Методическая статья

Атомно-силовая микроскопия для изучения физических свойств эпидермальных клеток живых корней арабидопсиса

DOI:

10.3791/63533

⸱

31 марта 2022 г.

 ,  ,  ,  , 
1Laboratorio de Bioquímica, Departamento de Biología Vegetal, Facultad de Agronomía, Universidad de la República (UdelaR), 2Laboratorio de Señalización Celular y Nanobiología, Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable (IIBCE)

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол отступа атомно-силовой микроскопии дает возможность препарировать роль физических свойств клеточной стенки конкретной клетки ткани или органа во время нормального или ограниченного роста (т.е. при дефиците воды).

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь описан способ охарактеризовать физические свойства клеточной стенки эпидермальных клеток живых корней арабидопсиса посредством наноиндентов с помощью атомно-силового микроскопа (АСМ) в сочетании с оптическим инвертированным флуоресцентным микроскопом. Метод заключается в приложении контролируемых сил к образцу при измерении его деформации, что позволяет количественно оценить такие параметры, как кажущийся модуль Юнга клеточных стенок при субклеточных разрешениях. Это требует тщательной механической иммобилизации образца и правильного подбора инденторов и глубин углублений. Хотя он может быть использован только во внешних тканях, этот метод позволяет охарактеризовать механические изменения клеточных стенок растений во время развития и позволяет соотнести эти микроскопические изменения с ростом целого органа.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Растительные клетки окружены клеточной стенкой, которая представляет собой сложную структуру, состоящую из взаимодействующих сетей полисахаридов, белков, метаболитов и воды, толщина которой варьируется от 0,1 до нескольких мкм в зависимости от типа клетки и фазы роста 1,2. Механические свойства клеточной стенки играют существенную роль в росте растений. Низкие значения жесткости клеточной стенки были предложены в качестве предварительного условия для роста клеток и расширения клеточной стенки, и появляется все больше доказательств того, что все клетки ощущают механические силы для выполнения своих функций. Тем не менее, до сих пор обсуждается, определяет ли изменение физических свойств клеточной стенки судьбу клетки 2,3,4. Поскольку растительные клетки не движутся во время развития, окончательная форма органа зависит от того, как далеко и в каком направлении расширяется клетка. Таким образом, корень Arabidopsis является хорошей моделью для изучения влияния физических свойств клеточной стенки на расширение клеток, поскольку различные типы расширения происходят в разных областях корня. Например, анизотропное расширение проявляется в зоне удлинения и особенно заметно в клетках эпидермиса5.

Описанный здесь способ был использован для характеристики физических свойств клеточной стенки эпидермальных клеток на наноуровне живых корней арабидопсиса с использованием атомно-силового микроскопа (АСМ) в сочетании с инвертированным флуоресцентным фазовым микроскопом6. Вместо обширного пересмотра метода AFM читать 7,8,9.

Этот протокол описывает базовый метод подготовки образцов и общий метод измерения эластичности клеточных стенок растений на основе AFM.

figure-introduction-1
Рисунок 1: Схематический обзор эксперимента по силовому отступу в корнях Arabidopsis с использованием атомно-силовой микроскопии (AFM). Схема дает обзор этапов эксперимента по силовому углублению от подготовки субстрата для прочной иммобилизации образца корня (1-2), подтверждения жизнеспособности корня через окрашивание йодида пропидия (3), консольного позиционирования на поверхности удлиненной эпидермальной клетки первичного корня (4-5), измерения кривых силы (6) и обработки кривой силы для расчета кажущегося модуля Юнга (7-8). EZ: зона удлинения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка растительного материала и условий роста

