Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Оценка убиквитилирования субстрата убиквитин-лигазой E3 в лизатах клеток млекопитающих

2.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/63561

⸱

10 мая 2022 г.

 ,  ,  , 
1Department of Genetic and Evolution, Federal University of São Carlos, 2Department of Biochemistry and Immunology, Faculty of Medicine of Ribeirão Preto, University of São Paulo

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Мы предоставляем подробный протокол для анализа убиквитилирования конкретного субстрата и убиквитин-лигазы E3 в клетках млекопитающих. Клеточные линии HEK293T использовали для гиперэкспрессии белка, полиубиквитилированный субстрат очищали от клеточных лизатов иммунопреципитацией и разрешали в SDS-PAGE. Иммуноблоттинг использовался для визуализации этой посттрансляционной модификации.

Аннотация

Убиквитилирование - это посттрансляционная модификация, которая происходит в эукариотических клетках, что имеет решающее значение для регуляции нескольких биологических путей, включая выживание клеток, пролиферацию и дифференцировку. Это обратимый процесс, который состоит из ковалентного присоединения убиквитина к субстрату посредством каскадной реакции по меньшей мере трех различных ферментов, состоящих из E1 (фермент активации убиквитина), E2 (убиквитин-конъюгирующий фермент) и E3 (фермент убиквитин-лигаза). Комплекс E3 играет важную роль в распознавании субстрата и убиквитилировании. Здесь описан протокол для оценки убиквитилирования субстрата в клетках млекопитающих с использованием транзиторной котрансфекции плазмиды, кодирующей выбранный субстрат, убиквитин-лигазы E3 и меченого убиквитина. Перед лизисом трансфектированные клетки обрабатывают ингибитором протеасомы MG132 (карбобензокси-лей-лей-лей-лейцинальный), чтобы избежать субстратной протеасомальной деградации. Кроме того, клеточный экстракт подвергают мелкомасштабному иммунопреципитации (IP) для очистки полиубиквитилированного субстрата для последующего обнаружения методом западного блоттинга (WB) с использованием специфических антител для метки убиквитина. Следовательно, описан последовательный и несложный протокол анализа убиквитилирования в клетках млекопитающих, чтобы помочь ученым в решении проблемы убиквитилирования конкретных субстратов и убиквитиновых лигазов E3.

Введение

Посттрансляционные модификации (PTM) являются важным механизмом регуляции белка, который необходим для клеточного гомеостаза. Убиквитилирование белка представляет собой динамическую и сложную модификацию, которая создает набор различных сигналов, приводящих к нескольким клеточным результатам у эукариотических организмов. Убиквитилирование представляет собой обратимый процесс, заключающийся в прикреплении к субстрату белка убиквитина, содержащего 76 аминокислот, происходящий в ферментативном каскаде, состоящем из трех различных реакций1. Первая стадия характеризуется активацией убиквитина, которая зависит от гидролиза АТФ с образованием высокоэнергетического тиоэфир-связанного убиквитина между Убиквитином С-концом и остатком цистеина, присутствующим в активном центре фермента Е1. Впоследствии убиквитин переносится на фермент Е2, образуя тиоэфироподобный комплекс с убиквитином. После этого убиквитин ковалентно присоединяется к субстрату Е2 или, чаще, ферментом Е3, который распознает субстрат 2,3 и взаимодействует с ним. Иногда ферменты E4 (факторы удлинения убиквитиновой цепи) необходимы для стимулирования сборки мультиубиквитиновой цепи3.

Убиквитин имеет семь остатков лизина (K6, K11, K27, K29, K33, K48 и K63), что позволяет формировать полиубиквитиновые цепи, которые генерируют различные связи для получения различных трехмерных структур, которые будут распознаваться несколькими эффекторными белками 4,5. Следовательно, вид полиубиквитиновой цепи, введенный в субстрат, необходим для решения его клеточной судьбы 6,7,8. Кроме того, субстрат также может быть убиквитинирован через его N-концевые остатки, называемые N-дегронами. Специфические убиквитин-лигазы E3 отвечают за распознавание N-дегронов, что позволяет полиубиквитилировать близлежащий остаток лизина9.

