Разработка противовирусных агентов с помощью поверхностного плазмонного резонанса

Тетерин-ассоциированная противовирусная активность индуцируется интерферон-α, и она содержит тросы на белковой основе, что приводит к удержанию полностью сформированных вирионов на инфицированных клеточных поверхностях¹. Необходимость гликозилирования тетерина в ингибировании высвобождения вируса остается неопределенной, что подразумевает важность паттернов гликозилирования на рекомбинантно выраженных гликанах для исследований in vitro ^1,2, которая зависит от конформации (в случае вируса гриппа) поверхностно экспрессированного гемагглютинина гриппа HA ^3,4 . Отмечено, что модификации олигосахарида, привязанного к N-сцепленному гликозилированию, достаточно для тетерин-опосредованного ограничения высвобождения ВИЧ типа 1², в то время как димеризация играет существенную роль в предотвращении высвобождения вируса, тем самым вовлекая трансмембранный домен или гликозил-фосфатидил-инозитол (GPI)-якорь для привязки почковых вирионов⁵ . Описаны уникальные особенности человеческого и мышиного тетерина, блокирующего множественные оболочки вирусов, ретровирусов и филовирусов. BST-2/tetherin представляет собой интерферон-индуцируемый противовирусный белок врожденного иммунитета ^1,6, действующий с широкой противовирусной активностью и антагонизированный оболочкой гликопротеинов⁵ с целью либо транслоцировать тетерин, либо нарушить структуру тетерина⁶. Например, поверхностно-экспрессированный гликопротеин оболочки ГК и нейраминидаза на вирусе гриппа А хорошо известны антагонизмом тетерина специфическим для штамма способом⁷, облегчающим распознавание сайтов связывания рецепторов хозяина⁸. Антитела, нацеленные на гликаны, изучаются в стехиометрии их взаимодействия с быстро настраиваемыми гликкановыми щитами на ГК, что приводит к сродству связывания с подтипами гриппа A H3N2 и H1N1⁴.

Для выяснения механизмов связывания между противовирусными агентами и шипами оболочки вируса, т.е. углеводными лигандами, и комплементарными иммунологическими и спектроскопическими методами химически синтезируют моно-, ди- и триманнозные фрагменты. Маннозилированные пептиды создаются путем азидо-гликозилирования гликозил {бета}-перацетатов до трансформации 1,2-транс-гликозилазидов⁹, имитируя обычно встречающиеся N-ацетилглюкозамин и олигосахариды с высоким содержанием маннозы на поверхности опасных для жизни вирусов. Биоизостеры триазола используются для имитации связей, которые образуют маннозилированный остаток пептида ГК¹⁰ и облегчают сайт-специфические взаимодействия с противовирусными производными CV-N вокруг второго N-связанного пятна гликозилирования на головном домене ГК (вершина ГК с 4 N-связанными гликанами N54, N97, N181, N301)^8,11,12 . Взаимодействия между глутаминовой кислотой (Glu) и аргинином (Arg) и полученным в результате диполем спирали проявили хорошую стабильность как модельных пептидов, так и белков, но визуализируются с использованием SPR. Если сравнивать с распознаванием одного химически синтезированного участка гликозилирования на^ГК-10 путем прямого ингибирования связывания рецепторов на фрагментах гликана, более высокое сродство четырехсайтовой мутированной структуры Fc к его рецептору, как показано, вызывает эффекторные функции in vivo, выявляя несвязанный состав N-связанных гликанов, прикрепленных к мутанту Fc, который механически детерминирован¹³.

CV-N проявляет противовирусную активность в отношении ВИЧ^14,15, гриппа¹⁶ и вируса Эбола, которая опосредована наномолярным связыванием с высокоманнозными олигосахаридными модификациями на белках оболочки 12,17,18,19. Связывание ГК гриппа с одним высокоаффинным углеводсвязывающим сайтом (H) в CV-N или двумя Hs в ковалентно связанном димерном CVN2 определяется как имеющее равновесные константы диссоциации (K_D) = 5,7 нМ (рисунок 1A) и K_D = 2,7 нМ соответственно. И CV-N, и CVN2 содержат еще один или два низкоаффинных сайта связывания углеводов (L) 12,17,20,21. Эбола GP1,2 связывается с 2H CVN2 со сродством в нижнем наномолярном диапазоне (K_D = 26 нМ). Связывание CV-N WT с Эболой GP1,2 и HA проявляет сродство от K_D = 34 нМ к K_D = 5,7 нМ (A/New York/55/04)¹². Лектины, такие как CV-N, которые специально нацелены на гликаны с высоким содержанием маннозы на вирусных оболочках, дополнительно ингибируют репликацию вируса гепатита С, SARS-CoV, герпесвируса, вируса Марбурга и вируса кори²².

Небольшая молекула CV-N тщательно изучается более 20 лет, поскольку она функционализируется для связывания широкого спектра вирусов для ингибирования проникновения вируса ^16,18. Структурный анализ и анализы сродства связывания указывают на сшивание двух Ls в димере CVN2 с заменой домена путем двухвалентного связывания в микромолярном диапазоне для повышения авидности к гликопротеинам вирусной оболочки^10,19. Селективное связывание Manα1-2Manα на руках Man(8) D1D3 и Man(9) содержит два сайта связывания различного сродства, расположенных на противоположных белковых протомерах²⁰, тем самым достигая сродства к наномолярному связыванию (фиг.1B). Таким образом, CVN2 считается псевдоантителом относительно его применения для связывания эпитопов на ВИЧ gp120, аналогично вируснейтрализующим антителам¹⁷. При этом автор заинтересован в исследовании потенциального связывания CVN2 с всплеском SARS-CoV-2 через его рецептор-связывающий домен (RBD). Кривые связывания иммобилизованного человеческого ангиотензинпревращающего фермента (АПФ)-2 с RBD SARS-CoV-2 приводят к K_D = 4,7 нМ для этого биологически значимого связывающего взаимодействия²³.