  1. Чтобы получить необходимый растительный материал, стерилизуйте семена арабидопсиса дикого типа и мутантные линии, представляющие интерес.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе мы использовали следующее: ttl1: линии вставки T-ДНК Salk_063943 (для TTL1; AT1G53300) — Колумбия-0 (Col-0) дикого типа; мутант Procuste1 (prc1-1), который состоит из нокаутирующей мутации (Q720stop) в гене CESA6 (AT5G64740), как описано ранее в10,11; и ttl1 x prc1-1 двойной мутант.
    1. Поместите приблизительный объем 50 мкл семян в микропробирку. Добавьте 500 мкл 70% этанола + 0,01% раствора Tween при комнатной температуре. Перемешать и инкубировать в течение 7 мин.
    2. Влить раствор этанола и добавить 500 мкл 20% гипохлорита натрия. Перемешать и инкубировать в течение 7 мин.
    3. Залить раствор гипохлорита натрия и промыть семена три-четыре раза стерильной водой.
  2. Металлизация
    1. Заранее готовят базальный мурашиге и скуг (МС) в среде12 + 1,5% сахарозы + 1% агара (рН 5,7) (см. Таблицу материалов). Автоклав среды. Подготовьте ламинарную вытяжку для работы в стерильной среде и пометьте квадратные чашки Петри, необходимые для эксперимента. Налейте среду в чашку Петри и дайте среде затвердеть.
    2. Нанесите стерилизованные семена стерильными наконечниками пипеток на квадратные чашки Петри, содержащие среду. Распределите семена равномерно в два ряда. Когда семена высохнут, закройте крышки и запечатайте пластины. Стратифицировать семена при 4 °C в темноте в течение 4 дней.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Стратификация необходима для синхронизации прорастания.
    3. Поместите пластины вертикально в камеру роста в режиме длинного дня (16 ч света/8 ч темноты) с интенсивностью света 25 мкмольм 2 с−1 и 23 °C (день/ночь). Выращивайте рассаду в течение 7 дней.

2. Лечение осмотическим стрессом (по желанию)

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе приведены подробности о росте корней Arabidopsis при осмотическом потенциале -1,2 МПа, оцененном криоскопическим осмометром (Таблица материалов). Эта часть может быть опущена или изменена в зависимости от рассматриваемого экспериментального вопроса.

  1. Готовят базальную МС среду + 1,5% сахарозы + 400 мМ маннит + 1% агара (рН 5,7). Автоклав среды. Вылейте среду в квадратные чашки Петри в ламинарную вытяжку и дайте среде затвердеть.
  2. Пинцетом (Таблица материалов) поместите 5-дневные саженцы, предварительно выращенные в базальной среде MS + 1,5% сахарозы, в квадратные чашки Петри, содержащие среду, дополненную маннитом 400 мМ. Поместите пластины вертикально в камеру роста в тех же условиях, что и на этапе 1.2.3. Выращивайте рассаду в этом осмотическом стрессовом состоянии в течение 7 дней.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для оценки адаптации роста корней первичного корня во время сильного осмотического стресса рекомендуется использовать рассаду через 5 дней после прорастания, выращенную в контролируемых условиях, чтобы убедиться, что размер корневой меристемы уже установлен13. Альтернативно, анализ может быть выполнен на каждой стадии развития, чтобы определить эффект развития осмотического стрессового действия.

3. Эксперименты по наноиндентированию атомно-силовой микроскопии (AFM)

