Method Article

Локализация одноклеточного фактора на хроматине с использованием сверхнизкого входного расщепления под мишенями и высвобождение с использованием нуклеазы

DOI:

10.3791/63536

⸱

February 1st, 2022

 , 
1Department of Biological Sciences, University of Pittsburgh

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CUT&RUN и его варианты могут быть использованы для определения занятости белка на хроматине. Этот протокол описывает, как определить локализацию белка на хроматине с помощью одноклеточного uliCUT & RUN.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Определение мест связывания белка на хроматине имеет важное значение для понимания его функции и потенциальных регуляторных целей. Иммунопреципитация хроматина (ChIP) была золотым стандартом для определения локализации белка в течение более 30 лет и определяется использованием антитела для извлечения интересующего белка из ультразвукового или ферментативно переваренного хроматина. Совсем недавно методы привязки антител стали популярными для оценки локализации белка на хроматине из-за их повышенной чувствительности. Cleavage Under Targets & Release Under Nuclease (CUT & RUN) является геномным производным иммуноочистения хроматина (ChIC) и использует рекомбинантный белок A, привязанный к микрококковой нуклеазе (pA-MNase), для идентификации постоянной области IgG антитела, нацеленного на интересующий белок, что позволяет сайт-специфическое расщепление ДНК, фланкирующее интересующий белок. CUT&RUN может использоваться для профилирования модификаций гистонов, факторов транскрипции и других хроматин-связывающих белков, таких как факторы ремоделирования нуклеосом. Важно отметить, что CUT&RUN может быть использован для оценки локализации эвхроматических или гетерохроматически-ассоциированных белков и модификаций гистонов. По этим причинам CUT&RUN является мощным методом определения профилей связывания широкого спектра белков. Недавно CUT&RUN был оптимизирован для профилирования транскрипционного фактора в низких популяциях клеток и отдельных клеток, а оптимизированный протокол был назван сверхнизким входным CUT&RUN (uliCUT&RUN). Здесь представлен подробный протокол для профилирования одноклеточного фактора с использованием uliCUT&RUN в ручном 96-луночном формате.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Многие ядерные белки функционируют, взаимодействуя с хроматином, чтобы стимулировать или предотвращать деятельность, основанную на шаблонах ДНК. Чтобы определить функцию этих хроматин-взаимодействующих белков, важно определить геномные места, в которых эти белки связаны. С момента своего развития в 1985 году иммунопреципитация хроматина (ChIP) была золотым стандартом для определения того, где белок связывается с хроматином 1,2. Традиционная техника ChIP имеет следующий базовый рабочий процесс: клетки собираются и сшиваются (обычно с формальдегидом), хроматин сдвигается (обычно с помощью жестких методов обработки ультразвуком, требующих сшивки), интересующий белок иммунопреципитируется с использованием антитела, которое нацелено на белок (или помеченный белок), за которым следует вторичное антитело (связанное с агарозой или магнитными шариками), сшивание обратное, белок и РНК перевариваются для очистки ДНК, и эта обогащенная ChIP ДНК используется в качестве шаблона для анализа (с использованием радиомаркированных зондов 1,2, qPCR3, микрочипов 5,6 или секвенирования4). С появлением микрочипов и массово параллельного глубокого секвенирования в последнее время были разработаны ChIP-чипы 5,6 и ChIP-seq 4, которые позволяют идентифицировать локализацию белка на хроматине в масштабах всего генома. Кросслинкинг ChIP был мощным и надежным методом с момента его появления с крупными достижениями в разрешении ChIP-exo7 и ChIP-nexus8. Параллельно с разработкой ChIP-seq были созданы нативные (не сшивающие) протоколы для ChIP (N-ChIP), которые используют сбраживание нуклеазы (часто с использованием микрококковой нуклеазы или МНазы) для фрагментации хроматина, в отличие от ультразвука, выполняемого в традиционных методах сшивания ChIP9. Тем не менее, одним из основных недостатков технологий как сшивки ChIP, так и N-ChIP было требование высокого количества клеток из-за низкого выхода ДНК после экспериментальной манипуляции. Поэтому в последние годы многие усилия были направлены на оптимизацию технологий ChIP для низкосотового ввода. Эти усилия привели к разработке многих мощных технологий на основе CHIP, которые различаются по своей применимости и входным требованиям 10,11,12,13,14,15,16,17,18. Тем не менее, одноклеточные технологии на основе ChIP-seq отсутствовали, особенно для негистоновых белков.