В настоящее время существует более 40 различных субстратов, специфичных для SCF. Среди них ключевые регуляторы нескольких биологических путей, включая дифференцировку и развитие клеток, а также выживание и гибель клеток, можно найти 10,11,12,13. Таким образом, идентификация специфических субстратов каждой Е3 убиквитин-лигазы имеет важное значение для разработки всеобъемлющей карты различных биологических событий. Несмотря на то, что идентификация истинных субстратов является биохимически сложной задачей, использование методов, основанных на биохимии, очень подходит для оценки специфичности цепи и различия между моно- и полиубиквитилированием14. Это исследование описывает полный протокол анализа убиквитилирования с использованием клеточной линии млекопитающих HEK293T, сверхэкспрессирующей субстрат UXT-V2 (повсеместно экспрессируемый префолдиноподобный изоформа шаперона 2) с помощью E3 убиквитин-лигазного комплекса SCF (Fbxo7). UXT-V2 является важным кофактором для передачи сигналов NF-κB, и как только этот белок сбивается в клетках, он ингибирует активацию NF-κB, индуцированную TNF-α11. Таким образом, для обнаружения полиубиквитилированного UXT-V2 используется ингибитор протеасомы MG132, поскольку он обладает способностью блокировать протеолитическую активность субъединицы 26S протеасомного комплекса15. Кроме того, клеточный экстракт подают на мелкомасштабный IP для очистки субстрата, используя специфическое антитело, иммобилизованное в агарозную смолу для последующего обнаружения WB с использованием выбранных антител. Этот протокол очень полезен для проверки убиквитилирования субстрата в клеточной среде, а также может быть адаптирован для различных типов клеток млекопитающих и других комплексов убиквитин-лигазы E3. Тем не менее, необходимо также проверить субстрат, протестированный с помощью анализа убиквитилирования in vitro, поскольку оба протокола дополняют друг друга в отношении идентификации истинных субстратов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Обзор протокола анализа убиквитилирования в клетках млекопитающих представлен на рисунке 1.

figure-protocol-1
Рисунок 1. Обзор процедуры анализа убиквитилирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

1. Клеточная культура

  1. Вырастите клеточную линию HEK293T в 100-миллиметровой чашке, обработанной TC, до 80%-90% слияния в питательных средах (Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) с высоким содержанием глюкозы, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и пенициллином (100 единиц), стрептомицином (100 мкг) и L-глутамином (0,292 мг / мл)). Инкубируют культуру при 37 °C в увлажненном инкубаторе клеточной культуры при 5% CO2.
  2. Для прохождения клеток аспирируйте среду из чашки для культивирования с помощью серологической пипетки. Промыть клетки один раз 1 мл стерилизованного 1x фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS 1x).
  3. Отделите клетки, добавив 1 мл раствора трипсина/ЭДТА (этилендиаминтетрауксусной кислоты). Инкубировать блюдо при 37 °C в течение 5 мин. Повторное суспендирование клеток с помощью серологической пипетки в 2 мл питательной среды.
  4. Переложить клеточную суспензию в свежую и чистую 15 мл пробирку и центрифугу при 500 х г в течение 5 мин при комнатной температуре (RT). Удалите супернатант, тщательно вылив его. Осторожно повторно суспендируют клеточную гранулу в 3 мл питательной среды путем пипетки вверх и вниз для получения однородной клеточной суспензии.
  5. Переложите 1 мл клеточной суспензии в 100-миллиметровую культуральную чашку, обработанную TC, содержащую 9 мл питательной среды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если клетки находятся в хорошем состоянии, каждая культуральная чашка HEK293T, где слияние составляет 80%-90%, может генерировать три культуральные чашки с 80% слиянием через 2 дня после прохождения.

2. Трансфекция клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Не рекомендуется трансфектировать культуру клеток, если достигнутое слияние составляет менее 80%.