  1. Подготовка образца к экспериментам по наноиндентированию
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это важнейший шаг для применения ОВМ к изучению живых биологических образцов. Образец должен быть прочно прикреплен к подложке, чтобы быть механически стабильным во время измерений отступа. При этом структурные качества образца должны быть сохранены. Эффективной стратегией стабилизации большого образца для AFM является использование клеев. Клей должен быстро высыхать и не должен быть токсичным или реакционноспособным с окружающей средой. В этом протоколе в качестве подложки использовались полистирольные чашки Петри, а для связывания саженцев арабидопсиса использовался некислотный силиконовый клей (Таблица материалов).
    1. Нанесите тонкий слой силиконового клея в чашку Петри с помощью чехла. Оставьте клей на воздухе на 45 с.
    2. Пинцетом поместите саженец на клей, ориентируя его в направлении, избегающем контакта между выступающими частями саженца и консолью. Затем аккуратно прижмите корень к силиконовому клеевому слою, чтобы прочно связать его. Оставьте рассаду в контакте со клеем в течение 45 с, прежде чем приступить к следующим шагам протокола.
    3. Инкубировать присоединенные саженцы 2 мкг/мл йодида пропидия (PI; Таблица материалов) в течение 5 мин в темноте и трижды тщательно промыть их 1x фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) (Таблица материалов).
    4. Поместите рассаду, инкубированные PI, в перевернутый флуоресцентный микроскоп в сочетании с AFM. Для наблюдения флуоресценции установите длины волн возбуждения и излучения на уровне 572 нм и 617 нм соответственно. Отсутствие флуоресценции внутри клеток эпидермиса подтверждает жизнеспособность корней.
    5. Накройте рассаду 1x фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS).
  2. Протокол отступа
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все измерения АСМ в течение 1 ч после иммобилизации образца на его опоре при комнатной температуре. Помещение, в котором находится AFM, должно поддерживаться при температуре 25 °C с кондиционером. Раствор PBS должен быть при одинаковой температуре.
    1. Установите стандартный консольный нитрид кремния с пирамидальным наконечником (см. Таблицу материалов) в держатель зонда AFM для жидкости (Таблица материалов).
    2. Выровняйте лазер на консольном суставе близко к положению наконечника. Затем переместите фотодиод, чтобы поместить лазерное пятно в центр детектора.
    3. Чтобы откалибровать чувствительность к отклонению, поместите полистирольную чашку Петри с 1x PBS под AFM.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг необходим для вычисления отступа. Когда измерение силы производится на твердой поверхности, в поверхности нет углубления, поэтому любое изменение смещения z-сканера соответствует отклонению консольной части. Поэтому очень важно откалибровать чувствительность отклонения на твердой поверхности. Использование мягкой поверхности переоценит чувствительность к отклонению, что приведет к слишком низким пружинным константам.
    4. Отрегулируйте фотоприемник таким образом, чтобы бесконтактное отклонение было около 0 В. Откалибруйте чувствительность отклонения, выполнив отступ (кривую силы) с размером рампы 3 мкм, скоростью отступа и втягивания 0,6 мкм/с и порогом срабатывания 0,5 В.
    5. Чтобы откалибровать константу пружины консольного аппарата, используйте утилиту Thermal Tune программного обеспечения AFM (Таблица материалов), рекомендуемую для зондов с постоянными пружины менее приблизительно 5 Н/м, или используйте метод, описанный в ссылке14. Перед активацией Thermal Tune в программном обеспечении убедитесь, что зонд не взаимодействует с образцом.
      1. Введите консольную температуру. Нажмите « Калибровка > «Тепловая настройка» или значок «Тепловая настройка» на панели инструментов NanoScope . Выберите частотный диапазон (1-100 Гц).
      2. Нажмите « Получить данные » на панели «Тепловая настройка ». Подождите, пока AFM получит данные, а затем нажмите кнопку Простой гармонический осциллятор (Fluid ).
      3. Отрегулируйте среднюю ширину фильтра на 3. Отрегулируйте ширину PSD Bin, чтобы уменьшить шум в полученных данных путем усреднения. Установите границы подгонки вокруг первого резонансного пика.
      4. Нажмите «Рассчитать константу пружины k», а затем нажмите « Да » во всплывающем окне с вопросом, хочет ли пользователь использовать это значение.
      5. Повторите описанные выше шаги три раза и вручную возьмите среднее значение постоянных пружин. Введите это среднее значение в поле Spring Constant в списке параметров Ramp в представлении PicoForce . На этом калибровка заканчивается.
    6. Используя перевернутый оптический микроскоп при увеличении окуляра 10x, 20x и 40x, расположите зонд AFM на поверхности четвертой удлиненной эпидермальной клетки первичного корня, обеспечив ее положение в центре клетки.
    7. С расчетным значением постоянной пружины (шаг 3.2.5.5) получите кривые силы с размером рампы 3 мкм, порогом срабатывания 11 нН и скоростью отступа и втягивания 0,6 мкм/с в выбранных точках.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предыдущая работа15,16 показала, что низкая частота отступов и втягиваний помогает минимизировать гистерезис и силу сопротивления.
    8. Получите кривые силы из трех клеток на корень для каждого лечения (используйте три биологические реплики на лечение). Захватите не менее 150 кривых силы для каждого корня.