В 2004 году была разработана альтернативная технология для определения занятости белка на хроматине, называемая эндогенным расщеплением хроматина (ChEC) и иммунодеказацией хроматина (ChIC)19. Эти методы с одним локусом используют слияние МНазы либо с интересующим белком (ChEC), либо с белком A (ChIC) для прямого разрезания ДНК, прилегающей к интересующему белку. В последние годы как ChEC, так и ChIC были оптимизированы для профилирования белка по всему геному на хроматине (ChEC-seq и CUT& RUN соответственно)20,21. Хотя ChEC-seq является мощным методом определения локализации факторов, он требует разработки белков слияния MNase для каждой мишени, тогда как ChIC и его вариация генома, CUT & RUN, полагаются на антитело, направленное на интересующий белок (как в случае с ChIP) и рекомбинантный белок A-MNase, где белок A может распознавать постоянную область антитела IgG. В качестве альтернативы был разработан слияние белка A/белка G-MNase (pA/G-MNase), которое может распознавать более широкий диапазон постоянныхобластей антител 22. CUT&RUN быстро стал популярной альтернативой ChIP-seq для определения локализации белка на хроматине по всему геному.

Сверхнизкий вход CUT&RUN (uliCUT&RUN), разновидность CUT&RUN, которая позволяет использовать низко- и одноэлементные входы, был описан в 2019 году23. Здесь описана методология ручного применения одной ячейки в формате 96 скважин. Важно отметить, что с момента разработки uliCUT&RUN были разработаны две альтернативы для профилирования гистонов, CUT&Tag и iACT-seq, обеспечивающие надежное и высокопараллельное профилирование гистоновых белков24,25. Кроме того, scCUT&Tag был оптимизирован для профилирования нескольких факторов в одной клетке (multiCUT&Tag) и для применения к негистоновым белкам26. Вместе CUT&RUN предоставляет привлекательную альтернативу низкому входному ChIP-seq, где uliCUT&RUN может быть выполнен в любой лаборатории молекулярной биологии, имеющей доступ к сортировщику клеток и стандартному оборудованию.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Заявление по этике: Все исследования были одобрены Институциональным бюро по биобезопасности по охране научных исследований в Университете Питтсбурга.

1. Подготовьте магнитные шарики

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните перед сортировкой ячеек и держите на льду до использования.

  1. Пипетка 30 мкл ConA-конъюгированной парамагнитной микросферы шариковой смеси за реакцию в свежую микрофьюжную трубку объемом 1,5 мл и добавление 850 мкл связывающего буфера, аккуратно пипетируя для смешивания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: КонА-конъюгированные парамагнитные микросферы представляют собой магнитные шарики с лектиновым покрытием, которые обеспечивают связывание с липидной мембраной.
  2. Поместите трубку на магнитную стойку и дайте шарикам намагничиваться в течение 1-2 мин. Как только супернатант очистится, удалите и выбросьте супернатант, не нарушая бусины.
  3. Извлеките трубку из магнитной стойки и вымойте шарики, повторно развернув в 1 мл связывающего буфера.
  4. Повторите шаги 1.2 и 1.3.
  5. Намагничьте бусины на 2 мин и удалите супернатант для выбрасывания.
  6. Извлеките трубку из магнитной стойки и повторно суспендируйте шарики в 30 мкл связывающего буфера за реакцию.
  7. Подержите промытую бисероплетение на льду до тех пор, пока ячейки не будут отсортированы.

2. Заготавливайте клетки

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг написан для прилипших клеток и оптимизирован для мышиных эмбриональных стволовых клеток E14. Культивирование и сбор клеток зависит от типа клеток.

  1. Извлеките клетки из инкубатора с температурой 37 °C и изучите их под микроскопом, чтобы убедиться в качестве.
  2. Аспирировать среду с клеточной пластины и промыть 5 мл 1x PBS.
  3. Аспирируйте PBS с тарелки и собирайте клетки (используя традиционные методы сбора клеток, которые будут отличаться в зависимости от типа клеток). Получите одноклеточную суспензию, осторожно пипетируя вверх и вниз серологической пипеткой против чашки для культивирования, если это необходимо.
  4. Переложите клеточную суспензию в коническую трубку объемом 15 мл и открутите вниз при 200 х г в течение 5 мин.
  5. Аспирировать со среды, чтобы выбросить и промыть ячейку гранулы с 5 мл PBS + 1% FBS.
  6. Раскрутите клетки при 200 х г в течение 5 мин, отбросьте супернатант и повторно суспендируйте ячейку гранулы в 5 мл PBS + 1% FBS.
  7. Подсчитайте клетки и перенесите 1 мл 1 х 106 клеток в свежую микрофьюжную трубку объемом 1,5 мл.
  8. Добавьте 5 мкл 7-амино-актиномицина D (7-AAD), переверните трубку для смешивания, а затем нанесите образец на сортировщик клеток для сортировки живых одиночных клеток в отдельные колодцы из 96-луночной пластины.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Краситель 7-AAD исключается из живых клеток и, следовательно, может использоваться при сортировке живых клеток.