  1. Перед трансфекцией сертифицируйте, свободны ли клетки от загрязнения и при достаточном слиянии для переходных трансфекций.
  2. Для каждого образца трансфекции готовят комплексы ДНК-полиэтиленимин (PEI 1 мкг/мкл при рН 7,2) следующим образом:
    1. Развести 3 мкг каждой плазмиды в 100 мкл восстановленной сывороточной среды opti-MEM I без добавок и осторожно перемешать ее, пипетируя раствор вверх и вниз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь клетки были трансфектированы 4 мкг каждой плазмиды: пустый вектор (pcDNA3) или конструкции FLAG-Fbxo7 и UXT-V2-HA, с или без 6xHis-myc-ubiquitin. Общее содержание ДНК составило 12 мкг.
    2. Разморозьте PEI при RT и добавьте его в раствор после пропорции 3 мкл PEI на 1 мкг ДНК. Гомогенизируйте раствор путем пипетирования вверх и вниз. Затем инкубируют его в течение 15 мин на RT, чтобы обеспечить образование комплексов ДНК-PEI.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальная пропорция объема PEI на количество ДНК различается в зависимости от выбранной клеточной линии.
  3. Добавьте общий объем комплексов ДНК-PEI в каждое блюдо, содержащее культуру клеток, и аккуратно перемешайте его, раскачивая пластину вперед и назад. Инкубируют клетки при 37 °C в увлажненном инкубаторе клеточной культуры при 5% CO2.
  4. Замените питательную среду через 5 ч, так как длительное воздействие PEI может быть токсичным для клеток HEK293T. Инкубируют клетки при 37 °C в увлажненном инкубаторе клеточной культуры при 5% CO2 в течение 36 ч.

3. Лизис и иммунопреципитация клеток

  1. После инкубационного периода и за 6 ч до лизиса клеток обрабатывают трансфектированные клетки 10 мкМ ингибитора протеасомы MG-132. Еще раз, инкубируйте клетки при 37 ° C в увлажненном инкубаторе клеточной культуры при 5% CO2.
  2. Аспирируйте среду из каждой чашки культуры с помощью серологической пипетки и вымойте ее один раз 1 мл 1x PBS. Отсоедините клетки, добавив 1 мл трипсина и инкубируя блюдо при 37 °C в течение 5 мин. Повторное суспендирование клеток в 1 мл питательной среды.
  3. Переложите клеточную суспензию в свежую и чистую пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте ее при 500 х г в течение 5 мин при РТ.
  4. Удалите супернатант, тщательно вылив его. Осторожно повторно суспендируют клеточную гранулу в 200 мкл ледяного буфера лизиса NP-40 (50 мМ Tris-HCl pH 7,2, 225 мМ KCl и 1% NP-40), дополняют коктейлем ингибиторов протеазы и фосфатазы (10 мМ NaF и 1 мМ Na3VO4), и переносят раствор в чистую микротрубку объемом 1,5 мл.
  5. Инкубируйте лизат клеток в течение 30 мин на льду. После инкубации центрифугируют клеточные лизаты при 16 900 х г в течение 20 мин при 4 °C.
  6. Между тем, уравновешивайте бусины агарозы-анти-ГК ледяным буфером лизиса NP-40. Используйте 15 мкл шариков агарозы-анти-ГК для каждого образца. Вымойте шарики 200 мкл буфера лизиса NP-40, пульсируя его в микроцентрифужной трубке при 3000 х г в течение 1 мин при 4 °C. Пипеткой аспирировать и выбросить супернатант очень осторожно; повторите этот процесс три раза. После этого держите бусины уравновешенными на льду до использования.