4. Измерьте кажущийся модуль Юнга

  1. Подогнать каждую кривую силы к следующей модели для пирамидальных инденторов17: figure-protocol-1, где E — кажущийся модуль Юнга образца, figure-protocol-2 — модуль Пуассона образца, а α — полуугл к вершине. Отбросьте припадки с коэффициентом корреляции (r2) < 0,99. Рассмотрим коэффициент Пуассона для полностью несжимаемого материала: figure-protocol-3 = 0,5 и геометрию индентора, указанную производителями.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте первые 100 нм от точки контакта кривой нагрузки, чтобы фитинг был как можно более чувствителен к механике клеточной стенки и уменьшал влияние тургорного давления на кажущиеся значения модуля Юнга8. Подгонка была выполнена с помощью пользовательской программы MATLAB (доступной по личному запросу путем записи в J. C. B), которая позволяет установить определенную глубину отступа от точки контакта кривой загрузки.
  2. Создайте нормализованную гистограмму с кажущимися данными модуля Юнга и приведите ее в соответствие с распределением Гаусса. Отбрасывайте точки данных за пределами 95% доверительного интервала и пересчитывайте как гистограмму, так и гауссову подгонку. Рассчитайте и отчитайте среднее и стандартное отклонение кажущегося модуля Юнга.
  3. Определите значимость сравнений между группами с помощью нескольких сравнительных тестов, таких как ANOVA.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эксперименты по силовому отступу
В следующем тексте представлены некоторые результаты, ожидаемые при проведении эксперимента с принудительным отступом, чтобы показать типичный выход, ожидаемый при хорошем выполнении протокола.

Кривые силы-смещения
Репрезентативные силовые участки отступа, которые были получены с отступом живых образцов в положении, расположенном в центре ячейки зоны удлинения корня, представлены на рисунке 2...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Механика клеток и клеточных стенок становится все более актуальной, чтобы получить представление о том, как механика влияет на процессы роста. Поскольку физические силы распространяются на значительные расстояния в твердых тканях, изучение изменений физических свойств клеточной стенки и того, как они воспринимаются, контролируются, настраиваются и влияют на рост растения, становится важной областью исследований 2,3,8.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов. Скрипт MATLAB, используемый для подгонки данных, доступен по личному запросу, написав в J. C. B.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование финансировалось CSIC I+D 2018, грант No 95 (Мариана Сотело Силвейра).; CSIC Grupos (Омар Борсани) и PEDECIBA.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1 x Фосфатно-солевой буфер (PBS)Содержит хлорид натрия и фосфатный буфер и разработан для предотвращения осмотического шока и поддержания водного баланса в живых клетках.
Программное обеспечение для АСМBruker, Billerica, MA, США
Атомно-силовая микроскопия (АСМ)BioScope Catalyst Catalyst, Bruker, Billerica, MA, США
Держатель зонда - жидкостьBruker, Billerica, MA, СШАCAT-FCHДержатель зонда для Bioscope Catalyst, предназначенный для работы с жидкостью в контактном или режиме нарезания резьбы. Также совместим с работой на воздухе.
Криоскопический осмометр; модель OSMOMAT 030Gonotech, Берлин, Германия
Murashige & Skoog Medium DuchessBiochemieM0221Оригинальная концентрация, (1962)
Оптический инвертированный микроскоп, соединенный с AFMOlympus IX81, Майами, Флорида, США
PEGAMILANAEROBICOS S.R.L., Буэнос-Айрес, Аргентина100429Нейтральный, некислотный силиконовый клей
чашки ПетриDeltalab200201.BПолистирол, 55 x 14 мм, радиационный стерильный.
Йодид пропидияSigmaP4170Для испытания корней на жизнеспособность.
Зонд из нитрида кремния, DNP-10, кантилевер ABruker, Billerica, MA, СШАDNP-10/AДля силовой модуляционной микроскопии в жидкостном режиме. Радиус наконечника щупа 20-60 нм. 175-μ m-длинный треугольный консоли,  с пружинной постоянной 0,35 Н/м.
ПинцетSigmaT4537

