Методическая статья

Высокомультиплексная визуализация тканей с помощью рамановых красителей

DOI:

10.3791/63547

⸱

21 апреля 2022 г.

 ,  , 
1Department of Chemistry, Columbia University, 2Kavli Institute for Brain Science, Columbia University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Электронная предрезонансная стимуляция рамановского рассеяния (epr-SRS) радужных рамановских красителей является новой платформой для высокомаплексированной эпитопной визуализации белков. Здесь мы представляем практическое руководство, включающее подготовку антител, окрашивание образцов тканей, сборку микроскопа SRS и визуализацию тканей epr-SRS.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Визуализация обширного спектра специфических биомаркеров в тканях играет жизненно важную роль в изучении сложных организаций сложных биологических систем. Следовательно, технологии визуализации с высокой степенью мультиплексирования получают все большую оценку. Здесь мы описываем новую платформу высокомультиплексированной вибрационной визуализации специфических белков с сопоставимой чувствительностью со стандартной иммунофлуоресценцией с помощью электронной предрезонансной стимулированной рамановской рассеяния (epr-SRS) визуализации радужных рамановских красителей. Этот метод обходит предел спектрально-рассасываемых каналов в обычной иммунофлуоресценции и обеспечивает однократный оптический подход для опроса нескольких маркеров в тканях с субклеточным разрешением. Как правило, он совместим со стандартными тканевыми препаратами, включая параформальдегид-фиксированные ткани, замороженные ткани и формалин-фиксированные парафиновые (FFPE) ткани человека. Мы предполагаем, что эта платформа обеспечит более полную картину белковых взаимодействий биологических образцов, особенно для толстых интактных тканей. Этот протокол обеспечивает рабочий процесс от подготовки антител до окрашивания образца ткани, сборки микроскопа SRS и визуализации тканей epr-SRS.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сложные тканевые системы состоят из различных клеточных субпопуляций, пространственные расположения и сети взаимодействия которых глубоко переплетены с их функциями и дисфункциями 1,2. Чтобы выявить архитектуру ткани и исследовать ее сложность, знание пространственных расположений белков при одноклеточном разрешении имеет важное значение. Следовательно, высоко мультиплексированные технологии визуализации белка получают все большую оценку и могут стать краеугольным камнем для изучения биологии тканей 3,4,5. Современные распространенные методы визуализации мультиплексированного белка можно разделить на две основные категории. Одним из них является серийная иммунофлуоресцентная визуализация, основанная на нескольких раундах окрашивания и визуализации тканей, а другая - визуализация массовой цитометрии в сочетании с антителами с метками тяжелых металлов 6,7,8,9,10,11,12.

Здесь представлена альтернативная стратегия визуализации белка на основе мультиплексированных антител. В отличие от распространенной модальности флуоресцентной визуализации, которая может визуализировать только 4-5 каналов одновременно из-за широкого спектра возбуждения и излучения (полная ширина при половинном максимуме (FWHM) ~ 500 см-1), рамановская микроскопия демонстрирует гораздо более узкую спектральную ширину линии (FWHM ~ 10 см-1) и, следовательно, обеспечивает масштабируемую мультиплексию. Недавно, используя узкий спектр, была разработана новая схема рамановской микроскопии, названная электронной предрезонансной стимулированной рамановской микроскопией (epr-SRS), обеспечивающая мощную стратегию для мультиплексированной визуализации13. Исследуя вибрационные режимы с электронной связью рамановских красителей, epr-SRS достигает резкого эффекта усиления в 1013 раз на рамановских поперечных сечениях и преодолевает узкое место чувствительности обычной рамановской микроскопии (рисунок 1A)13,14,15. В результате предел обнаружения epr-SRS был увеличен до суб-мкМ, что позволяет рамановскому обнаружению интересных молекулярных маркеров, таких как специфические белки и органеллы внутри клеток13,16. В частности, с использованием рамановских красителеконъюгированных антител была продемонстрирована эпр-SRS-визуализация специфических белков в клетках и тканях (называемая иммуно-эпр-СРСРС) с сопоставимой чувствительностью со стандартной иммунофлуоресценцией (рисунок 1B)13,17. Настроив длину волны насоса всего на 2 нм, сигнал epr-SRS будет полностью отключен (рисунок 1B), что демонстрирует высокий вибрационный контраст.

