопией RICM и TIRF. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Пример обработки данных и количественного анализа. (A) Пошаговая разбивка конвейера анализа, используемого на Фиджи (ImageJ) для RICM и количественной оценки изображения натяжения. (B) Репрезентативный пример для клеточных морфометрических исходов, проанализированных с использованием вышеуказанного конвейера. (C) Репрезентативные примеры механических результатов клеток, проанализированных с использованием вышеупомянутого конвейера. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Пример данных из эксперимента TGT. (A) Диаграмма, выделяющая контактную зону на границе поверхности клеточной мембраны и TGT. Вставка проецирует интегрины, взаимодействующие со своим родственным лигандом cRGDfK с (справа) или без (слева) стимуляцией EGF. (B) ИЗОБРАЖЕНИЯ RICM и TIRF ячеек Cos-7, расположенные на поверхности TGT 56 pN. Изображения получаются через 60 мин после нанесения покрытия со стимуляцией EGF или без нее. Отдельные изображения RICM (как приобретенные), натяжение интегрина (оттенки серого), паксиллин (оранжевый горячий) и F-актин (сине-зеленый) показаны с наложениями для обоих состояний стимуляции. Шкала Bar: 10 мкм. Вставка выделяет увеличенную рентабельность инвестиций (область интереса), подробно описывающую колокализацию генерируемого напряжения интегрина в местах образования адгезии, отмеченных паксиллином, и лежащей в основе субклеточной цитоскелетной организации, отмеченной актином. Шкала Bar: 5 мкм. (С-Е) Диаграммы рассеяния для области распространения (след ячейки RICM) (C), циркулярности (D) и интегрированного напряжения (E) для клеток Cos-7 со стимуляцией EGF или без нее. Столбцы обозначают среднее значение ± s.d. Различия между группами оценивались статистически с помощью t-теста Student; P < 0,0001. n = 50 клеток в трех независимых экспериментах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6: Пример поверхностей TGT с различными возможными проблемами. (A) Изображения натяжения и RICM идеальной поверхности TGT с собранным зондом, закаленным перед адгезией ячейки. (B) Изображения натяжения и RICM поверхности TGT, где в зонде TGT отсутствует верхняя нить (гаситель). Натяжное изображение показывает равномерную флуоресценцию от открытого флуорофора в нижней нити. (C) Изображения натяжения и RICM для клеток, распределенных по идеальной поверхности TGT. (D) Изображения натяжения и RICM для клеток, распределенных по плохо сделанной поверхности TGT с ограниченной пассивацией или деградированным зондом. (E) Изображения натяжения, RICM и яркого поля для клеток, покрытых на идеальной поверхности лигандом cRGDfK, указывающим на взаимодействие cRGDfK-интегрина, имеют жизненно важное значение для прикрепления клеток и генерации натяжения. (F) Изображения натяжения, RICM и яркого поля для клеток, покрытых на поверхности без лиганда cRGDfK на TGT. В то время как клетки видны на изображении яркого поля, не наблюдается прикрепления клеток или генерируемого напряжения интегрина. Шкала Bar: 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Обсуждение

С помощью подробной пошаговой процедуры, описанной выше, можно подготовить поверхности TGT для количественной оценки морфологии клеток и напряжения интегрина, создаваемого адгезивными клетками во время прикрепления клеток и распространения после обработки EGF. Простая конструкция зонда, синтез и подготовка поверхности вместе с простой экспериментальной установкой обеспечили стабильную платформу для изучения взаимодействия EGFR и интегринов. В целом, результаты подтверждают, что лиганд-зависимая активация EGFR усиливает распространение клеток, настраивает силоносящие свойства рецепторов интегрина и способствует организации и созреванию фокальной адгезии. Результаты, полученные с использованием зондов TGT, подтверждают всеобъемлющую гипотезу о том, что факторы роста, такие как EGFR, действуют как «механоорганизаторы», увеличивая величину и пространственную организацию напряжения интегрина и регулируя ориентацию и механику фокальных спаек.