Напротив, выбранные классы иммуноглобулинов распознают специфические и последовательные структурные белковые паттерны, которые придают субстрат для созревания аффинности в мембранно-анкерных областях^{ГК 24}. CV-N проявляет высокую мощную активность почти у всех вирусов гриппа А и В¹⁶ и является широко нейтрализующим противовирусным средством. Наши знания являются неполными о расположении целевых эпитопов на стволе HA1 и HA2, которые, возможно, включают эпитопические структуры для нацеливания на гликаны с помощью высоконейтрализующих антител и по сравнению с связыванием лектина²⁵.

Рисунок 1: Схематическое представление анализа связывания SPR для CV-N с всплесками оболочки вируса. (A) SPR Анализ для связывания CV-N с лигандом: полноразмерный белок HA (90 кДа). Набор кинетических данных (5120, 2560, 1280, 640, 320, 160, 80, 40, 20, 10, 5, 2,5, 0 нМ), показывающий двойное связывание в реальном времени с гриппом HA A/New-York/55/04 (H3N2). (B) CVN2L0 вариант V2 связывание с иммобилизованным лигандом DM в диапазоне концентраций от 500 нМ до 16 мкМ. Последовательность: L остатки выделены желтым цветом. Остатки H выделены серым цветом. E58 и R73 являются заменой цистеинов в белке дикого типа и делают V2 стабильной белковой складкой с тремя вместо четырех дисульфидных связей Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

В то время как гликановый щит на мембранно-дистальной верхней части ГК индуцирует высокоаффинное связывание с CV-N¹², связывание CVN2 с ГК, прилегающее к дисульфидному мосту верхней части ГК, также наблюдалось на его участках с низким сродством ^10,12. Различные полярные взаимодействия и сайты взаимодействия идентифицируются в углеводном связывании CV-N. Эти взаимодействия проверяются путем генерации нокаутирующих вариантов в месте связывания для корреляции сродства связывания с in silico предсказанным гликозилированием¹². Таким образом, проект направлен на сравнение ранее протестированных химически маннозилированных пептидов ГК в сродстве связывания и специфичности с короткими пептидными последовательностями из связанных с SARS всплесков 2019-nCoV и SARS-CoV-2, встречающихся в природе, модифицированных небольшим количеством различных N-связанных сайтов гликозилирования и O-связанного гликозилирования. Используя криоэлектронную микроскопию и связывающие анализы, Пинто и его коллеги сообщают о моноклональном антителе S309, которое потенциально распознает эпитоп на спайковом белке SARS-CoV-2, содержащем сохраненный гликан в подроде sarbecovirus, не конкурируя с рецепторным присоединением²⁶. Протокол этого исследования описывает, как проектирование, экспрессия и характеристика вариантов CV-N важны для изучения того, как CV-N и CVN2 связываются с гликозилированными белками и синтетическими маннозилированными пептидами с использованием технологии SPR^10,12.

Тандем-связанный димер CVN2L0²⁷ и варианты сайта связывания (V2-V5) рекомбинантно экспрессированы, а варианты с заменами дисульфидных связей (C58E и C73R) (рисунок 2A). Кроме того, мутант с одноточечной мутацией E41A получают, потому что это положение рассматривалось как межмолекулярный перекрестно-контактирующий остаток. Этот мутант является еще одной интересной молекулой для измерений связывания SPR между лектином и высокоманнозными олигосахаридами, расшифровывающими связывающие домены, и позволяет сравнивать с димерной формой. Кристаллическая структура CVN2 с заменой домена показывает гибкий компоновщик, который простирается от 49 до 54 остатков. Два домена могут продолжать двигаться вокруг шарнира в виде твердых тел, развивая либо мономер через внутримолекулярные доменные взаимодействия (домен A -остатки 1-39;90-101- с доменом B -остатки 40-89), либо димер путем межмолекулярной замены домена [домен A (первого мономера) с доменом B (второго) и домен B (первого мономера) с доменом A (второй копии)]. Между доменами A и B двух протомеров нет тесных взаимодействий, за исключением Glu41²⁸. Ген CV-N может быть разработан с использованием повторяющегося метода ПЦР с 40-мерным синтезированным олигосом²⁹ и затем субклонирован в NdeI и BamHI участки pET11a для преобразования (электропорации) в электрокомпетентные клетки, как описано Keeffe, J.R.27. Белок, который используется для достижения соответствующей кристаллической структуры (PDB ID 3S3Y), включает N-концевую метку очистки 6-гистидина, за которой следует участок расщепления протеазы фактора Xa. Сайт-направленный мутагенез используется для создания точечных мутаций, переключения кодонов и вставки или удаления одного или нескольких оснований или кодонов для обмена аминокислотами. Эти превращения дают бесценное представление о функции и структуре белка. Рекомбинантно экспрессированные и очищенные CV-N, CVN2 и CVN3 были биофизически хорошо изучены ^20,21,27, дешевы в производстве и, следовательно, используются для характеристики анализов связывания с гликанами, иммобилизованными на чипах датчиков SPR. Обычный иммуноферментный анализ (ИФА) обеспечивает меньшую воспроизводимость в отношении метода иммобилизации лигандов гликана и преобразует связывание в реальном времени различных вариантов сайта связывания, что показано для SPR, в анализы конечных точек.