3. Сортировка и лизис клеток

  1. Подготовьте совместимую с сортировщиком ячейку 96-луночную пластину со 100 мкл буфера ядерной экстракции (NE) в каждой скважине перед сортировкой ячеек.
  2. Отсортируйте ячейки по 96-луночным пластинам в соответствии с инструкциями производителя.
  3. Быстро вращайте пластину (600 х г в течение 30 с), чтобы ячейки находились в буфере внутри скважин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В предварительном эксперименте стоит проверить, надежно ли используемые ячейки доводятся до дна скважин.
  4. Подержите пробы на льду в течение 15 минут.
  5. Раскрутите образцы при 600 х г в течение 5 мин при 4 °C и осторожно выньте пипетку, чтобы удалить супернатант (оставив после себя 5 мкл).
  6. Повторно суспендируйте каждый образец в 55 мкл NE-буфера и добавьте 30 мкл предварительно промытых ConA-сопряженных парамагнитных микросфер (из стадии 1.7; в Буфер связывания) к каждой реакции.
  7. Инкубировать при комнатной температуре в течение 10 мин.

4. Предварительно блокированные образцы для предотвращения раннего пищеварения MNase

  1. Поместите пластину на магнитную стойку с 96 лунками, дайте бусинам связываться в течение минимум 5 минут, а затем извлеките и выбросьте супернатант.
  2. Добавьте 100 мкл блокирующего буфера к шарикам, связанным с ядром, и перемешайте с мягким пипетированием.
  3. Инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.

5. Добавление первичных антител

  1. Поместите пластину на магнитную стойку с 96 лунками, дайте супернатанту очиститься в течение минимум 5 минут, а затем удалите и выбросьте супернатант, не нарушая бусины.
  2. Снимите пластину с магнитной стойки и повторно суспендируйте шарики в 100 мкл промывочного буфера за реакцию с мягким пипетированием.
  3. Поместите пластину обратно на магнитную стойку с 96 лунками, дайте супернатанту очиститься, а затем извлеките и выбросьте супернатант.
  4. Повторное суспендирование шариков в 25 мкл промывочного буфера за реакцию с мягким пипетированием.
  5. Сделайте первичную смесь антител: 25 мкл Wash Buffer + 0,5 мкл антитела за реакцию.
  6. Осторожно вращая связанные ядра шарики, добавляйте 25 мкл первичной смеси антител к каждому образцу, обрабатываемому антителом, антителом, нацеленным на интересующий белок (обычно конечное разведение 1:100). Добавьте 25 мкл Wash Buffer без антител, если выполняете контроль.
  7. Инкубировать в течение 1 ч при комнатной температуре.
  8. Поместите образцы на магнитную стойку с 96 лунками, дайте супернатанту очиститься в течение как минимум 5 минут, а затем удалите и выбросьте супернатант, не нарушая бусины.
  9. Снимите пластину с магнитной стойки и вымойте шарики с помощью 100 мкл wash Buffer, повторно используя путем пипетки.

6. Добавление пА-МНазы или пА/Г-МНазы

ПРИМЕЧАНИЕ: Белок А имеет высокое сродство к молекулам IgG некоторых видов, таких как кролики, но не подходит для IgG других видов, таких как мыши или крысы. В качестве альтернативы можно использовать протеин A/G-МНазу. Этот гибрид связывает IgGs кролика, мыши и крысы, избегая необходимости во вторичных антителах при использовании первичных антител для мыши или крысы.

  1. Поместите пластину обратно на магнитную стойку с 96 лунками, дайте супернатанту очиститься в течение минимум 5 минут, а затем извлеките и выбросьте супернатант, не нарушая бусины.
  2. Извлеките пластину из магнитной стойки и повторно суспендируйте каждый образец в 25 мкл wash Buffer.
  3. Сделайте мастер-смесь пА-МНазы (25 мкл промывочного буфера + оптимизированное количество пА-МНазы за реакцию).
  4. При плавном вихре добавьте 25 мкл мастер-смеси pA-MNase к каждому образцу, включая контрольные образцы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация пА-МНазы изменяется при приготовлении, если она приготовлена в домашних условиях, и должна быть проверена перед использованием при каждой независимой очистке. Для пА/Г-МНазы следует использовать 2,5 мкл из 20-кратного запаса.
  5. Инкубируйте образцы в течение 30 минут при комнатной температуре.
  6. Поместите пластину на магнитную стойку с 96 лунками, дайте супернатанту очиститься в течение минимум 5 минут, а затем удалите и выбросьте супернатант, не нарушая бусины.
  7. Снимите пластину с магнитной стойки и вымойте шарики с помощью 100 мкл wash Buffer, повторно используя путем бережной пипетки.

7. Направленное переваривание ДНК

  1. Поместите пластину на магнитную стойку с 96 лунками, дайте супернатанту очиститься в течение минимум 5 минут, а затем извлеките и выбросьте супернатант.
  2. Извлеките образцы из магнитной стойки и повторно суспендируйте шарики в 50 мкл wash Buffer путем бережной пипетки.
  3. Уравновешивайте образцы до 0 °C в смеси лед/вода в течение 5 мин.
  4. Извлеките образцы со ледяной/водяной бани при температуре 0 °C и добавьте 1 мкл 100 мМ CaCl2 с помощью многоканальной пипетки. Хорошо перемешать (3-5 раз) при щадящем пипетке с использованием многоканальной пипетки большего объема, а затем вернуть образцы до 0 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хорошее смешивание здесь имеет важное значение. CaCl2 добавляют для активации переваривания МНазы ДНК, фланкирующей интересующий белок.
  5. Запустите 10-минутный таймер, как только тарелка вернется на ледяную / водяную баню.
  6. Остановите реакцию, пипетировав 50 мкл буфера 2XRSTOP+ в каждую скважину, в том же порядке, в котором был добавлен CaCl2 .
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сделайте буфер 2XRSTOP+ до окончания 10-минутного пищеварения, чтобы предотвратить переваривание.