На стороне зонда был разработан набор радужных рамановских зондов, называемых красителями Манхэттенского рамановского рассеяния (MARS), для конъюгации антител 13,18,19,20. Эта уникальная рамановская палитра состоит из новых красителей, несущих π-сопряженные тройные связи (дополнительный материал), каждый из которых отображает один и узкий пик epr-SRS в биоортогональном спектральном диапазоне рамановского диапазона (рисунок 1C). Путем модификации структуры основного хромофора и изотопного редактирования обоих атомов тройной связи (дополнительного материала) были разработаны спектрально разделенные рамановские зонды. Используя масштабируемую мультиплексность, микроскопия epr-SRS в сочетании с палитрой красителей MARS предлагает оптическую стратегию для однократной мультиплексной визуализации белка в клетках и тканях.

Immuno-eprSRS обеспечивает альтернативную стратегию современным методам мультиплексной визуализации белка с уникальными сильными сторонами. По сравнению с флуоресцентными подходами с циклическим окрашиванием, визуализацией и удалением сигнала, эта платформа на основе комбинационного рассеяния обеспечивает однокруглое окрашивание и визуализацию. Таким образом, он обходит практическую сложность в циклических процедурах и в значительной степени упрощает протокол, тем самым открывая новые области мультиплексированной белковой визуализации. Например, используя протокол очистки тканей, адаптированный к рамановскому красителю, иммуно-eprSRS был расширен до трех измерений для картирования сильно мультиплексированного белка в толстых интактных тканях17. Более 10 белковых мишеней были визуализированы вдоль миллиметровых тканей мозга мыши17. Совсем недавно было продемонстрировано соединение иммуно-eprSRS с оптимизированной расширительной микроскопией с биомолекулами (ExM) по протоколу21, однокадровая наноразмерная визуализация нескольких мишеней22. По сравнению с визуализационной масс-спектроскопией 4,9, epr-SRS является неразрушающим и обладает внутренне оптической способностью к сечению. Кроме того, epr-SRS более экономит время при сканировании тканей. Как правило, область ткани 0,25мм2 с размером пикселя 0,5 мкм занимает всего несколько минут для изображения одного канала epr-SRS. Например, общее время визуализации четырех каналов SRS плюс четыре флуоресцентных канала на рисунке 4 составляет около 10 мин.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол был проведен в соответствии с протоколом экспериментов на животных (AC-AABD1552), одобренным Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию в Колумбийском университете.

1. Получение раман-краситель-конъюгированных антител

  1. Подготовьте буфер сопряжения как ~0,1 M NaHCO3 в буфере PBS, pH = 8,3, хранить при 4 °C.
  2. Готовят N-гидроксисукцинимидию (NHS) эфирно-функционирующий раствор зонда MARS (дополнительный материал) в виде 3 мМ в безводном ДМСО. Синтез зондов MARS можно отнести к предыдущим отчетам 13,17,18.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для целей хранения раствор эфира красителя NHS должен быть защищен от света и храниться при температуре -20 °C.
  3. Растворяют твердые антитела в буфере конъюгации до концентрации 2 мг/мл. Для антител, которые растворяются в других буферах, обменивают их в буфер конъюгации до концентрации 1-2 мг/мл с центробежными фильтрами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для мультиплексного окрашивания предпочтительны вторичные антитела с высокой степенью перекрестной адсорбции, чтобы свести к минимуму межвидовую реактивность. Используемые вторичные антитела перечислены в Таблице 1 и Таблице материалов.
  4. Выполните реакцию сопряжения.
    1. Для вторичных антител добавляют 15-кратный молярный избыток раствора красителя к раствору антител в стеклянном флаконе медленно при перемешивании. Например, в 0,5 мл 2 мг/мл раствора антител добавляют 35 мкл 3 мМ раствора красителя.
    2. Инкубировать реакционную смесь при комнатной температуре (РТ) с перемешиванием в течение 1 ч. Защитите реакцию от света.
  5. Очистка.
    1. Подготовьте суспензию из гелевой фильтрационной смолы (Таблица материалов) в буфере PBS, следуя шагам 1.5.2-1.5.4.
    2. Добавьте 10 мл порошка гелевой фильтрационной смолы в 40 мл буфера PBS внутри 50-мл пробирки.
    3. Держите раствор на водяной бане при температуре 90 °C в течение 1 ч.
    4. Декантируйте супернатант и повторно добавляйте PBS до 40 мл. Хранить навозную жижу при температуре 4 °C.
    5. Упакуйте столбик исключения размеров (диаметр 1 см, самотечные колонны) раствором навозной жижи высотой 10-15 см.
    6. Промыть и промыть колонну ~10 мл буфера PBS для дальнейшей упаковки смолы.
    7. Пипетка реакционной смеси сопряжения (~0,5 мл) в колонну. Немедленно добавьте 1 мл буфера PBS в качестве буфера элюирования, когда вся реакционная смесь загружена. Постоянно пополняйте буфер элюирования (PBS) в столбец.
    8. Соберите элюат сопряженного раствора, посмотрев на цвет на колонке (красители MARS имеют светло-зеленый до синего цвета) или измерив поглощение при 280 нм (A280).
  6. Концентрировать собранный раствор до 1-2 мг/мл с помощью центробежного фильтра.
  7. Определение концентрации и средней степени маркировки (DOL, отношение красителя к белку) путем измерения ультрафиолетово-видимого (UV-Vis) спектра сопряженного раствора с помощью считывателя нанопластин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительный материал обеспечивает свойства MARS-красителя NHS-эфиров для расчета. Нормальный DOL для вторичного антитела составляет около 3.