Связывающе-аффинный вариант CVN2L0-V2 (неповрежденная складка гомодимерного CV-N с замещением дисульфидного моста¹⁰) экспрессируется His-меткой в Escherichia coli (E. coli), очищенной над колонкой Ni-NTA с применением аффинной хроматографии и проверенной на связывание с HA (H3N2), мономаннозилированным HA-пептидом и диманнозилированным HA-пептидом с использованием SPR. Химически маннозилированные пептиды, или белок HA и S, все они являются лигандами и амином, связанными с гидрофильной поверхностью чипа через реактивные сложные эфиры или биотин-стрептавидиновую белковую инженерию. Та же процедура последовательных запусков применяется к этим лигандам, вводя различные разведения CV-N и варианты CV-N (и CVN2) для получения кинетической информации для анализа молекулярного взаимодействия, как описано ниже³⁰. RBD-иммобилизованный сенсорный чип SPR используется для исследований связывания пептидов CV-N в S, а сродство сравнивается с связыванием SARS-CoV-2 с ЧЕЛОВЕЧЕСКИМ ACE2.

Для настоящего исследования CVN-малый убиквитин-подобный модификатор (SUMO) слитый белок был использован в иммуноферментных анализах вместо CV-N и подходит для клеточных анализов. Рекомбинантный полноразмерный белок вируса гриппа А HA H3 получают коммерчески (см. Таблицу материалов) или экспрессируют в клеточных линиях HEK293 млекопитающих и инфицированных бакуловирусом клетках насекомых в соответствии со стандартными протоколами¹². Спайковый белок Wuhan-1 экспрессируется в клетках HEK293 млекопитающих. Синтез мономаннозилированного пептида (ММ) и диманнозилированного пептида (СД) позволяет обнаруживать гомогенные лиганды к CVN2 и мономаннозилированной малой^{молекуле 10}.

1. Создание конструкций CV-N

1. Для каждого из вариантов CVN2 и белка CVN2L0 (PDB ID 3S3Y) получите генную конструкцию с N-концевой ведущей последовательностью pelB и His-tag в векторе pET27b(+) из коммерческих источников (см. Таблицу материалов, дополнительный файл 1).
2. Получите CVN2L0 и его варианты (V2, V3, V4 и V5; Рисунок 2A,C) на фоне гена шаблона CVN2L0, состоящего из двух различных последовательностей ДНК для каждого повтора CV-N.
3. Растворить лиофилизированную плазмидную ДНК в стерильной деионизированной дистиллированной воде (ddH₂O) до конечной концентрации 100 нг/мкл.

2. Получение пластин LB-агара с плазмидными ДНК-трансформированными клетками

1. Приготовьте культуральную среду LB-Lennox, растворив 10 г/л пептона, 5 г/л дрожжевого экстракта и 5 г/л NaCl в ddH₂O (см. Таблицу материалов), и отрегулируйте рН до 7,4. Выполняют преобразование в компетентную Кишечную палочку BL21 (DE3) для каждого варианта (V2-V5) химическим методом в соответствии с ранее опубликованным отчетом¹⁰.
2. Разделите раствор (900 мкл и 100 мкл), переложите 100 мкл на пластины LB-агара (50 мкг/мл канамицина) и осторожно используйте стерильный клеточный распределитель. Инкубировать агаровые пластины в течение ночи при температуре 37 °C.

3. Клонирование

1. Субклонируйте ген CV-N в NdeI и BamHI участки pET11a (см. Таблицу материалов) для преобразования (электропорации) в электрокомпетентные клетки по ссылке²⁷.

4. Мутагенез, направленный на сайт

1. Генерировать CVN2L0²⁹ и мутантный CVN-E41A на фоне гена шаблона CVN2L0, содержащего две различающиеся последовательности ДНК для каждого CV-N^{повтора 27}.
2. Производят мутации с помощью набора мутагенеза, направленного на сайт (см. Таблицу материалов) и специфических мутагенных праймеров 5'-gagaaccgtcaacgtttgcgataacagagttcagg-3' и 5'-cctgaactctgttatcgcaaacgttgacggttctc-3' для запуска ПЦР³¹.
   1. Начните серию пробных реакций с использованием многократных концентраций шаблона двухцепочечной ДНК (дцДНК) в диапазоне от 5 до 50 нг (например, 5, 10, 20 и 50 нг шаблона дцДНК). Держите концентрацию грунтовки постоянной.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно используется протокол ПЦР-смеси и термоциклирования, как описано в руководстве по эксплуатации для набора³² для мутагенеза, направленного на сайт.
3. Добавьте фермент рестрикции Dpn I (1 мкл, 10 Ед/мкл, см. Таблицу материалов) под наложением минерального масла. Тщательно и осторожно перемешайте реакции, открутите в настольной микроцентрифуге в течение 1 мин и сразу же инкубируйте при 37 °C в течение 1 ч для переваривания родительской суперспиральной дцДНК.