8. Фракционирование образцов

  1. Инкубируйте образцы в течение 20 мин при 37 °C.
  2. Вращайте пластину при 16 000 х г в течение 5 мин при 4 °C.
  3. Поместите пластину на магнитную стойку с 96 лунками, дайте супернатанту очиститься в течение минимум 5 минут и перенесите супернатанты на свежую 96-луночную пластину. Выбросьте бусины.

9. Извлечение ДНК

  1. Добавьте 1 мкл 10% додецилсульфата натрия (SDS) и 0,83 мкл 20 мг/мл протеиназы K к каждому образцу.
    ВНИМАНИЕ: Порошок SDS вреден при вдыхании. Пользователи должны использовать в хорошо проветриваемых помещениях в очках, перчатках и респираторе класса N95, обращаясь с осторожностью.
  2. Перемешайте образцы путем бережного пипетирования.
  3. Инкубируйте образцы в течение 10 мин при 70 °C.
  4. Верните пластину к комнатной температуре и добавьте 46,6 мкл 5 M NaCl и 90 мкл 50% PEG 4000. Перемешать путем бережного пипетирования.
  5. Добавьте 33 мкл полистирол-магнетитовых шариков к каждому образцу и инкубируйте в течение 10 мин при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно доведите полистирол-магнетитовые шарики до комнатной температуры (~30 мин) и хорошо перемешайте перед использованием.
  6. Поместите пластину на магнитную стойку и дайте супернатанту очиститься в течение ~ 5 минут, а затем осторожно выбросьте супернатант, не нарушая бусины.
  7. Промыть 2x 150 мкл 80% этанола, не нарушая шарики.
    ВНИМАНИЕ: Этанол легко воспламеняется и вызывает раздражение кожи, глаз и легких. Выполните этот шаг с соответствующей лабораторной одеждой и в вентилируемом капюшоне.
  8. Вращайте пластину ненадолго при 1000 х г в течение 30 с. Поместите пластину обратно на магнитную стойку с 96 лунками и удалите все остатки EtOH, не нарушая бусины.
  9. Высушите образцы на воздухе в течение ~2-5 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не сушите бусины дольше 5 минут. Если вы усердно удаляете EtOH, достаточно 2-3 минут сушки.
  10. Повторно суспендировать шарики с 37,5 мкл 10 мМ Tris-HCl (рН 8) и инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
  11. Поместите пластину на магнитную стойку и дайте бусинам скрепиться в течение 5 минут.
  12. Перенесите 36,5 мкл супернатанта на свежую термоциклерную совместимую 96-луночную пластину. Выбросьте бусины.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперимент можно остановить здесь, сохранив образцы при -20 °C или продолжить сборку библиотеки (шаги 10-15).

10. Восстановление конца, фосфорилирование, аденилирование

ПРИМЕЧАНИЕ: Источники реагентов указаны в Таблице материалов. Приведенный ниже протокол следует методу, аналогичному коммерческому набору, такому как комплект NEBNext Ultra DNA II.

  1. Разбавить 5 ЕД/мкл ДНК-полимеразы Т4 1:20 в 1x T4 ДНК-лигазном буфере.
  2. Приготовьте конечную репарацию/3'А мастер-микс: 2 мкл 10x T4 ДНК-лигазного буфера, 2,5 мкл 10 мМ дНТФ, 1,25 мкл 10 мМ АТФ, 3,13 мкл 40% ПЭГ 4000, 0,63 мкл 10 ЕД/мкл Т4 ПНК, 0,5 мкл разбавленной ДНК-полимеразы Т4, 0,5 мкл 5U/мкл TAQ ДНК-полимеразы с общим объемом 13,5 мкл за реакцию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед пипеткой обязательно доведите 40% PEG 4000 до комнатной температуры.
  3. Добавьте 13,5 мкл концевой репарации/3'А мастер-микса к 36,5 мкл ДНК.
  4. Смешайте реакцию быстрым вихрем, а затем быстрым спином (500 х г в течение 10 с).
  5. Инкубировать с использованием следующих реакционных условий в предварительно охлаждаемом термоциклере с нагретой крышкой для температур >20 °C. Используйте реакционные условия: 12 °C в течение 15 мин, 37 °C в течение 15 мин, 72 °C в течение 20 мин, держать при 4 °C.