2. Пробоподготовка тканей

  1. Параформальдегид фиксируется тканями мозга мыши.
    1. Обезболивают мышей (C57BL/6J, самка, 25 d после родов) изофлураном. Оцените правильную анестезию с помощью теста на щипки пальца ноги.
    2. Убивайте мышей путем смещения шейки матки. Перфицитируйте мышей сразу же с 4% параформальдегидом (PFA) в PBS транскардиально.
    3. Соберите мозг мыши, выполнив шаги 2.1.4-2.1.5
    4. Вырежьте вверх от ствола мозга вдоль сагиттального шва. Отойдите две половинки черепа в сторону и вычерпните мозг пинцетом.
    5. Зафиксируйте собранный мозг в 4% PFA в PBS при 4 °C в течение 24 ч. Затем промыть мозг в буфере PBS при 4 °C в течение 24 ч, чтобы удалить избыток PFA.
    6. Поместите твердую агарозу в воду до конечной концентрации 7% (мас./об.) в стакан со рыхлой крышкой. Размешайте раствор стеклянным перемешивающим стержнем. Нагрейте суспензию в микроволновой печи до тех пор, пока раствор не станет прозрачным.
    7. Дайте агарозе остыть до 45-55 °C.
    8. Налейте жидкую агарозу в небольшую камеру, затем переведите мозг из PBS в жидкую агарозу и сориентируйте его шпателем, чтобы встроить мозг. Подождите, пока ткань-агарозный блок затвердеет.
    9. Разделите ткань-агрозу на корональные срезы толщиной 40 мкм с помощью вибратома.
    10. Переложите ткань на 4-луночную пластину для последующего окрашивания. Удалите агарозу пинцетом. Промыть ткань 1 мл PBS, три раза.
  2. Исправлены замороженные ткани поджелудочной железы мыши.
    1. Фиксируют поджелудочную железу мыши в 4% PFA в PBS при 4 °C с раскачиванием в течение 16-20 ч.
    2. Промыть образец в 1 мл PBS (4 °C) три раза, чтобы удалить PFA.
    3. Вставьте образец (размером ~0,3-0,5 см) в компаундные блоки с оптимальной температурой резания (OCT). Поместите 2 капли OCT в пластиковый криомольд. Поместите ткань в правильную ориентацию и вылейте ОКТ поверх тканей, пока ни одна из тканей не останется открытой.
    4. Разделите поджелудочную железу до ломтиков толщиной 8 мкм и обездвижите их на тканевую связывающую стеклянную горку, храните их при -80 °C.
    5. Перед окрашиванием уравновешивайте образец до RT. Вымойте ткань PBS, чтобы удалить блоки OCT.
  3. Образцы FFPE.
    1. Выпекайте тканевый слайд FFPE при 60 °C в течение 10 мин.
    2. Депарафинизация и регидратация: Поместите образцы последовательно в следующие растворы в пробирку 50 мл на RT в течение 3 мин каждый раз с легким встряхиванием:
      ксилол два раза,
      этанол в два раза,
      95% (об/об)этанола в деионизированной воде два раза,
      70% (об/об)этанола в деионизированной воде два раза,
      50% (об/об)этанола в деионизированной воде один раз,
      деионизированная вода один раз.
    3. Переведите образец в 20 мМ цитрата натрия (рН 8,0) при 100 °C в стеклянной банке. Убедитесь, что ткани погружены в раствор.
    4. Поставьте банку на водяную баню при температуре 60 °C на 45 минут.
    5. Промыть образец деионизированной водой на RT в течение 5 мин.