5. Трансформация бактериальных клеток

1. Аккуратно разморозьте сверхкомпетентные ячейки XL1-Blue (см. Таблицу материалов) на льду. Для преобразования каждой контрольной и пробной реакции аликвотируют сверхкомпетентные клетки (50 мкл) в предварительно охлажденную полипропиленовую трубку круглого дна (14 мл).
   1. Перенос 1 мкл обработанной Dpn I одноцепочечной ДНК (ssDNA) из каждой контрольной реакции и реакции образца (мутированной ssDNA) в отдельные аликвоты сверхкомпетентных клеток, которые синтезируют комплементарную цепь. Тщательно закрутите реакции трансформации, чтобы перемешать и инкубировать реакции на льду в течение 30 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед переносом ДНК, обработанной Dpn I, в реакцию трансформации рекомендуется осторожно удалить оставшееся минеральное масло из кончика пипетки. В качестве дополнительного элемента управления эффективность трансформации суперкомпетентных клеток XL1-Blue необходимо проверить путем смешивания 0,1 нг/мкл управляющей плазмиды pUC18 (1 мкл) с аликвотой 50 мкл суперкомпетентных клеток.
2. Применяют тепловой импульс к реакциям превращения при 42 °С в течение 45 с, а затем помещают реакции на лед на 2 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Применяемый тепловой импульс уже оптимизирован для указанных условий в полипропиленовых трубках круглого дна (14 мл).
3. Добавить 0,5 мл бульона NZY+ (содержащего на литр: 10 г амина NZ (гидролизат казеина), 5 г дрожжевого экстракта, 5 г NaCl, 12,5 мл 1 M MgCl₂, 12,5 мл 1 M MgSO₄, 10 мл 2 М глюкозы, рН 7,5 и предварительно нагретый до 42 °C) и инкубировать реакции трансформации при 37 °C с встряхиванием при 225-250 об/мин в течение 1 ч. На пластинах LB-ампициллина агар на пластинах LB-ампициллина агара наносится правильный объем каждой реакции трансформации (5 мкл от контрольной плазмиды; 250 мкл от трансформации образца).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для контроля трансформации и мутагенеза распространяются клетки на пластины агарового агарового LB-ампициллина, имеющие 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-галактопиранозид (X-галлон, 80 мкг/мл) и изопропил-1-тио-β-D-галактопиранозид (IPTG, 20 мМ) (см. Таблицу материалов). Инокулируют 50 мл клеточных культур одной колонией трансформированного Е. клетки кишечной палочки для очистки мутировавшей плазмидной ДНК для анализов. Мутагенез подтверждается секвенированием ДНК на внешнем объекте.

6. Экспрессия и очистка белка

1. Для крупномасштабной культуры инокулируют небольшое количество LB (содержащего ампициллин) одной колонией из преобразованной пластины.
2. Используя культуру на ночь, инокулируют экспрессионную культуру добавками, такими как 10 мМ MgCl₂, 10 мМ MgSO₄ и 20 мМ глюкозы, разбавляя семенную культуру до 1/100.
   1. Выращивайте клетки с энергичным встряхиванием при 37 °C. Вырастите клетки до ABS 600 нм между 0,4-0,6 (средняя фаза log) перед охлаждением клеток до 20 °C. Индуцировать с 1 мМ IPTG и расти в течение ночи.
   2. Затем собирают клетки путем центрифугирования при 4000 х г в течение 15 мин при 4 °C и выбрасывают супернатант с пипеткой.
3. Повторное суспендирование клеточной гранулы в фосфат-буферном солевом (PBS) буфере и повторной центрифуге при 4000 х г в течение 15 мин при 4 °C. Затем выбросьте супернатант с помощью пипетки. Повторно суспендируют оставшуюся гранулу в 10 мл лизисного буфера и инкубируют суспензию в течение 1 ч при 37 °С.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Состав лизисного буфера: (50 мМ₂PO₄, 300 мМ NaCl, 2% тритон-X100, 500 нг/мл лизоцима, 1 мМ фенилметилсульфонилфторида (PMSF), 1 мМ дитиотрейтола, 1 мМ_MgCl2, рН 8, см. Таблицу материалов).
   1. Подвергайте смесь двум циклам замораживания-оттаивания (-80 °C). Разделяйте растворимые и нерастворимые фракции центрифугированием при 4000 х г в течение 15 мин при 4 °C и анализируйте их с помощью электрофореза полиакриламидного геля (PAGE), в частности, додецилсульфата натрия (SDS)-PAGE³³ (рисунок 2B, C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки могут быть лизированы несколькими способами, такими как замораживание-оттаивание, обработка ультразвуком, гомогенизация, ферментативный лизис или комбинация этих методов. Очищение от органов включения рекомендуется для сбора высоких белковых выходов²⁶.
4. Очищайте белки с помощью колоночной хроматографии Ni-NTA (см. Таблицу материалов). Загрузите растворимую фракцию в регенерированную колонку ni-NTA (1 мл/мин). Промывайте систему буфером TBS (50 мМ Tris, 150 мМ хлорида натрия, рН 7,5) перед запуском градиента (0-100% 500 мМ имидазола в TBS в течение 60 мин) и сбора фракций (1 мл/мин). Диализируйте очищенные белки для биохимической характеристики против 100 мМ PBS (рисунок 2C,D).
5. Альтернативно, используйте гегель сродства His-Select Ni²⁺ (см. Таблицу материалов) в пробирках по 14 мл для связывания и повторной приостановки его меченого рекомбинантно экспрессированного CV-N в буферных растворах с имидазолом 20 мМ и имидазолом 250 мМ соответственно. Инкубировать порционно не менее 30 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Применяют эти полуочищенные белки к одноразовой предварительно упакованной колонке для буферного обмена и очистки биологических образцов, например, углеводов и белков, которые могут загружать элюат 1-1,5 мл из иммобилизованной аффинной хроматографии металлов.
6. Переложите белковые растворы в центрифугирующие трубки с отсечным фильтром 10 кДа (см. Таблицу материалов) и концентрируйте их центрифугированием в течение 10 мин при 4 500 х г и 4 °C. Для измерений SPR замените растворы анализируемого вещества на 10 мМ HEPES, 150 мМ хлорида натрия, 3 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и 0,05% Tween20, рН 7,4 (HBS-EP(+), см. Таблицу материалов).
   1. Добавьте этот рабочий буфер SPR к коэффициенту разбавления 1:10 и центрифугу четыре раза к исходному объему в течение 10 мин при 4 500 х г и 4 °C.
7. Определить концентрацию белка при 280 нм с помощью спектрофотометра NanoDrop UV-Vis (см. Таблицу материалов) на основе расчетного коэффициента вымирания (20 440 ^{М-1 см-1}) для основного белка CVN2L0, показывающего размер 23 474 Da³⁴. Используйте PBS (100 мМ, pH 7,0) или буфер SPR в качестве заготовки и измерьте концентрацию белка на трех этапах разведения (1:1, 1:10 и 1:100).