При нанесении на поверхность TGT клетки приземляются, прикрепляются и распространяются, поскольку рецепторы интегрина (αVβ3) ощущают и связываются с лигандом cRGDfK. При этом зонды TGT могут быть механически разорваны, создавая флуоресценцию в месте вовлечения лиганда. Считывание — это кумулятивная «история силы» клетки, взаимодействующей с поверхностью. Есть некоторые общие проблемы с поверхностями TGT, которые могут присутствовать во время этих экспериментов. Высокая поверхностная фоновая флуоресценция (рисунок 6A,B), пятнистый внешний вид поверхности, неспособность ячеек генерировать сигнал натяжения (Рисунок 6C,D) и неспособность клеток распространяться (Фиг.6E,F) могут быть вызваны техническими недостатками с зондом TGT или поверхностным синтезом. Решения этих распространенных проблем представлены в таблице 1.

Простая конструкция зондов TGT предоставляет клеточным биологам мощный инструмент для изучения специфических сигнальных результатов фактора роста-интегрина в изоляции без вмешательства со стороны других рецепторов клеточной поверхности, предоставляя только специфические лиганды и стимуляции. Кроме того, зонды TGT позволяют исследовать порог напряжения, подчеркивающий отдельные рецепторы интегрина во время клеточной адгезии при чувствительности pN. Альтернативные подходы не сообщают о силах, оказываемых отдельными рецепторами с высоким пространственным разрешением в фиксированных образцах³¹. Микроскопия тяговой силы чувствительна только к силам nN, на порядок выше, чем силы, приложенные отдельными рецепторами интегрина¹⁵, а молекулярные зонды напряжения измеряют силы pN, но поскольку они обратимы, они не выдерживают фиксации. По этим причинам зонды TGT являются привлекательным инструментом для изучения механики взаимодействия фактор-интегрин роста.

Есть несколько технических нюансов, связанных с зондами TGT, которые следует учитывать перед проектированием эксперимента. Изображение напряжения представляет собой снимок во времени, представляющий историю силы, а не индикатор взаимодействия рецептор-лиганд в любой данный момент времени. Поскольку генерация сигнала зависит от разделения зондов, флуоресценция TGT возникает в результате открытых зондов, не находящихся под активным напряжением от взаимодействия рецептор-лиганд. Это означает, что показания для натяжения интегрина, полученные на поверхности TGT, являются историческими и кумулятивными по своей природе, представляя, где были силы, превышающие T_tol; о расположении токовых рецепторно-лигандных сил менее_Т-тол не сообщается^19,32. Поскольку разрыв TGT приводит к прекращению взаимодействия рецептор-лиганд, распространение клеток происходит из-за взаимодействий интегрин-лиганд, которые испытывают силы ниже, чем T_tol. Поэтому пользователь должен быть осторожен при определении времени после нанесения покрытия, чтобы оценить механические результаты, связанные с спайками на основе интегрина. Наконец, значение T_tol должно быть рассмотрено. Используемые здесь датчики TGT имеют T_tol 56 pN, где T_tol - постоянная сила, необходимая для разрыва 50% зондов при применении в течение 2 с. При рассмотрении сложных биологических систем ТГТ, вероятно, испытывают гетерогенную и разнообразную градацию сил с различными временными зависимостями. Если ТГТ разрываются силами, превышающими_Т-тол, флуоресценция будет недооценкой общего напряжения. В качестве альтернативы, силы ниже T_tol, приложенные для более длительных периодов времени, могут разорвать такое же количество зондов, как и высокие пороговые силы, применяемые для более короткого времени. Оба этих сценария могут привести к одинаковому показанию интенсивности флуоресценции, что затрудняет определение точной величины или динамики напряжения с помощью датчиков TGT^33,34.

В целом, оценки напряженности интегрина при стимуляции фактора роста должны проводиться тщательно путем разработки экспериментов с внутренним контролем, сравнения профилей распространения на других поверхностях с матричным покрытием, параллельных оценок флуоресценции TGT в клетках при наличии или отсутствии стимуляции фактора роста и использования TGT с различным T_tol . ТГТ позволяют количественно оценить роль передачи сигналов фактора роста в регулировании механики рецепторов интегрина, динамике фокальной адгезии и распространении клеток. Этот протокол может быть использован в качестве шаблона для многих экспериментов на основе TGT с использованием зондов с различным_T-толом, различными лигандами, различными типами клеток или различными условиями стимуляции. Любые интересующие белки могут быть помечены после фиксации, и может быть реализован любой тип количественного анализа изображений. Таким образом, мы представляем шаблон для многочисленных экспериментов TGT.