3. Окрашивание тканей иммуно-ЭпрСРС

  1. Используйте гидрофобную ручку, чтобы нарисовать границу вокруг участков ткани на слайде.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Банка для окрашивания слайдов используется для выполнения этапов инкубации ткани на слайде. Плавающие ткани (участки мозга мыши толщиной 40 мкм) окрашиваются в пластины колодца.
  2. Инкубируют ткани с 0,3-0,5% PBST (Triton X-100 в PBS) в течение 10 мин.
  3. Инкубируют ткани блокирующим буфером (5% ослиная сыворотка, 0,5% Тритон Х-100 в PBS) в течение 30 мин.
  4. Готовят первичный окрашивающий раствор: добавляют все первичные антитела к 200-500 мкл окрашивающего буфера (2% ослиная сыворотка, 0,5% Тритон Х-100 в PBS) при желаемых концентрациях. Центрифугировать первичный окрашивающий раствор при 13 000 х г в течение 5 мин. Используйте супернатант только в том случае, если образуется осадок.
  5. Инкубируют ткань в растворе первичного антитела при 4 °С в течение 1-2 дней.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для окрашивания участков ткани на слайде поместите образец в ящик для окрашивания с влажной салфеткой для поддержания влажности.
  6. Промыть слайды три раза с 0,3-0,5% PBST на RT в течение 5 мин каждая. Используйте 1 мл PBST для плавающих тканей. Для тканей на слайде вымойте слайды в банке для окрашивания слайдов и убедитесь, что все ткани погружены в раствор.
  7. Инкубируют ткань в 200-500 мкл блокирующего буфера в течение 30 мин.
  8. Приготовьте раствор для вторичного окрашивания: добавьте все вторичные антитела (и лектины, если это необходимо) к 200-500 мкл буфера окрашивания с желаемыми концентрациями (обычно 10 мкг/мл). Центрифугируйте раствор вторичного окрашивания при 13 000 х г в течение 5 мин. Используйте супернатант только в том случае, если образуется осадок.
  9. Инкубируют ткани в 200-500 мкл раствора вторичных антител при 4 °С в течение 1-2 дней.
  10. Промыть слайды дважды с 0,3-0,5% PBST на RT в течение 5 мин каждая.
  11. Инкубировать с 200-500 мкл раствора DAPI в течение 30 мин.
  12. Трижды мойте слайды PBS на RT в течение 5 минут каждый.
  13. Для плавающих участков тканей переложите их на стеклянные горки с помощью пипетки, опускающей стекло. Выложите ткань тканевой щеткой и при необходимости очистите окружающую среду салфетками.
  14. Установите ткань в каплю антизатухающих реагентов стеклянным чехлом и закрепите ее лаком для ногтей.

4. Сборка микроскопа SRS

ПРИМЕЧАНИЕ: Коммерческая конфокальная флуоресцентная система используется в тандемной SRS-флуоресцентной визуализации. Более подробные описания можно найти в предыдущем докладе17. Этот протокол будет сосредоточен на стороне визуализации SRS с использованием узкополосного возбуждения.