11. Перевязка адаптера

ПРИМЕЧАНИЕ: Держите образцы на льду, настраивая следующую реакцию. Дайте буферу лигазы достичь комнатной температуры перед пипеткой. Разбавляют адаптер (см. Таблицу материалов) в растворе 10 мМ Tris-HCl, содержащем 10 мМ NaCl (рН 7,5). Из-за низкой урожайности не стоит предварительно количественно оценивать ДНК, обогащенную CUT&RUN. Вместо этого генерируйте 25-кратное разбавление адаптера, используя конечную рабочую концентрацию адаптера 0,6 мкМ.

  1. Сделайте мастер-смесь лигирования: 55 мкл буфера лигазы (2x), 5 мкл ДНК-лигазы T4 и 5 мкл разбавленного адаптера с общим объемом 65 мкл на реакцию.
  2. Добавьте 65 мкл главной лигационной смеси к 50 мкл ДНК со стадии 10,5.
  3. Перемешать быстрым вихрем с последующим быстрым вращением (500 х г в течение 10 с).
  4. Инкубировать при 20 °C в термоциклере (без нагретой крышки) в течение 15 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Немедленно перейдите к следующему шагу.

12. Пищеварение ПОЛЬЗОВАТЕЛЯ

  1. Добавьте 3 мкл фермента USER к каждому образцу, вихрю и спину (500 х г в течение 10 с).
  2. Инкубировать в термоциклере при 37 °C в течение 15 мин (нагретая крышка установлена на 50 °C).

13. Очистка полистирол-магнетитовых шариков после реакции лигирования

ПРИМЕЧАНИЕ: Позвольте полистирол-магнетитовым шарикам уравновеситься при комнатной температуре (~30 мин). Вихрь для гомогенизации бисерного раствора перед использованием. Выполните следующие действия при комнатной температуре.

  1. Добавьте 39 мкл (0,33x) раствора полистирол-магнетитовых шариков в каждую скважину, содержащую ДНК, лигированную адаптером.
  2. Тщательно перемешайте путем пипетки, а затем инкубируйте образцы при комнатной температуре в течение 15 минут, чтобы ПОЗВОЛИТЬ ДНК связаться с шариками.
  3. Поместите образцы на магнитную стойку с 96 лунками и инкубируйте в течение 5 минут, пока супернатант не станет прозрачным.
  4. Держите пластину на магнитной стойке и осторожно снимите и выбросьте супернатант, не нарушая бусины.
  5. Промойте бусины 200 мкл 80% EtOH, не нарушая бусины.
  6. Инкубируйте в течение 30 с на магнитной стойке с 96 лунками, чтобы раствор очистился.
  7. Удалите и выбросьте супернатант, не потревожив бусины.
  8. Повторите шаги 13.5-13.7, чтобы выполнить в общей сложности две стирки.
  9. Вращайте пластину ненадолго при 500 x g в течение 10 с, поместите пластину обратно на магнитную стойку с 96 лунками и удалите остаточный EtOH, не нарушая бусины.
  10. Держите пластину на магнитной стойке и высушите образцы на воздухе в течение 2 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не пересушивайте бусины.
  11. Снимите пластину с магнитной стойки и повторно суспендируйте шарики в 28,5 мкл 10 мМ Tris-HCl (рН 8).
    ВНИМАНИЕ: Соляная кислота очень коррозионна. Пользователи должны обращаться с ним с осторожностью в химическом вытяжном капюшоне в очках, перчатках и лабораторном халате.
  12. Тщательно повторно суспендируйте бусины путем пипетки, следя за тем, чтобы не образовывались пузырьки.
  13. Инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
  14. Поместите пластину на магнитную стойку с 96 лунками и дайте раствору очиститься в течение 5 минут.
  15. Переложите 27,5 мкл супернатанта на новую пластину ПЦР и выбросьте шарики.

14. Обогащение библиотеки

ПРИМЕЧАНИЕ: Грунтовки разбавляют тем же раствором, что и адаптер. Для сборки этой библиотеки используйте конечную рабочую концентрацию праймера 0,6 мкМ.

  1. Добавьте 5 мкл разбавленной индексированной грунтовки (см. Таблицу материалов) к каждому образцу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый образец нуждается в отдельном индексе, который должен быть идентифицирован после виртуализации.
  2. Приготовьте мастер-смесь ПЦР: 10 мкл 5-кратного высокоточного ПЦР-буфера, 1,5 мкл 10 мМ дНТП, 5 мкл разбавленной универсальной грунтовки, 1 мкл 1 U высокоточной полимеразы горячего старта с общим объемом мастер-смеси 17,5 мкл на образец.
  3. Добавьте 17,5 мкл ПЦР-смеси к 32,5 мкл очищенной адапторно-лигированной ДНК (в этот объем включено 5 мкл индексированного праймера).
  4. Перемешать раствор путем пипетки.
  5. Инкубировать в термоциклере с использованием следующих условий реакции с максимальной скоростью рампы 3 °C/с: 98 °C в течение 45 с, 98 °C в течение 45 с, 60 °C в течение 10 с, повторить вторую и третью стадии 21 раз, 72 °C в течение 1 мин, держать при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы могут храниться при температуре 4 °C для краткосрочного хранения или -20 °C для длительного хранения.