Рисунок 2: Последовательности и экспрессия CV-N. (A) CVN2 без связующего звена между каждым cv-N-повтором (по 101 аминокислоте в каждом) и четырьмя дисульфидными мостиками выражается в векторе pET11a в E. кишечная палочка. (B) Выражения двух независимых колоний для CV-N (мономер) и CVN2 (димер). (C) Варианты дисульфидных связей очищаются и анализируются на SDS-PAGE. В качестве эталона используется низкомолекулярный маркер (6 мкл). WT = CVN2L0, несущий четыре дисульфидных моста с маркировкой (A). V2 представляет собой вариант с заменой дисульфидной связи полярными остатками в положениях 58 и 73. V3-V5 представляют собой варианты с двумя оставшимися S-S связями и либо полярными (C58E-C73R), либо неполярными (C58W-C73M), заменяющими аминокислоты, либо комбинацией этих замен этих остаточных пар. (D) ВЭЖХ-хроматограммы очищенного CVN2L0 элюируют со скоростью потока 1 мл/мин с линейным градиентом от 5%-65% буфера B в буфере A в течение 30 мин. Буфер A составляет: 0,1% (v/v) трифторуксусной кислоты в ddH_2O, буфер B составляет: 0,08% (v/v) трифторуксусной кислоты в ацетонитриле. Белок анализируют на высокоэффективном силикагеле 300-5-С4 (150 х 4,6 мм) колонке при 214 нм и 280 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

7. SPR-спектроскопия

1. Используйте двухканальную систему SPR (см. Таблицу материалов) с работающим буфером HBS-EP(+) и 10 мМ глицина HCl pH 1,5-1,6 в качестве буфера регенерации. Включите прибор, дегазатор, автопробоотборник, а также перекачайте и промывайте всю систему с ddH₂0 в течение 1 ч. Поместите готовый к использованию рабочий буфер в отдельную бутылку.
2. Капните эмерсионное масло на детектор и установите стеклянный сенсорный чип (см. Таблицу материалов), покрытый тонкой золотой пленкой и на верхней стороне функционализированный карбоксиметилдекстрановым гидрогелем, непосредственно на детектор под трехпортовой проточной ячейкой. Исправьте настройку, потянув вниз обработку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: C19RBDHC30M 200 нм стрептавидин дериватизированный карбоксиметилдекстран гидрогель со средней плотностью биотинилированного тяжелого острого респираторного синдрома коронавируса-2 RBD белка, представляет собой готовый к применению сенсорный чип с предварительно иммобилизованным лигандом.