  1. Подготовьте вибрационно-изолированный оптический стол в помещении с контролем температуры.
  2. Поместите синхронизированную двойную лазерную систему (насос и стокс) на оптический стол (рисунок 2А) с подключенным чиллером.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Основной лазер в двухлазерной системе обеспечивает передачу выходных импульсов на 1064 нм с шириной импульса 6 пс и частотой повторения 80 МГц. Луч Стокса исходит от фундаментального лазера. Интенсивность пучка Стокса модулировалась синусоидально встроенным электрооптическим амплитудным модулятором (ЭОМ) на частоте 8 МГц с глубиной модуляции более 90%. Другая часть фундаментального лазера удваивается по частоте до 532 нм, что дополнительно используется для синхронного засева пикосекундного оптического параметрического генератора (OPO) для получения импульсной цепи с блокировкой моды с шириной импульса 5-6 пс (луч холостого хода OPO блокируется интерферометрическим фильтром). Выходная длина волны OPO настраивается от 720-950 нм, которая служит пучком насоса.
  3. Установите зеркала (диапазон длин волн: 750-1100 нм), дихроичные разветвители луча (DBS, 980 нм длинночастотный фильтр, прямоугольный) и объектив (ахроматический, AR-покрытие для 650-1050 нм) на соответствующие крепления. Используйте очень стабильные кинематичные зеркальные крепления для зеркал и дихроичных светоделителей.
  4. Измерьте высоту лазерного излучения и размеры пучка накачки и лучей Стокса. Отрегулируйте высоту зеркал и линз, чтобы свет попадал в центр всех оптических элементов.
  5. Поместите зеркало M1 на оптический стол и сделайте его ~45° к лазерному выходу (рисунок 2B). Используйте ручки на кинематическом креплении для регулировки наконечника и наклона. Убедитесь, что свет движется на той же высоте по длине стола и по прямой линии по отношению к столу.
  6. Поместите и выровняйте дихроичные светоделители (фильтры длинных частот 980 нм) и зеркала для разделения насоса и лучей Стокса (рисунок 2A-B).
  7. Поместите и выровняйте пары линз (L1, L2 и L3, L4) на каждом из путей луча, чтобы коллимировать лучи и расширить диаметры луча в соответствии с задним зрачком объектива (рисунок 2A-B).
  8. Используйте зеркала M7 и M8 для выравнивания комбинированных лазерных лучей в микроскоп (рисунок 2C). Сначала выровняйте один луч в микроскоп и используйте зеркальные пары на другом луче, чтобы обеспечить пространственное перекрытие двух лучей.
  9. Настройте часть обнаружения.
    1. Наденьте масляный конденсатор с инфракрасным покрытием (1,4 NA) для сбора поступательного насоса и пучков Стокса после прохождения через образцы (рисунок 2C).
    2. Установите фотодиод Si большой площади на экранированную коробку с разъемами BNC (рисунок 2E). Добавьте блок питания постоянного тока 64 В к установленному фотодиоду, чтобы увеличить его порог насыщения и пропускную способность отклика.
    3. Отражайте передний свет с помощью 2-дюймового зеркала. Перефокусируйте свет на фотодиод после оптического фильтра, чтобы заблокировать модулирующий луч Стокса (рисунок 2D).
    4. Отправьте выходной ток фотодиода на быстрый блокирующий усилитель, заканчивающийся на 50 для демодуляции сигнала. Отправьте триггер 8 МГц на усилитель блокировки в качестве опорного сигнала.
    5. Отправьте фазный X-компонент запирающего усилителя в аналоговую интерфейсную коробку микроскопа.
  10. Оптимизируйте временное перекрытие со встроенной моторизованной ступенью задержки, измерив сигнал SRS чистой жидкости D2O в микроскопе.

5. Получение и анализ изображений

  1. Выполняйте многоканальную визуализацию epr-SRS с последовательной настройкой длины волны насоса.
    1. Установите мощность лазера на Ppump = 10-40 мВт и PStokes = 40-80 мВт на лазерной панели управления.
    2. Установите время ожидания пикселя равным 2-4 мкс и используйте несколько кадров в среднем 10-20 кадров в программном обеспечении для микроскопии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте комбинаторного использования высокой мощности лазера (Ppump> 40 мВт, PStokes> 80 мВт) и малого размера пикселя (<0,2 мкм), которые, вероятно, вызывают «отбеливающий эффект» рамановских красителей из-за многофотонного возбуждения.
    3. Установите для констант времени блокирующего усилителя половину времени ожидания пикселя.
  2. Линейное спектральное размешивание.
    ПРИМЕЧАНИЕ: epr-SRS следует строгой линейной зависимости сигнал-концентрация во всем диапазоне концентраций; таким образом, линейное спектральное размешивание эффективно для устранения любых потенциальных перекрестных помех между каналами. Для измерения N-канала epr-SRS с помощью зондов N MARS измеренные сигналы (S) могут быть выражены как S = MC, где C - концентрации зонда MARS, а M - матрица N x N , определяемая рамановскими поперечными сечениями зондов MARS.
    1. Измерьте матрицу M на одноцветных образцах иммуно-eprSRS, маркированных различными зондами MARS.
    2. Использовать уравнение C = M−1· S для определения матрицы концентрации зонда MARS с мультиплексным измерением сигнала образца S.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