15. Очистка полистирол-магнетитовых шариков

  1. Добавьте 60 мкл (1,2x) шариков полистирола-магнетита в каждый образец.
  2. Повторно суспендировать шарики путем пипетки и инкубировать в течение 15 мин при комнатной температуре.
  3. Поместите пластину на магнитную стойку на 5 минут, пока раствор не станет прозрачным.
  4. Выбросьте супернатант и промойте бусины 200 мкл 80% EtOH, не нарушая бусины.
  5. Повторите этап стирки в общей сложности для двух 80% стирок EtOH.
  6. Раскрутите пластину при 500 х г в течение 10 с, поместите пластину на магнитную стойку с 96 лунками и дайте бусинам связываться в течение 5 минут.
  7. Пипетка для удаления излишков EtOH, не нарушая бусин и дайте бусинам высохнуть на воздухе в течение 2 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не пересушивайте бусины.
  8. Повторно суспендировать шарики в 21 мкл воды без нуклеазы и инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
  9. Поместите пластину на магнитную стойку и дайте раствору очиститься в течение 5 мин.
  10. Перенесите 20 мкл супернатанта на новую пластину.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперимент можно остановить здесь, сохранив образец при -20 °C.
  11. Количественная оценка библиотечных концентраций с помощью флуорометра (см. Таблицу материалов) с использованием реагента HS 1x.
  12. Если концентрация позволяет, запустите 30 нг образца на 1,5% агарозном геле с низкомолекулярной лестницей для визуализации. Кроме того, можно визуализировать на анализаторе фрагментов или связанном инструменте.
  13. Библиотеки последовательностей на платформе Illumina для получения ~50 000-100 000 уникально сопоставленных операций чтения.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь представлен подробный протокол профилирования одноклеточного белка на хроматине с использованием 96-луночного ручного формата uliCUT&RUN. Хотя результаты будут варьироваться в зависимости от профилируемого белка (из-за обилия белка и качества антител), типа клеток и других способствующих факторов, ожидаемые результаты для этого метода обсуждаются здесь. Качество клеток (внешний вид клеток и процент жизнеспособных клеток) и сортировка одиночных клеток должны быть оценены до или во время сортировки живых клеток в...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CUT&RUN является эффективным протоколом для определения локализации белка на хроматине. Он имеет много преимуществ по сравнению с другими протоколами, в том числе: 1) высокое отношение сигнал/шум, 2) быстрый протокол и 3) низкое покрытие секвенирования считывания, что приводит к экономии средств. Использование белка A- или белка A/G-MNase позволяет применять CUT&RUN с любым доступным антителом; поэтому он обладает потенциалом для быстрого и легкого профилирования многих белков. Однако адаптация к одноклеточному профилиро...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов, связанных с этим проектом.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим членов Лаборатории Хайнера за чтение и комментарии к более ранней версии этой рукописи. Этот проект использовал NextSeq500, доступный в Университете Питтсбурга Health Sciences Sequencing Core в детской больнице UPMC в Питтсбурге для секвенирования с особой благодарностью его директору Уильяму Макдональду. Это исследование было частично поддержано Центром исследовательских вычислений Университета Питтсбурга через предоставленные компьютерные ресурсы. Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения Номер гранта R35GM133732 (S.J.H.).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,5 мл прозрачные микрофуговые пробиркиThermoFisher Scientific90410
магнитный штатив для пробирок 1,5 млThermoFisher Scientific12321D
1,5 мл совместимые с тубами холодные центрифугиEppendorf5404000537
10 см стерильные планшеты для культивирования тканейThermoFisher Scientific150464
10X T4 ДНК-лигаза буферНовый England BiolabsB0202S
15 мл конические пробиркиVWR89039-656
1X TE буферThermoFisher Scientific12090015
200 &; L ПЦР-пробиркиEppendorf951010022
2X быстрый лигазный буферNew England BiolabsM2200Лигазный буфер
5X KAPA HiFi буферRoche79588890015X высокоточный ПЦР-буфер
7-амино-актиномицин D (7-AAD)Fisher ScientificBDB559925
96-луночный магнитный штативThermoFisher Scientific12027 или 12331D
96-луночная пластинаVWR82006-636
АМПурные бусины XPBeckman CoulterA63881полистирольно-магнетитовые бусины; Из-за возможных различий между партиями валиков AMPure XP рекомендуется откалибровать раствор для валиков AMPure. Смотреть продукцию производителя s инструкции
Антитела к интересующему белкуварьируются
АТФThermoFisher ScientificR0441
BioMag Plus Concanavalin A шарикиPolysciences86057-10ConA-сопряженные парамагнитные микросферы
BSA
Хлорид кальция (CaCl2)Fisher ScientificAAJ62905AP