8. SPR-связывающий анализ для связывания CV-N с HA, S-белком и RBD

1. Обездвижьте белковые лиганды для сенсорных чипов, следуя приведенным ниже шагам.
   1. Откройте таблицу выполнения, щелкнув Форма в строке меню и Запустить редактор таблиц в интегрированном программном обеспечении SPRAutoLink (см. Таблица материалов). Выберите и нажмите на BASIC_Immobilization из списка доступных таблиц запуска и следуйте шагам экспериментальной процедуры на экране компьютера. Соответствующий используемый редактор образцов отображается в правом верхнем углу.
   2. Нажмите на Редактор наборов образцов в разделе Форма, чтобы заполнить список реагентов для двух стоек, размещенных в автосэмплере для дальнейшего анализа. Нажмите на Autosampler Direct Control в качестве «Инструмента» в строке меню, чтобы переместить стойки вперед или домой. Выберите 4 °C в качестве рабочей температуры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение SPR позволяет использовать "SPR Instrument Direct Control" и "Pump Direct Control" путем выбора соответствующих инструментов, а также автоматической обработки и нажатия на Форму; Кроме того, для выполнения анализа данных можно выбрать редактор таблиц, диаграмму данных или постобработку . Файлы сохраняются непосредственно в каталоге по умолчанию и экспортируются как scrubber.files из окна постобработки.
2. Запустите насос для вливания ddH₂0, щелкнув Инструменты и прямое управление насосом и записывая данные, нажимая на SPR Instrument Direct Control, и каждый раз запускайте в новых окнах. Поместите реагенты связи (шаг 8.3) во флаконы емкостью 300 мкл, поместите их в стойки автопробоотборника и запустите таблицу запуска, нажав кнопку Выполнить.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поверхности стружки либо кондиционируются глициновым буфером pH 9,0 мМ, либо могут быть промыты 1 М хлорида натрия, 0,1 М боратного буфера натрия pH 9,0 для кондиционирования карбоксильной дериватизированной поверхности чипа для активации EDC/NHS смеси³⁰.
3. Для этого простого белково-белкового взаимодействия используйте чип CMD500D (см. Таблицу материалов) для генерации микропреломляющих показателей единиц (μRIU) = 2500 - 3000 проточных клеток с иммобилизованным ГК и μRIU = 400 проточных клеток с спайковым белком. При скорости потока вливания 15 мкл/мин вводят водную и равную смесь 0,4 М N-этил-N'-(диметиламинопропил) карбодиимида гидрохлорида (EDC*HCl) и 0,1 М N-гидроксисукцинимида (NHS), применяя следующие последовательные этапы.
   1. Заправка насоса со скоростью 25 000 мкл/мин, выполнение базовой регулировки в течение 30 с, введение 90 мкл раствора для активации образца (EDC/NHS) в течение 6 мин времени контакта, а затем удержание еще 5 мин.
   2. Повторите этот цикл после исходного запуска в течение 1 мин при 10 мкл/мин только на левой проточной клетке (синем) для введения и иммобилизации химически синтезированных пептидов¹⁰, ГК и спайкового белка при 20 мкг/мл и допускайте последующую базовую корректировку с ddH₂O в течение 1,5 мин перед закалкой активированной поверхности чипа 1 М этаноламином HCl pH 8,5.
4. Переключите трубки с жидкого пробоотборника на дегазатор из ddH₂0 во флакон с HBS-EP(+) (дополнительный рисунок 1).
5. Проанализируйте сенсорограммы SPR.
   1. Для выполнения кинетических исследований используют различные концентрации анализируемых веществ (10-5-10-8 М), с шагом регенерации после каждой инъекции и пустыми измерениями после различных аналитов. Измените скорость потока до 10 мкл/мин и начните инъекции в течение 4 мин контактного времени, затем 5 мин базовой генерации и двух ступеней регенерации по 2 мин каждая с интервалом 30 с.
   2. Вводят буферный раствор для пустых измерений, сенсорграммы которого вычитаются из пробных прогонов для нормализации различных концентраций белка.
6. Нажмите « Форма», прокрутите вниз и перейдите на «Постобработка», щелкнув этот режим работы. Нажмите кнопку Добавить , чтобы выбрать кривые привязки, созданные с течением времени в форме печати данных для каждой ячейки потока, и экспортируйте наложение в виде файла скруббера (.ovr). Нажмите «Файл», чтобы открыть параметры сохранения файлов. Получение кривых отклика путем выравнивания левой и правой кривых и вычитания сигналов второго опорного канала из сигналов лигандного канала.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Данные обрабатываются в "Постобработке" путем вычислительного определения сенсорграмм. Он помещается в наложение сенсорграмм из левой и правой проточных ячеек или представляется в виде сенсорграмм от разницы обоих каналов.
7. Очистите всю жидкость 50-100 мМ глицинового буфера рН 9,5, воду и 20% этанол до и после измерений связывания, чтобы удалить следы соли или любого белкового загрязнения, или более строгие, с 0,5% SDS и глицином.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для предотвращения повреждения прибора рекомендуется проверить механическую стабильность стеклянного чипа перед повторной вставкой картриджа чипа в прибор, если чипы хранились в буфере или при 100% влажности.

Молекула CVN2L0 с димерной заменой домена тестируется на связывание с верхней областью ГК в трех отдельных экспериментах SPR, и сродство связывания представлено в значениях KD. Предполагается, что домен B содержит Н-связывающие участки, на которые воздействует замена дисульфидной связи на ионные остатки, а домен А образует L10,18. Одиночные инъекции CVN2L0 и вариантов V2 (три дисульфидных моста) и V5 (два дисульфидных моста) сначала тестируются на связывание с микросхемой датчика, связанной с HA, для оценки емкости связывания перед настройкой измерения кинетики с помощью автопробоотборника и редактора рабочих столов (рисунок 3A и дополнительный рисунок 2). Повторные инъекции автоматизированы для серии CVN2L0, V2 и V5 при различных концентрациях в наномолярном и μ-молярном диапазоне в системе с течением времени (рисунок 3B-D). Коррелируя число интактных связей Cys-Cys, CVN2L0 связывает иммобилизованную HA при KD = 255 нМ при достижении хорошего насыщения. В этом случае оба значения KD, рассчитанные либо на основе кинетических данных, либо путем подгонки равновесных данных к изотерме связывания Ленгмюра, находятся в умеренном согласии (таблица 1 и дополнительный рисунок 3, дополнительный рисунок 4).