На рисунке 3 показаны примеры изображений epr-SRS в различных образцах, включая фиксированные клетки (рисунок 3A), параформальдегидные (PFA) фиксированные ткани мыши (рисунок 3B) и образцы человека с фиксированным парафином (FFPE). Пространственное разрешение SRS-микроскопии ограничено дифракцией, типичное боковое разрешение составляет ~ 300 нм, а осевое разрешение составляет 1-2 мкм с использованием бл...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем протокол иммуно-eprSRS, который широко применим к распространенным типам тканей, включая свежесохраненные ткани мыши, ткани человека FFPE и замороженные ткани мыши. Иммуно-eprSRS был валидирован для группы эпитопов в клетках и тканях, как указано в таблице 1. Эта платформа с одним выстрелом особенно подходит для приложений, где циклические стратегии не функционируют хорошо. Например, циклическая флуоресценция требовательна для толстых тканей, поскольку несколько раундов 3D-иммуномар...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Рут А. Сингер и Ричарда К.П. Беннингера за предоставление тканей поджелудочной железы мыши. W.M. признает поддержку со стороны NIH R01 (GM128214), R01 (GM132860), R01 (EB029523) и армии США (W911NF-19-1-0214).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
16% параформальдегида,EM Grade Electron Microscopy Sciences15710
&альфа;-тубулинAbcamab18251Первичные антитела
&альфа;-тубулинBioLegend625902Первичные
антитела&бета;-III-тубулинBioLegend657402Первичные
антитела&бета;-III-тубулинAbcamab41489Первичные
антитела&бета;-тубулинAbcamab131205Первичные антитела
Агароза, низкая температура гелированияSigma AldrichA9414Для встраивания в мозг
Антитела против а-тубулина, вырабатываемые у кролика (&альфа;-тубулин)Abcamab52866Первичные антитела
Антитела против кальбиндина, вырабатываемые у мышей (Кальбиндин)Abcamab82812Первичные антитела
Анти-ГАМК B рецептор R2  антитело, полученное в морской свинке (GABA B рецептор R2)Millipore SigmaAB2255Первичные антитела
Anti-GFAP антитела, полученные у коз (GFAP)Thermo ScientificPA5-18598Первичные антитела
Anti-Glucagon  антитело, полученное у мышей (Glucagon)Santa Cruz Biotechnologysc-514592Первичные антитела
Антитела против инсулина, полученные у морских свинок (инсулин)DAKOIR00261-2Первичные антитела
Антитела против MBP, полученные у крыс (MBP)Abcamab7349Первичные антитела
Anti-NeuN антитела, полученные у кроликов (NeuN)Thermo ScientificPA5-78639Первичные антитела
Антитела против полипептида поджелудочной железы (РР), вырабатываемые у козы- Полипептид поджелудочной железы (ПП)Sigma AldrichSAB2500747Первичные антитела
Антитела против Pdx1, вырабатываемые у кроликов (Pdx1)Milipore06-1379Первичные антитела
Антитела против соматостатина, вырабатываемые у крыс (Соматостатин)Abcamab30788Первичные антитела
Антитела против виментина, вырабатываемые у курицы ( Vimentin)Abcamab24525Первичные антитела
Полосовой фильтрKR ЭлектроникаKR27248 МГц
BNC 50 ОмТерминатор Мини СхемыSTRM-50
BNC кабельThorlabs2249-CКоаксиальный кабель, BNC Male /
Male Широкополосное диэлектрическое зеркалоThorlabsBB1-E03750 - 1100 нм
C57BL/6J мышиЛаборатория Джексона000664
Центрифуга
КонденсаторOlympusпогружение в масло, 1,4 н.э.
Цитокератин 18Abcamab7797Первичные антитела
Цитокератин 18Abcamab24561Первичные антитела
Источник питания постоянного токаTopWard6302DНапряжение смещения составляет 64 В
Дихроичное креплениеThorlabsKM100CLкинематическое крепление для прямоугольной оптики высотой до 1,3 дюйма (33 мм), леворукий
ослик против курицы IgY (H+L)Jackson ImmunoResearch703-005-155Вторичные антитела для конъюгации MARS
Donkey anti-Goat IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch705-005-147Вторичные антитела для конъюгации MARS
Donkey anti-Guinea Pig IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch706-005-148Вторичные антитела для конъюгации MARS
Donkey anti-mouse IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch715-005-151Вторичные антитела для конъюгации MARS