Сортировщик клетокBD FACSAria IIТребуется обучение
Специфичная для клеток среда для клеточной культурыВарьируется
ХлороформThermoFisher ScientificC298-500Хлороформ является раздражителем кожи и вреден при проглатывании; обращайтесь в вытяжном шкафу с химическими веществами, используя перчатки, лабораторный халат и очки
Компьютер с 64-битным процессором и доступом к суперкомпьютерному кластеруДля вычислительного анализа результирующих наборов данных секвенирования
Спиновые колонкиДНК Epoch Life Sciences1920-250
dNTP наборNew England BiolabsN0446S
EGTASigma AldrichE3889
Оборудование для электрофорезаварьируется
этанолFisher Scientific22032601100% об/об. этанол легко воспламеняется; обращаться в химическом вытяжном шкафу с использованием перчаток, лабораторного халата, и очки
этилендиаминтетрауксусная кислота  (ЭДТА)Fisher ScientificBP2482100
FBSSigma AldrichF2442
ГлицеринFisher ScientificBP229-1
ГликогенVWR97063-256
HEPESFisher ScientificBP310-500
Гетерологичный S. cerevisiae DNA спайк вдомашних условияхПолучен из сшитой, расщепленной МНазой и экстрагированной агарозным гелем геномной ДНК, очищенной от белка/РНК и разбавленной до 10 нг/мл. Мы рекомендуем использовать геномную ДНК дрожжей, но при необходимости можно использовать и другие организмы.
Соляная кислота  (HCl)Соляная кислота Fisher ScientificA144-212очень агрессивна; обрабатывайте в вытяжном шкафу с использованием перчаток, лабораторного халата и очков
Ведро для льдаварьирует
платформу секвенирования Illumina (например, NextSeq500)Инкубатор Illumina
с контролем температуры и атмосферыThermoFisher Scientific51030284
KAPA HotStart HiFi ДНК-полимераза с 5X KAPA HiFi буферомRoche7958889001горячей пусковой высокоточной полимеразой
Ламинарный проточный колпакBakery CompanySG404
Хлорид марганца (MnCl2)Sigma Aldrich244589
набор микропипетокRainin30386597
MinifugeBenchmark ScientificC1012
NEB AdaptorNew England BiolabsE6612AVIALAdaptor
NEB Universal PrimerNew England BiolabsE6611AVIALUniversal Primer
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina kitNew England BiolabsE7335S/L, E7500S/L, E7710S/L, E7730S/LИндексированные праймеры
Отрицательный контроль антителАнтитела-онлайнABIN101961
Вода без нуклеазыEngland BiolabsB1500S
ПЦР ТермоциклерEppendorf2231000666
Phase lock tubesQiagen129046
фенол/хлороформ/изоамиловый спирт (ЧКВ)ThermoFisher Scientific15593049Фенол вреден при проглатывании или при контакте с кожей; обращайтесь в вытяжном шкафу с химическими веществами в перчатках, лабораторном халате и защитных очках
Фосфатный солевой буфер (PBS)ThermoFisher Scientific10814010
ПипеткаDrummond Scientific# 4-000-100
Полиэтиленгликоль (PEG) 4000VWRA16151
Хлорид калия (KCl)Sigma AldrichP3911
Гидроксид калия (KOH)Fisher ScientificP250-1ВНИМАНИЕ: KOH является раздражителем для глаз / кожи в виде твердого и коррозионного раствора. Обращайтесь в вытяжной шкаф с химическими веществами в перчатках, лабораторном халате и защитных очках
Ингибиторы протеазыThermoFisher Scientific78430
ProteinA/G-MNaseEpicypher15-1016pA/G-MNase
ProteinA-MNase, очищенная из pK19pA-MNAddgene86973
Proteinase KNew England BiolabsP8107S
Qubit 1X dsDNA HS Набор дляанализаПробиркиQ33230
Флуориметр для кубитовThermoFisherQ32856
Quick Ligase с буфером 2X Quick LigaseM2200S
РНКаза ANew England BiolabsT3010
(NaOAc)ThermoFisher ScientificBP333-500
Sodium Chloride (NaCl)Sigma AldrichS5150-1L
Sodium Dodecylsulfate (SDS)ThermoFisher ScientificBP166-500SDS ядовит при вдыхании; обращайтесь с осторожностью в хорошо проветриваемых помещениях с использованием перчаток, защиты глаз и респиратора класса N95 при работе с
гидроксидом натрия (NaOH)Fisher ScientificS318-1NaOH является раздражителем для глаз и кожи в виде твердого и коррозионного раствора. Обращение в вытяжном шкафу для химических веществ с использованием перчаток, лабораторного халата и защитных очков
СпермидинSigma AldrichS2626
Стандартный микроскоп с инвертированным светомLeica11526213
Стандартные лабораторные материалы для агарозного геляВарьируются
Стандартные лабораторные материалы, такие как серологические пипетки и наконечники для пипетокВарьируются
T4 DNA LigaзаНовинка England BiolabsM0202S
T4 ДНК-полимеразаNew England BiolabsM0203S
T4 PNKNew England BiolabsM0201S
Настольный вихревой аппаратFisher Scientific2215414
Taq DNA PolymeraseNew England BiolabsM0273S
ТермомиксерEppendorf5384000020Альтернатива, можно использовать водяную баню
Tris baseFisher ScientificBP152-5
Triton X-100Sigma Aldrich9002-93-1Triton X-100 опасно; использовать лабораторный халат, перчатки и очки при работе с
трипсиномFisher ScientificMT25052
Tube rotatorVWR10136084
USER ферментNew England BiolabsM5505S
New для анализа кубитов ThermoFisher Scientific Scientific Флуориметр для кубитов ThermoFisher Scientific Q33238 Ацетат натрия 