  7. После центрифугирования клеточных лизатов восстанавливают супернатант. Количественно оценить содержание белка в общем лизате с помощью метода16 Брэдфорда.
  8. Убедитесь, что каждый образец, подвергшийся иммунопреципитации, содержит равное количество белка. Инкубируют необходимый объем клеточного лизата с уравновешенными шариками агароза-анти-ГА в течение 4 ч, осторожно вращаясь во вращающемся инкубаторе при 4 °C, что позволяет UXT-V2-HA связываться с шариками агарозы-анти-HA.
  9. Соберите шарики агарозы-анти-ГК, пульсируя их в микроцентрифужной трубке при 3000 х г в течение 1 мин при 4 °C. Осторожно аспирировать и выбросить супернатант. Трижды промыть шарики ледяным буфером лизиса NP-40 и дважды ледяным буфером FLAG/HA (10 мМ Hepes pH 7,9, 15 мМ MgCl2, 225 мМ KCl и 0,1% NP-40).
  10. После заключительной промывки аккуратно удалите весь супернатант пипеткой и элюируйте полиубиквитилированный белок пептидом ГК (300 мкг/мл), разбавленным на буфере FLAG/HA. Инкубировать шарики агарозы-анти-ГК с пептидом ГК в течение 1 ч при 4 °C в качающейся шейкерной платформе.
  11. Раскрутите шарики при 3000 х г в течение 2 мин при 4 °C и осторожно выложите в пипетку супернатант, содержащий полиубиквитинированные белки. При необходимости храните элюат в свежей и чистой микропробирке при -20 °C.
  12. Растворяют элюаты и лизаты клеток в 10% SDS-PAGE (додецилсульфат-полиакриламидный гель электрофорез)17 и иммуноблоттинг.
  13. В этом исследовании был выполнен мокрый перенос WB. Для такого рода переноса поместите гель в бутерброд, состоящий из фильтровальной бумаги-геля-мембраны-фильтровальной бумаги, смягчите его прокладками и прижмите его вместе поддерживающей сеткой. Поместите эту систему вертикально в резервуар, заполненный передаточным буфером, и между электродами из нержавеющей стали / платиновой проволоки. Перенос происходит в течение 90 мин при 150 В во влажном буфере переноса (глицин 192 мМ, трисосное основание 25 мМ, 0,025% SDS, 20% метанол).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку клеточные экстракты были количественно определены (шаг 3.7), запустите SDS-PAGE с равным количеством белка для каждого образца. Кроме того, чтобы разрешить элюат, запустите равные объемы каждого образца.
  14. Исследуйте мембрану иммуноблота, используя выбранные антитела 11. Убедитесь, что сигнал мазка обнаружен в элюате из полиубиквитилированного субстрата, вытягиваемого в процессе IP, с использованием антимик-антител в образцах, содержащих лигазу Е3 дикого типа, субстрат и мик-уб. В клеточном лизате (входе) убедитесь, что сигнал от выбранного субстрата, белка Fbxo7, убиквитилированных белков и белка для ведения хозяйства (например, GAPDH и β-актина) обнаружен, чтобы гарантировать одинаковое количество белков в каждой полосе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Разведение для каждого использованного антитела готовили в соответствии с инструкциями завода-изготовителя.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