Donkey anti-rabbit IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch711-005-152Вторичные антитела для конъюгации MARS
Donkey anti-rat IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch712-005-153Вторичные антитела для конъюгации MARS
Donkey anti-Sheep IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch713-005-147Вторичные антитела для конъюгации MARS
DPBSFisher Scientific14-190-250
EpCAMAbcamab71916Первичные антитела
ЭтанолSigma Aldrich443611
Быстроскоростной усилитель с просмотром ZurichInstrumentsHF2LIDC - 50 МГц
FFPE Образец почкиUSBiomaxHuFPT072
ФибрилларинAbcamab5821Первичные антитела
GiantinAbcamab24586Первичные антитела
GlucagonSanta Cruz Biotechnologysc-514592Первичные антитела
H2BAbcamab1790Первичные антитела
HeLa ATCCATCC CCL-2
Полосовой фильтр с высоким O.D. Chroma ТехнологияET890/220mФильтрация пучка Стокса и передача пучка насоса
Гидрофобная ручкаFisher ScientificNC1384846
ИнсулинThermoFisher701265Первичные антитела
Интегрированная лазерная система SRSПрикладная физика и Электроника, Инк.picoEMERALDpicoEMERALD обеспечивает последовательность выходных импульсов на длине волны 1 064 нм с длительностью импульса 6 пс и частотой следования 80 МГц, которая служит пучком Стокса. Удвоенная частота луча на длине волны 532 нм используется для синхронного зарождения пикосекундного оптического параметрического генератора (ОПГ) для создания последовательности импульсов с синхронизацией мод и длительностью импульса 5~6 пс (холостой луч ОПГ блокируется интерферометрическим фильтром). Выходная длина волны ОПО перестраивается в диапазоне от 720 до 720 лет; 950 нм, которая служит лучом насоса. Интенсивность пучка Стокса с длиной волны 1064 нм синусоидально модулируется встроенным EOM на частоте 8 МГц с глубиной модуляции более 90%. Пучок насоса пространственно перекрывается с лучом Стокса с помощью дихроичного зеркала внутри picoEMERALD. Временное перекрытие между накачкой и последовательностью импульсов Стокса достигается с помощью встроенного каскада задержки и оптимизируется с помощью сигнала SRS чистого D2O в микроскопе.
Инвертированный лазерно-сканирующий микроскопOlympusFV1200MPE
Кинематическое крепление для зеркалаThorlabsPOLARIS-K1-2AH2 Низкопрофильные шестигранные регуляторы
Lectin из Triticum vulgaris (пшеницы)Sigma AldrichL0636-5 mg
Длиннопроходный дихроичный светоделительSemrockDi02-R980-25x36980 нм лазер BrightLine  однолезвийный лазерно-плоский дихроичный светоделитель
MAP2BioLegend801810
Программное обеспечение для микроскопииOlympusFluoView
NanoQuant PlateTecanДля анализа малых объемов на основе абсорбции в планшетном считывателе.
Нормальная ослиная сывороткаJackson ImmunoResearch017-000-121
NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI)Thermo ScientificR37606
Nunc 4-луночные тарелкиFisher Scientific12-566-300
Объективная линзаOlympusXLPlan Nx25, 1.05-NA, MP, рабочее расстояние =  2  мм
Кисть
перископа в сбореThorlabsRS99включает в себя верхний и нижний блоки, а также Oslash; 1-дюймовый столб и зажимная вилка.
pH-метр
Планшетный считывательTecanInfinite 200 PROПростой в использовании многорежимный планшетный считыватель. Возможности измерения поглощения в спектральном диапазоне 230– 1000 нм.
ProLong Gold антивыцветающий реагентThermo ScientificP36930
PSD95Invitrogen51-6900Первичные антитела
Sephadex G-25 MediumGE Life Sciences17-0033-01гель фильтрующая смола для обессоливания и замены буфера
Экранированная коробка с разъемами BNCPomona Electronics2902Алюминиевая коробка с крышкой, BNC женская/женская
Si фотодиодThorlabsFDS1010350– 1100 нм, 10 мм x 10 мм Активная область
Synapsin 2ThermoFisherOSS00073GПервичные антитела
Тканевый путь Superfrost Plus Gold SlidesFisher Scientific22-035813Адгезивное предметное стекло для притяжения и химического склеивания свежих или закрепленных формалином участков ткани прочно прилегает к поверхности предметного стекла (связывание стеклянных стекол)
Triton X-100Fisher ScientificBP151-500
ВибратомLeicaVT1000
VimentinAbcamab8069Первичные антитела
XylenesSigma Aldrich214736
первичных антител для рисования