Использование TGT-зондов не ограничивается изучением интегринов, но может быть распространено на разнообразный массив рецепторов клеточной мембраны в разных типах клеток путем модификации лиганда. Зонды TGT были использованы для исследования роли сил в регуляции различных сигнальных каскадов рецепторов, включая определение механической роли механики рецепторов Notch в эмбриональном развитии и нейрогенезе³⁵, сил, опосредующих идентификацию и интернализацию антигенов рецепторами^{В-клеток 36}, и механическую способность корректуры рецепторов поверхности Т-клеток обнаруживать изменения сил для повышения силы и специфичности передачи сигнала^37. . Вместе эти результаты подчеркивают огромный потенциал зондов TGT в различных экспериментальных условиях.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
(3-Аминопропил)Триэтоксисилан	Millipore Sigma	440140	Подготовка поверхности
3-гидроксипиолиновая кислота (3-HPA)	Millipore Sigma	56197	Maldi-TOF-MS матрица
Уксусная кислота, ледниковый	Fisher Scientific	A38S	разбавляющий EGF
ацетонитрил (ВЭЖХ)	Fisher Scientific	A998SK	Олигонуклеотидный препарат
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Клеточная сигнальная технология	8878S	Иммуноцитохимия
Хлорид аммония	Fisher Scientific	A687	Иммуноцитохимия
Антитела к паксиллину [Y113]	Abcam	ab32084	Иммуноцитохимия
BD Шприцы только с Luer-Lok	BD бионаука	309657	подготовка поверхности
Био-гель P-2	Bio-Rad	1504118	Препарат олигонуклеотидов
Бычья сыворотка Альбумин (BSA) Порошок без протеазы	Fisher Scientific	BP9703100	Подготовка поверхности
Cos-7 Клетки	ATCC	CRL-1651	, Номер пассажа 11-20
Coverslip Mini-Rack, для 8 покровных стекол	Fisher Scientific	C14784	Подготовка поверхности
c(RGDfK(PEG-PEG)), PEG=8- амино-3,6-диоксаоктановая кислота	Vivitide	PCI-3696-PI	Олигонуклеотидный препарат
Cy3B NHS ester	GE Healthcare	PA63101	Олигонуклеотидный препарат
Диметилформамид	Millipore Sigma	PHR1553	Олигонуклеотидный препарат
DMEM с L-глутамином, 4,5 г/л глюкозы и пирувата натрия	Fisher Scientific	MT10013C	Клеточная культура
Эпидермальный фактор роста человека EGF	Millipore Sigma	E9644	Клеточная культура
Этанол, 200 проба (100%)	Fisher Scientific	22032601	Подготовка поверхности
Falcon Стандартные блюда для культуры тканей	Fisher Scientific	08-772E	Подготовка поверхности
Сыворотка плода крупного рогатого скота	Fisher Scientific	10-438-026	Клеточная культура
флуробрита DMEM	Fisher Scientific	A1896701	Клеточная культура
козы против кролика IgG (H+L) Перекрестно-адсорбированное вторичное антитело, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A-21244	Иммуноцитохимия
Сыворотка коз	Fisher Scientific	16-210-064	Иммуноцитохимия
Hank ' s сбалансированные соли (HBSS)	Fisher Scientific	14-170-161	Клеточная культура
Сыворотка лошади	Fisher Scientific	16050130	иммуноцитохимия
Перекись водорода	Fisher Scientific	H325-500	Поверхностный препарат
Nanosep MF центробежные аппараты	Pall laboratory	ODM02C35	Олигонуклеотидный препарат