UXT (вездесущий экспрессированный транскрипт) представляет собой префоллиноподобный белок, который образует повсеместно экспрессируемые белковые складчатые комплексы в тканях мыши и человека, таких как сердце, мозг, скелетные мышцы, плацента, поджелудочная железа, почки и печень18. Описаны две изоформы сращивания UXT, которые называются UXT-V1 и UXT-V2, выполняющие различные функции и субклеточные местоположения. UXT-V1 преимущественно локализуется в цитоплазме и внутри митохондрий, и он участвует...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Убиквитилирование является важной посттрансляционной модификацией, которая регулирует уровни нескольких белков и играет решающую роль во многих сигнальных путях и биологических процессах, обеспечивая здоровую внутриклеточную среду. Убиквитин-протеасомная система (UPS) является одним из основных направлений последних фармацевтических исследований, обеспечивая возможность стабилизации супрессоров опухолей или индуцирования деградации онкогенных продуктов22. Например, аберрантная пролиферация новообр...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что конфликта интересов нет.

Благодарности

F.R.T поддерживается грантом FAPESP No 2020/15771-6 и CNPq Universal 405836/2018-0. P.M.S.P и V.S поддерживаются CAPES. C.R.S.T.B.C был поддержан стипендией FAPESP No 2019/23466-1. Благодарим Сандру Р. К. Маруяму (FAPESP 2016/20258-0) за материальную поддержку.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1,5 мл микропробиркаAxygenPMI110-06A
100 мм чашка для культур, обработанная TCCorning430167
15 мл тубаCorning430766
96-луночная пластинаCralplast655111
Agarose-anti-HA шарикиSigma-AldrichE6779
Anti Mouse anti Mouse AntiMine5220-0341Козье анти-мышиное антитело IgG
Anti RabbitSeracare5220-0337Козье анти-Rabbit IgG
анти-актиновое антителоSigma-AldrichA3853Используемое разведение: 1:2000
Анти-Fbxo7 антителоSigma-AldrichSAB1407251Используемое разведение: 1:1000
Антитело против HASigma-AldrichH3663Используемое разведение: 1:1000
Anti-Myc anti-MycCell Signalling2272Используемое разведение: 1:1000
Bradford реактивSigma-AldrichB6916-500ML
BSASigma-AldrichA9647-100GBovine Serum Albumin
Cell инкубаторNuaireNU-4850
CentrifugeEppendorf5804R500 x g в течение 5 мин
ChemiDocBioRad
Цифровой pH-метрKasviK39-2014B
Dulbecco' s Модифицированный Eagle' s MediumCorning10-017-CRVВысокий уровень глюкозы
Фетальная бычья сывороткаGibcoF4135Фильтрат перед использованием
пептид HASigma-AldrichI2149
HEK293T клеткиATCCCRL-3216
HepesGibco15630080
KClVWR Life Science0365-500G
Kline rotatorGlobal Trade TechnologyGT-2OIBD
MG-132Boston BiochemI-130
МикроцентрифугаEppendorf5418R
Na3VO4 (Ortovanadato)
NaF
нитроцеллюлозная блоттинговая мембранаGE Healthcare
NP40 (IGEPAL CA-630)Sigma-AldrichI8896-100ML
Оптический микроскопOPTIKA микроскопыSN510768
Opti-MEMGibco31985-070
pcDNA3InvitrogenV79020Для экспрессии
pcDNA3-2xFlag-Fbxo7  у млекопитающих; Любезно пожертвовано доктором Марсело Дамом; Tag 2xFlag (N-терминал). Ферменты рестрикции: EcoRI и XhoI
pcDNA3-2xFlag-Fbxo7-Δ Ф-бокс  Любезно пожертвовано доктором Марсело Дамом; Tag 2xFlag (N-терминал). Ферменты рестрикции: EcoRI и XhoI. &Дельта; 335-367
ПДНК3-УКТВ2-ВА  Любезно пожертвовано доктором Марсело Дамом; Tag HA (С-терминал). Ферменты рестрикции: EcoRI и XhoI
pCMV-6xHis-Myc-Ubiquitin; Любезно пожертвовано доктором Марсело Дамом; Tag 6x-His-Myc (N-терминал). Ферменты рестрикции: EcoRI и KpnI
Pen Strep Glutamine 100xGibco10378-016
Фосфатный буферный раствор 10xAccuGENE51226Чтобы получить 1x PBS, разбавьте 10x PBS в ультрачистой воде
Полиэтиленимин (PEI)Sigma-Aldrich9002-98-6
Ponceau SVWR Life Science0860-50G
Коктейль ингибиторов протеазы SIGMAFASTSigma-AldrichS8820
Шейкер качалкиKasvi19010005
система SDS-PAGE BioRad165-8004
Раствор гомогенизатораPhoenix LufercoAP-22
Тризма базаSigma-AldrichT6066-500G
Трипсин (TrypLe Express)Gibco12605-028
Реактив Вестерн-Блоттинг ЛюминолSanta Cruz BiotechnologySC-2048
10600016 rio rio rio rio

Ссылки

  1. Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment. Nature Medicine. 20 (11), 1242-1253 (2014).
  2. Callis, J. The ubiquitination machinery of the ubiquitin system. The Arabidopsis Book. 12, 0174(2014).
  3. Koegl, M., et al. A novel ubiquitination factor, E4, is involved in multiubiquitin chain assembly. Cell. 96 (5), 635-644 (1999).
  4. French, M. E., Koehler, C. F., Hunter, T. Emerging functions of branched ubiquitin chains. Cell Discovery. 7 (1), 6(2021).
  5. Komander, D., et al. Molecular discrimination of structurally equivalent Lys 63-linked and linear polyubiquitin chains. EMBO Reports. 10 (5), 466-473 (2009).
  6. Clague, M. J., Urbé, S. Ubiquitin: Same molecule, different degradation pathways. Cell. 143 (5), 682-685 (2010).
  7. Davies, B. A., et al. Vps9p CUE domain ubiquitin binding is required for efficient endocytic protein traffic. Journal of Biological Chemistry. 278 (22), 19826-19833 (2003).
  8. Raasi, S., Wolf, D. H. Ubiquitin receptors and ERAD: A network of pathways to the proteasome. Seminars in Cell and Developmental Biology. 18 (6), 780-791 (2007).
  9. Pan, M., et al. Structural insights into Ubr1-mediated N-degron polyubiquitination. Nature. 600 (7888), 334-338 (2021).
  10. Raducu, M., et al. SCF (Fbxl17) ubiquitylation of Sufu regulates Hedgehog signaling and medulloblastoma development. The EMBO Journal. 35 (13), 1400-1416 (2016).
  11. Spagnol, V., et al. The E3 ubiquitin ligase SCF(Fbxo7) mediates proteasomal degradation of UXT isoform 2 (UXT-V2) to inhibit the NF-κB signaling pathway. Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects. 1865 (1), 129754(2021).
  12. Teixeira, F. R., et al. Gsk3β and Tomm20 are substrates of the SCFFbxo7/PARK15 ubiquitin ligase associated with Parkinson's disease. Biochemical Journal. 473 (20), 3563-3580 (2016).
  13. Tan, M. K. M., Lim, H. J., Bennett, E. J., Shi, Y., Harper, J. W. Parallel SCF adaptor capture proteomics reveals a role for SCFFBXL17 in NRF2 activation via BACH1 repressor turnover. Molecular Cell. 52 (1), 9-24 (2013).
  14. van Wijk, S. J., Fulda, S., Dikic, I., Heilemann, M. Visualizing ubiquitination in mammalian cells. EMBO Reports. 20 (2), 1-18 (2019).
  15. Kisselev, A. F., Goldberg, A. L. Proteasome inhibitors: From research tools to drug candidates. Chemistry and Biology. 8 (8), 739-758 (2001).
  16. Bradford, M. A. Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  17. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 228, 726-734 (1970).
  18. Schröer, A., Schneider, S., Ropers, H. -H., Nothwang, H. G. Cloning and characterization of UXT, a novel gene in human Xp11, which is widely and abundantly expressed in tumor tissue. Genomics. 56 (3), 340-343 (1999).
  19. Huang, Y., et al. UXT-V1 facilitates the formation of MAVS antiviral signalosome on mitochondria. The Journal of Immunology. 188 (1), 358-366 (2012).
  20. Huang, Y., et al. UXT-V1 protects cells against TNF-induced apoptosis through modulating complex II formation. Molecular Biology of the Cell. 22 (8), 1389-1397 (2011).
  21. Sun, S., et al. UXT is a novel and essential co-factor in the NF-κB transcriptional enhanceosome. The Journal of Cell Biology. 178 (2), 231-244 (2007).
  22. Huang, X., Dixit, V. M. Drugging the undruggables: Exploring the ubiquitin system for drug development. Cell Research. 26 (4), 484-498 (2016).
  23. Rajkumar, S. V. Multiple myeloma: 2020 update on diagnosis, risk-stratification and management. American Journal of Hematology. 95 (5), 548-567 (2020).
  24. Hideshima, T., et al. The proteasome inhibitor PS-341 inhibits growth, induces apoptosis, and overcomes drug resistance in human multiple myeloma cells. Cancer Research. 61 (7), 3071-3076 (2001).
  25. Tietsche, V., et al. New proteasome inhibitors in the treatment of multiple myeloma. Hematology, Transfusion and Cell Therapy. 41 (1), 76-83 (2018).
  26. Vassilev, L. T., et al. In vivo activation of the p53 pathway by small-molecule antagonists of MDM2. Science. 303 (5659), 844-848 (2004).
  27. Kuiken, H. J., et al. Identification of F-box only protein 7 as a negative regulator of NF-kappaB signalling. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 16 (9), 2140-2149 (2012).
  28. Yuan, N., et al. Bafilomycin A1 targets both autophagy and apoptosis pathways in pediatric B-cell acute lymphoblastic leukemia. Haematologica. 100 (3), 345-356 (2015).
  29. Iconomou, M., Saunders, D. N. Systematic approaches to identify E3 ligase Substrates. Biochemical Journal. 473 (22), 4083-4101 (2016).
  30. Zhang, Z. R., Bonifacino, J. S., Hegde, R. S. Deubiquitinases sharpen substrate discrimination during membrane protein degradation from the ER. Cell. 154 (3), 609-622 (2013).
  31. Hunter, T. The age of crosstalk: Phosphorylation, ubiquitination, and beyond. Molecular Cell. 28 (5), 730-738 (2007).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

F box
Оценка убиквитилирования субстрата убиквитин-лигазой E3 в лизатах клеток млекопитающих
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.