Рисунок 3: Анализ связывания SPR для связывания лигандов через поливалентные взаимодействия. CVN2 (WT) и сайт-варианты связывания V2 и V5 с дисульфидными заменителями в высокоаффинном углеводсвязывающем кармане тестируются на связывание ковалентно иммобилизованной ГК. (A) Кривые связывания левой и правой проточной ячейки CVN2, V2 и V5 могут быть извлечены из протокола запуска SPR, а сенсорограммы суммируются в виде наложения. (B) Сенсорграмма из обычного эксперимента SPR показана в виде кинетического анализа для связывания CVN2L0 с ГК, вводя концентрации анализируемого вещества от 10-4 до 10-8 М. CVN2L0 измеряют до самой высокой концентрации при 1,5 мкМ (верхняя линия) и до 500 нМ (нижняя линия), для которых не достигается ни насыщение на поверхности чипа, ни равновесное связывание. RU = Единицы реагирования. Используется сенсорный чип CMD500D. (C) Сенсорограмма SPR для связывания V2 с ГК. (D) Привязка V5 к HA. Рисунок (B-D) воспроизводится с разрешения, взятого из ссылки10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Сродство связывания CVN2 и вариантов с ГК, измеренное с помощью SPR. Scrubber 2.0 (программное обеспечение BioLogic) используется для подгонки кривых ассоциаций и диссоциации SPR в реальном времени и для расчета констант диссоциации равновесия (KD) из кинетических и равновесных данных. Ka = константа ассоциативной скорости. Kd = константа скорости диссоциации.

В то время как значения KD для связывания CVN2L0 и V2 с HA находятся в наномолярном диапазоне, V5 уменьшается при связывании (таблица 1). В V5 две дисульфидные связи заменяются ионными спаривающимися остатками, которые переобучают потенциальные ионные взаимодействия между мутировавшими остатками Glu и Arg (рисунок 2A,3D). Первичные данные анализируются по интегральным уравнениям скорости ассоциации и скорости диссоциации, которые описывают кинетику связывания взаимодействия растворимого CV-N с иммобилизованным лигандом и диссоциацию образовавшегося комплекса от поверхности чипа. Выполняются два независимых измерения и анализируются сенсорграммы, эквивалентные полученным из реплик. KD рассчитывается как коэффициент koff/kon (Дополнительная таблица 1)10,35. Однако KD связан с равновесными данными, которые соответствуют изотерме связывания Ленгмюра36, где равновесный связывающий ответ строится как функция концентрации анализируемого вещества (дополнительный рисунок 3A,4A,3B,4B). В зависимости от концентрации константа скорости диссоциации kd определяется после анализа и включается в подгонку фазы ассоциации (kon) для оценки константы скорости ассоциации ka. (Таблица 1, дополнительный рисунок 3С, дополнительный рисунок 4С).

Далее связывание CV-N с HA сравнивается с его взаимодействием с RBD. Связывание CV-N WT с SARS-CoV-2 RBD измеряется при более слабом сродстве (KD = 260 мкМ, рисунок 4A) по сравнению со связыванием с HA (KD = 5,7 нМ)8,10,12 и связыванием с S-белком (KD = 18,6 мкМ, рисунок 5). Концентрация и реакция построены для связывания CV-N WT с RBD, предполагая конкретное нацеливание на возможно консервированные углеводы на субъединицу RBD S1 (рисунок 4A). Тот же график сродства показан для связывания CVN2L0-V4 с DM, который больше не поддается анализу из-за замены дисульфидных связей, которые препятствуют высокоаффинному связыванию с небольшими гликозилированными пептидами (рисунок 4B).

CVN2L0-V4 (2 дисульфидные связи, противоположные несимметричному замещению остатков цистеина либо остатками Glu-Arg, либо амфипатическими аминокислотами Trp и Met) может образовывать неполярные сети водородных связей вокруг псевдодомена B углеводсвязывающего сайта10. Более высокая плотность гликанов на белке ГК достигает связывания с полярными остатками Glu-Arg вместо цистинов (Дополнительная таблица 1) и ассоциации с маннозилированными пептидами (KD = 10 мкМ для DM) между CVN2L0 и модификациями в Glu-Arg, но показывает прерывистую диссоциацию вариантов из этого моногликозилированного пептида, в частности, когда H модифицируется на обоих мономерах. Для взаимодействия между CVN2L0-V4 с DM ответ 56 мкМ CVN2L0-V4 впрыска дает более высокий отклик, чемRmax. (Рисунок 4В). V5 (2x Glu-Arg) терпит неудачу в диссоциации от поверхностно-связанного DM (данные не показаны). В сумме кривые ответа более низких концентраций снижаются до окончания инъекции для всех сенсорграмм на CVN2, связывающихся с пептидом без нативного H и связывания мономера с RBD.