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Anderson, C. T., Kieber, J. J. Dynamic construction, perception, and remodeling of plant cell walls. Annual Review of Plant Biology. 71, 39-69 (2020).
  2. Roeder, A. H. K., et al. Fifteen compelling open questions in plant cell biology. The Plant Cell. 34 (1), 72-102 (2022).
  3. Zhang, B., Gao, Y., Zhang, L., Zhou, Y. The plant cell wall: Biosynthesis, construction, and functions. Journal of Integrative Plant Biology. 63 (1), 251-272 (2021).
  4. Hamant, O., Haswell, E. S. Life behind the wall: Sensing mechanical cues in plants. BMC Biology. 15 (59), 1-9 (2017).
  5. Scheres, B., Benfey, P., Dolan, L. Root development. The Arabidopsis Book. 1, 0101(2002).
  6. Cuadrado-Pedetti, M. B., et al. The arabidopsis tetratricopeptide thioredoxin-like 1 gene is involved in anisotropic root growth during osmotic stress adaptation. Genes. 12 (2), 236(2021).
  7. Milani, P., Braybrook, S. A., Boudaoud, A. Shrinking the hammer: micromechanical approaches to morphogenesis. Journal of Experimental Botany. 64 (15), 4651-4662 (2013).
  8. Braybrook, S. A. Measuring the elasticity of plant cells with atomic force microscopy. Methods in Cell Biology. 125, 237-254 (2015).
  9. Bidhendi, A. J., Geitmann, A. Methods to quantify primary plant cell wall mechanics. Journal of Experimental Botany. 70 (14), 3615-3648 (2019).
  10. Desnos, T., et al. Procuste1 mutants identify two distinct genetic pathways controlling hypocotyl cell elongation, respectively in dark- and light-grown Arabidopsis seedlings. Development. 122 (2), 683-693 (1996).
  11. Fagard, M., et al. Procuste1 encodes a cellulose synthase required for normal cell elongation specifically in roots and dark-grown hypocotyls of arabidopsis. The Plant Cell. 12 (12), 2409-2423 (2000).
  12. Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum. 15 (3), 473-497 (1962).
  13. Perilli, S., Sabatini, S. Analysis of root meristem size development. Methods in Molecular Biology. 655, Clifton, N.J. 177-187 (2010).
  14. Sader, J. E., et al. A virtual instrument to standardise the calibration of atomic force microscope cantilevers. Review of Scientific Instruments. 87 (9), 093711(2016).
  15. Collinsworth, A. M., Zhang, S., Kraus, W. E., Truskey, G. A. Apparent elastic modulus and hysteresis of skeletal muscle cells throughout differentiation. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 283 (4), 1219-1227 (2002).
  16. Mathur, A. B., Collinsworth, A. M., Reichert, W. M., Kraus, W. E., Truskey, G. A. Endothelial, cardiac muscle and skeletal muscle exhibit different viscous and elastic properties as determined by atomic force microscopy. Journal of Biomechanics. 34 (12), 1545-1553 (2001).
  17. Sirghi, L., Ponti, J., Broggi, F., Rossi, F. Probing elasticity and adhesion of live cells by atomic force microscopy indentation. European Biophysics Journal. 37 (6), 935-945 (2008).
  18. Peaucelle, A. AFM-based mapping of the elastic properties of cell walls: At tissue, cellular, and subcellular resolutions. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), e51317(2014).
  19. Peaucelle, A., et al. Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis. Current Biology. 21 (20), 1720-1726 (2011).
  20. Fernandes, A. N., et al. Mechanical properties of epidermal cells of whole living roots of Arabidopsis thaliana: An atomic force microscopy study. Physical Review E. 85 (2), 21916(2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Atomic Force MicroscopyEpidermal CellsArabidopsis RootsCell Wall PropertiesNanoindentation TechniqueYoung s ModulusMechanical ImmobilizationForce CurvesPyramidal IndenterInverted Fluorescence Microscope

Похожие статьи