NHS-азид	Fisher Scientific	88902	Препарат олигонуклеотида
Баллон с газообразным		азотом	Подготовка поверхности
воздуха No 2 круглые стеклянные покровные стекла - 25 мм	VWR	48382-085	Подготовка поверхности
Парапленка M Лабораторная пленка Fisher	Scientific	13-374-10	Подготовка поверхности
параформальдегид 16%	Fisher Scientific	50-980-487	Иммуноцитохимия
PBS, 1X	Fisher Scientific	21-030-CV	Поверхностный препарат/иммуноцитохимия
Пенициллин-стрептомицин (5,000 Ед/мл)	Fisher Scientific	15-070-063	Клеточная культура
PYREX Низкая форма Грифоновые стаканы	Fisher Scientific	02-540G	Поверхностный препарат
Аскорбат натрия	Fisher Scientific	18-606-310	Олигонуклеотидный препарат
Бикарбонат натрия	Fisher Scientific	S233	Олигонуклеотидный препарат
Хлорид натрия	Fisher Scientific	BP358	Поверхностный препарат
стрептавидин	Fisher Scientific	434301	Поверхностный препарат
Sulfo-NHS-LC-биотин	Fisher Scientific	21335	Поверхностный препарат
Серная кислота	Fisher Scientific	A300-500	Поверхностный препарат
TEAA	Fisher Scientific	NC0322726	олигонуклеотидный препарат
триэтиламин	миллипоры сигма	471283	олигонуклеотидный препарат
трифторуксусная кислота (TFA)	PI28901	Fisher Scientific	олигонуклеотидный препарат
THPTA	Fisher Scientific	NC1296293	Олигонуклеотидный препарат
Triton X 100 Моющее средство Surfact Ams Solution	Fisher Scientific	85111	Иммуноцитохимия
вода, класс ДНК, ДНК, ДНК, без протеазы	Fisher Scientific	BP24701	олигонуклеотидный препарат
Equipment
Agilent AdvanceBio Oligonucleotide C18 колонка, 4,6 x 150 мм, 2,7 μ m	Agilent	653950-702	Препарат олигонуклеотидов
Высокоэффективная жидкостная хроматография	Agilent	1100	Препарат олигонуклеотидов
Низкоскоростной орбитальный шейкер	Fisher Scientific	10-320-813	Иммуноцитохимия
Матричная лазерная десорбция/ионизация времяпролетный масс-спектрометр (MALDI-TOF-MS)	Voyager STR		Олигонуклеотидный препарат
Молекулярные зонды Attofluor Cell Камера	Fisher Scientific	A7816	Подготовка поверхности
Nanodrop 2000 UV-VIS спектрофотометр	Thermo Fisher		Препарат олигонуклеотидов
Nikon Eclipse Ti инвертированный микроскоп	Микроскопия	Nikon
Идеальная система фокусировки Nikon	Микроскопия	Nikon
Программное обеспечение NIS Elements	Микроскопия	Nikon
ORCA-Flash4.0 V3 Цифровая CMOS камера	Hamamatsu		Микроскопия
Четырехдиапазонная TIRF 405/488/561/647 куб	CHROMA		Микроскопия
RICM Cube	CHROMA		Микроскопия
SOLA v-nIR Light Engine	Люменкор		Микроскопия
Термоформа Стери Цикл 370 CO2-инкубатор	Fisher Scientific		Cell Culture
VWR 75D Ультразвуковой очиститель	VWR	13710	Подготовка поверхности
Анализ данных<			strong>Use
Fiji (Image J)		https://imagej.net/software/fiji/downloads	Количественный анализ
Графическая площадка Prism	Graph Pad		Статистический анализ
Oligo name	5'modification/ 3' modification	Sequence (5' to 3')	Use
Alkyne-21-BHQ2	5' Hexynyl/ 3' BHQ_2	GTGAAATACCGCACAGATGCG	Верхняя цепь TGT зонд
56 pN TGT	5' Biosg/ TTTTTT/iUniAmM	CGCATCTGTGTGCGGTATTTCACTTT	Нижняя цепь TGT
12 pN TGT	5' AmMC6/ 3' BioTEG	CGCATCTGTGCGGTATTTCACTTT	Нижняя цепь TGT