Рисунок 4: SPR-анализ связывания (A) CV-N WT мономера с RBD. KD рассчитывается путем подгонки кинетических данных (левая сторона, KD = 260 мкМ) и сравнивается с данными о сродстве (правая сторона) с использованием простой биомолекулярной модели для связывания 1:1 между лигандом и анализируемым веществом (KD equil = 274 мкМ). Равновесная связующая реакция или связующая способность строится как функция концентрации по сравнению с кривыми связывания SPR (0-605 мкМ CVN). H = сайт связывания с высоким сродством. L = сайт связывания с низким сродством. Оба находятся на CV-N и CVN2L0. (B) Димерное связывание CVN2L0-V4 с DM, предполагающее 2L без анализируемого KD. Концентрации CVN2L0-V4 составляют 56 мкМ, 28 мкМ, 14 мкМ, 7 мкМ, 3,5 мкМ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Мутантное связывание CVN-E41A и CV-N WT с гликопротеином (A)S. Стрелки указывают на начало фазы ассоциации и диссоциации. (B) Привязка CVN-E41A к RBD на SARS-CoV-2. Лиганды предварительно иммобилизуются на поликарбоксилат HC и сенсорные чипы CMD500D. Субъединица Covid-19 S1 [Pinto, D. et al.26; and Barnes, C. et al.37] используется для иммобилизации RBD. Расход: 30 мкл/мин, 25 °C; построение необработанных данных. Для сравнения показано связывание антител сыворотки крови человека с RBD с коэффициентом разбавления 1:200. (C) SPR-анализ CV-N WT, связывающегося с S-гликопротеином, который иммобилизуется до уровня ответа 400 мкРН для захвата CV-N. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Ранее было показано, что мономерный CV-N с одним L не может в достаточной степени связывать gp120, но что способность нейтрализации CV-N требует сшивки двух углеводсвязывающих сайтов и преимущественно восстанавливается димеризацией для функционализации с 2H12,19. Следовательно, экспрессируется мономерный мутант CVN-E41A, который, как подозревается, дестабилизирует псевдодомен B или может прерывать связь со вторым доменом A, например, обнаруженный в CV-N WT. Мономер CVN-E41A обнаруживает стабильность при связывании с S-белком, аналогичным мономеру CV-N. Хотя реакция SPR для концентраций анализируемого вещества 605-680 мкМ приводит к высоким единицам отклика и типичным сенсорграммам SPR для связывания CV-N WT и E41A соответственно, мутант нестабилен при разбавлении (рисунок 5).

Дополнительный рисунок 1: Сенсорграмма SPR для захвата мимикрии СД как части верхней части ГК гриппа. Скриншот: График данных SPR, показывающий протокол запуска SPR для иммобилизации DM на чип датчика SPR CMD500D, который покрыт гидрогелем карбоксиметилдестрана 500 нм и подходит для кинетического анализа низкомолекулярных аналитов на высокой плотности лигандов. Сенсорные чипы непосредственно устанавливаются на детектор с эмерсионным маслом и фиксируются под трехпортовой проточной ячейкой. После закалки активированной поверхности чипа 1 М этаноламина HCl pH 8,5 CVN2 вводят дважды (концентрация = 1 мкМ и 2 мкМ соответственно). Фиолетовый: разница между проточной ячейкой 1 и проточной ячейкой 2; отклик регистрируется с интервалом 0,2 с. Синий: Проточная ячейка 1: 3000-4000 микропреломляющих показателей (μRIU), покрытых от 400 нМ раствора лиганда DM до активированной карбоксилированной поверхности. Красный: Опорная проточная ячейка 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 2: Ручной запуск на сенсорном чипе CMD500D, функционирующем HA, показывающем связывание димерных CVN2L0-V5, V2 и CVN2L0. При скорости потока инфузии от 30-50 мкл/мин CVN2L0 и варианты дисульфидных связей, выраженные His-меткой и очищенные над Ni-NTA, вводят в среднем мкМ-диапазоне и тестируют на связывание с ГК с ассоциативной фазой 3 мин и фазой диссоциации 2 мин. Инъекции представляют собой V5 (15 мкМ), V2 (2,4 мкМ), 0 мкМ, CVN2L0, субклонированный из белка SUMO-fusion (1 мкМ), и CVN2L0 (2 мкМ). Работающий буфер при физиологическом рН используется для всех экспериментов при 25 °C. Все растворы дегазируются и фильтруются (0,2 мкм) перед введением в систему. Фиолетовый: разница между проточной ячейкой 1 и проточной ячейкой 2; отклик регистрируется с интервалом 0,2 сек. Синий: Проточная ячейка 1: 2540 мкРИУ ГК. Красный: Опорная проточная ячейка 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 3: Привязка CVN2 к ГК. Анализ сенсорграмм при автоматическом выравнивании кривых. (A) Сенсорограммы обнуляются и выравниваются с помощью программного обеспечения Scrubber (слева) и изотермы связывания, показывающей зависящую от концентрации кривую отклика на связанные аналиты (справа). (B) Изотерма связывания, выраженная в процентах емкости. (C) Вычислительно приспособленные теоретические кривые ассоциации и диссоциации. (D) Кинетические данные на сенсорграммах SPR без установленных кривых. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 4: Привязка CVN2 к ГК. Анализ сенсорграмм при выравнивании кривых вручную. (A) Сенсорограммы обнуляются и выравниваются с помощью программного обеспечения Scrubber (слева) и изотермы связывания, показывающей зависящую от концентрации кривую отклика на связанные аналиты (справа). (B) Изотерма связывания, выраженная в процентах емкости. (C) Вычислительно приспособленные теоретические кривые ассоциации и диссоциации. (D) Кинетические данные на сенсорграммах SPR без установленных кривых. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная таблица 1: Кинетические данные, полученные из SPR-сенсорграмм для связывания вариантов связей CVN2L0 и Cys-Cys V2, V4 и V5 с HA с использованием модели связывания Langmuir 1:1. KD [M] = koff/kon или kd/ka. Все данные генерируются при 25 °C в буфере HBS-EP(+): Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Автору нечего раскрывать.