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gilmour, D. S., Lis, J. T. In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster. Molecular and Cellular Biology. 5 (8), 2009-2018 (1985).
  2. Solomon, M. J., Varshavsky, A. Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (19), 6470-6474 (1985).
  3. Irvine, R. A., Lin, I. G., Hsieh, C. -L. DNA methylation has a local effect on transcription and histone acetylation. Molecular and Cellular Biology. 22 (19), 6689-6696 (2002).
  4. Albert, I., et al. Translational and rotational settings of H2A.Z nucleosomes across the Saccharomyces cerevisiae genome. Nature. 446 (7135), 572-576 (2007).
  5. Blat, Y., Kleckner, N. Cohesins bind to preferential sites along yeast chromosome III, with differential regulation along arms versus the centric region. Cell. 98 (2), 249-259 (1999).
  6. Ren, B., et al. Genome-wide location and function of DNA binding proteins. Science. 290 (5500), 2306-2309 (2000).
  7. Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution. Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).
  8. He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints. Nature Biotechnology. 33 (4), 395-401 (2015).
  9. O'Neill, L. P., Turner, B. M. Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP. Methods. 31 (1), 76-82 (2003).
  10. Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors. Nature Methods. 12 (10), 963-965 (2015).
  11. Cao, Z., Chen, C., He, B., Tan, K., Lu, C. A microfluidic device for epigenomic profiling using 100 cells. Nature Methods. 12 (10), 959-962 (2015).
  12. Shankaranarayanan, P., et al. Single-tube linear DNA amplification (LinDA) for robust ChIP-seq. Nature Methods. 8 (7), 565-567 (2011).
  13. Rotem, A., et al. Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state. Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).
  14. Grosselin, K., et al. High-throughput single-cell ChIP-seq identifies heterogeneity of chromatin states in breast cancer. Nature Genetics. 51 (6), 1060-1066 (2019).
  15. Adli, M., Bernstein, B. E. Whole-genome chromatin profiling from limited numbers of cells using nano-ChIP-seq. Nature Protocols. 6 (10), 1656-1668 (2011).
  16. Zwart, W., et al. A carrier-assisted ChIP-seq method for estrogen receptor-chromatin interactions from breast cancer core needle biopsy samples. BMC Genomics. 14, 232(2013).
  17. Valensisi, C., Liao, J. L., Andrus, C., Battle, S. L., Hawkins, R. D. cChIP-seq: a robust small-scale method for investigation of histone modifications. BMC Genomics. 16, 1083(2015).
  18. Brind'Amour, J., et al. An ultra-low-input native ChIP-seq protocol for genome-wide profiling of rare cell populations. Nature Communications. 6, 6033(2015).
  19. Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. C. hI. C. ChlC and ChEC; genomic mapping of chromatin proteins. Molecular Cell. 16 (1), 147-157 (2004).
  20. Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo. Nature Communications. 6, 8733(2015).
  21. Skene, P. J., Henikoff, S. An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites. eLife. 6, 21856(2017).
  22. Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. Improved CUT&RUN chromatin profiling tools. eLife. 8, 46314(2019).
  23. Hainer, S. J., Bošković, A., McCannell, K. N., Rando, O. J., Fazzio, T. G. Profiling of pluripotency factors in single cells and early embryos. Cell. 177 (5), 1319-1329 (2019).
  24. Kaya-Okur, H. S., et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nature Communications. 10 (1), 1930(2019).
  25. Carter, B., et al. Mapping histone modifications in low cell number and single cells using antibody-guided chromatin tagmentation (ACT-seq). Nature Communications. 10 (1), 3747(2019).
  26. Gopalan, S., Wang, Y., Harper, N. W., Garber, M., Fazzio, T. G. Simultaneous profiling of multiple chromatin proteins in the same cells. Molecular Cell. 81 (22), 4736-4746 (2021).
  27. Patty, B. J., Hainer, S. J. Transcription factor chromatin profiling genome-wide using uliCUT&RUN in single cells and individual blastocysts. Nature Protocols. 16 (5), 2633-2666 (2021).
  28. Zheng, X. -Y., Gehring, M. Low-input chromatin profiling in Arabidopsis endosperm using CUT&RUN. Plant Reproduction. 32 (1), 63-75 (2019).
  29. Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
  30. Buenrostro, J. D., et al. Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation. Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Cell CUT RUNChromatin Protein LocalizationUltra Low InputTranscription Factor ProfilingChromatin ImmunoprecipitationAntibody TetheringProtein A MNase96 Well FormatDNA ExtractionEmbryonic Stem Cells

Related Articles