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Goltsev, Y., et al. Deep profiling of mouse splenic architecture with CODEX multiplexed imaging. Cell. 174 (4), 968-981 (2018).
  2. Taube, J. M., et al. The Society for Immunotherapy of Cancer statement on best practices for multiplex immunohistochemistry (IHC) and immunofluorescence (IF) staining and validation. Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (1), 000155(2020).
  3. Lewis, S. M., et al. Spatial omics and multiplexed imaging to explore cancer biology. Nature Methods. 18 (9), 997-1012 (2021).
  4. Bodenmiller, B. Multiplexed epitope-based tissue imaging for discovery and healthcare applications. Cell Systems. 2 (4), 225-238 (2016).
  5. Hickey, J. W., et al. Spatial mapping of protein composition and tissue organization: a primer for multiplexed antibody-based imaging. Nature Methods. , (2021).
  6. Lin, J. -R., et al. Highly multiplexed immunofluorescence imaging of human tissues and tumors using t-CyCIF and conventional optical microscopes. eLife. 7, 31657(2018).
  7. Black, S., et al. CODEX multiplexed tissue imaging with DNA-conjugated antibodies. Nature Protocols. 16 (8), 3802-3835 (2021).
  8. Giesen, C., et al. Highly multiplexed imaging of tumor tissues with subcellular resolution by mass cytometry. Nature Methods. 11 (4), 417-422 (2014).
  9. Keren, L., et al. MIBI-TOF: A multiplexed imaging platform relates cellular phenotypes and tissue structure. Science Advances. 5 (10), 5851(2019).
  10. Gerdes, M. J., et al. Highly multiplexed single-cell analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 11982(2013).
  11. Angelo, M., et al. Multiplexed ion beam imaging of human breast tumors. Nature Medicine. 20 (4), 436-442 (2014).
  12. Radtke, A. J., et al. IBEX: A versatile multiplex optical imaging approach for deep phenotyping and spatial analysis of cells in complex tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (52), 33455(2020).
  13. Wei, L., et al. Super-multiplex vibrational imaging. Nature. 544, 465(2017).
  14. Wei, L., Min, W. Electronic preresonance stimulated Raman scattering microscopy. The Journal of Physical Chemistry Letters. 9 (15), 4294-4301 (2018).
  15. Shi, L., et al. Electronic resonant stimulated Raman scattering micro-spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 122 (39), 9218-9224 (2018).
  16. Fujioka, H., et al. Multicolor activatable Raman probes for simultaneous detection of plural enzyme activities. Journal of the American Chemical Society. 142 (49), 20701-20707 (2020).
  17. Shi, L., et al. Highly-multiplexed volumetric mapping with Raman dye imaging and tissue clearing. Nature Biotechnology. , (2021).
  18. Miao, Y., Qian, N., Shi, L., Hu, F., Min, W. 9-Cyanopyronin probe palette for super-multiplexed vibrational imaging. Nature Communications. 12 (1), 4518(2021).
  19. Miao, Y., Shi, L., Hu, F., Min, W. Probe design for super-multiplexed vibrational imaging. Physical Biology. 16 (4), 041003(2019).
  20. Qian, N., Min, W. Super-multiplexed vibrational probes: Being colorful makes a difference. Current Opinion in Chemical Biology. 67, 102115(2022).
  21. Klimas, A., et al. Nanoscale imaging of biomolecules using molecule anchorable gel-enabled nanoscale in-situ fluorescence microscopy. Nature Portfolio. , (2021).
  22. Shi, L., et al. Super-resolution vibrational imaging using expansion stimulated Raman scattering microscopy. bioRxiv. , (2021).
  23. Benninger, R. K. P., Hodson, D. J. New understanding of β-cell heterogeneity and in situ islet function. Diabetes. 67 (4), 537(2018).
  24. Hu, F., et al. Supermultiplexed optical imaging and barcoding with engineered polyynes. Nature Methods. 15 (3), 194-200 (2018).
  25. Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
  26. Coherent Raman Scattering Microscope. , Available from: https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-cars/ (2022).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи