Данный протокол представляет собой практическое руководство по хирургическому вмешательству по созданию аортальной регургитации (АР) у мыши. Оценка мышей с АР с помощью эхокардиографии и инвазивного гемодинамического измерения резюмирует ее клинически значимые характеристики эксцентрической гипертрофии, вызванной объемной перегрузкой, что позволяет предположить ее перспективное применение в изучении гипертрофии сердца.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Хирургически индуцированная объемная перегрузка сердца при аортальной регургитации у мышей
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Аортальная регургитация (АР) является распространенным заболеванием клапанов сердца, которое оказывает объемную перегрузку на сердце и представляет собой глобальную проблему общественного здравоохранения. Несмотря на то, что мыши широко используются для того, чтобы пролить свет на механизмы сердечно-сосудистых заболеваний, мышиные модели АР, особенно вызванные хирургическим вмешательством, все еще малочисленны. Здесь была подробно описана мышиная модель АР, которая хирургически индуцируется нарушением работы аортальных клапанов при эхокардиографии с высоким разрешением. В соответствии с регургитированным кровотоком, сердца мышей с АР представляют собой характерный и клинически значимый фенотип объемной перегрузки, который характеризуется эксцентрической гипертрофией и сердечной дисфункцией, о чем свидетельствует эхокардиографическая и инвазивная гемодинамическая оценка. Наше предложение, в надежной и воспроизводимой форме, представляет собой практическое руководство по созданию и оценке мышиной модели АР для будущих исследований молекулярных механизмов и терапевтических мишеней кардиомиопатии с объемной перегрузкой.
Введение
При повышенной объемной перегрузке (преднагрузке) или перегрузке давлением (постнагрузке) сердце подвергается увеличению, состоянию, называемому гипертрофией. Хотя гипертрофия сердца является компенсаторной реакцией на поддержание перфузии периферических органов до сердечной недостаточности, она также является независимым фактором риска развития основных сердечно-сосудистых событий 1,2. Объемная перегрузка является одним из важных проявлений повышенного механического напряжения. Объемная перегрузка возникает во время сердечной диастолы и вызывает эксцентрическую гипертрофию сердца, которая обычно наблюдается не только при заболеваниях клапанов, таких как аортальная регургитация и митральная регургитация, но и при терминальной стадии гипертонической болезни сердца, инфаркте миокарда, дилатационной кардиомиопатии и чрезмерной физической нагрузке. Кроме того, в клинической практике некоторые препараты, способные лучше снижать гипертрофию миокарда, индуцированную перегрузкой давлением, имеют неудовлетворительные эффекты в лечении гипертрофии миокарда, индуцированной объемной перегрузкой1. Поэтому очень важно выяснить механизм и методы вмешательства при эксцентрическом ремоделировании сердца, вызванном объемной перегрузкой. Тем не менее, такие исследования объемной перегрузки были значительно затруднены в течение длительного времени, что в значительной степени можно объяснить отсутствием моделей мелких животных, которые можно было бы легко эксплуатировать, эффективно количественно оценивать и стабильновоспроизводить.
Что касается мелких видов животных, то мыши стали основным модельным животным для исследований сердечно-сосудистых заболеваний благодаря их короткому жизненному циклу, удобству в эксплуатации, четкому геному и простоте генетическоймодификации. С точки зрения категорий моделей, по сравнению с моделями генетической модификации и моделями, обработанными лекарствами, хирургические модели имеют очевидные уникальные преимущества. Хирургическая модель позволяет избежать чрезмерного и трудоемкого разведения мышей и идентификации генов, которые необходимы для генетической модификации, а также может избежать неспецифических эффектов на экстракардиальные ткани и органы, которые трудно контролировать в моделях, получающих лекарственное лечение. В предыдущей литературе было документально подтверждено, что мышиная модель аортокавального шунта индуцирует объемную перегрузку сердца5. Тем не менее, аортокавальный шунт составляет небольшую долю эксцентрической гипертрофии сердца в клинике и вызывает бивентрикулярнуюперегрузку5, что делает его малозначимым для использования в исследовании эксцентрической гипертрофии левого желудочка. Тем не менее, порок клапанов сердца представляет собой серьезную проблему общественного здравоохранения во всем мире; По оценкам, около 15% населения в возрасте >75 лет имеют значительные клапанные заболевания6. Хотя аортальная регургитация (АР) занимает часть клапанных пороков сердца, она отчетливо вызывает эксцентрическую гипертрофию левого желудочка (ЛЖ) из-за увеличения объемной перегрузки регургитирующим кровотоком 7,8. Учитывая, что правая общая сонная артерия (ОККА) обеспечивает путь к расположению аортальных клапанов, концептуально интересно нарушить работу аортальных клапанов через ОККА, чтобы вызвать регургитирующий кровоток у мышей. Вдохновленная методами создания осциллирующего аортального потока9, мышиная модель аортальной регургитации (АР) была недавно создана в нашей лаборатории для хирургического индуцирования объемной перегрузки7. Эта мышь с дополненной реальностью демонстрирует очевидную эксцентрическую гипертрофию ЛЖ, которая является клинически преобразующим подходом и демонстрирует большой трансляционный потенциал для изучения фенотипа перегруженного сердца и лежащего в его основе механизма. Здесь была описана подробная пошаговая процедура проведения операции АР у мышей, повторенная с помощью высокочастотной эхокардиографии и инвазивной гемодинамики для обеспечения успеха операции (Рисунок 1).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Этот протокол получил этическое одобрение Комитета по уходу за животными и их использованию больницы Чжуншань Фуданьского университета и соответствует рекомендациям Руководства по уходу за лабораторными животными и их использованию (No 85-23, пересмотрено в 2011 году; Национальные институты здравоохранения, Бетесда, штат Мэриленд, США).
Эксперименты на животных проводились на самцах мышей C57BL/6J в возрасте >10 недель. Хирург в этом протоколе должен быть искусен в манипуляциях с мышиной эхокардиографией, прежде чем он / она выполнит операцию AR у мышей. Тем не менее, в большинстве научно-исследовательских институтов эхокардиография малых грызунов проводится в основном учреждении, поэтому хирург может тесно сотрудничать с основными специалистами, если не является опытным хирургом в эхокардиографии. Опыт проведения инвазивных измерений гемодинамики у мышей является плюсом.
1. Подготовка к ультразвуковой визуализации (обязательно) и инвазивному гемодинамическому измерению (по желанию)
- Запустите ультразвуковой аппарат, подключенный к датчику 30 МГц. Установите ультразвуковую платформу животного с регулируемой температурой в положение для обзора дуги аорты, при котором правая сторона мыши наклонена вверх.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется, чтобы краниальный конец ультразвуковой платформы животного был расположен по направлению к хирургу. Тем не менее, будет ли краниальный конец или каудальный конец обращен к хирургу, должно зависеть от того, с каким из них хирург чувствует себя более комфортно. - Подключите микроманометр (катетер давления) к устройству сбора данных и аналогово-цифровому преобразователю. Погрузите калибровочную кювету микроманометра в физиологический раствор для калибровки физиологического раствора.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если позволяют условия, можно также использовать напорно-объемный катетер. Мы используем катетер давления, потому что устройство для сбора данных о давлении в лаборатории собирает данные только о давлении и не имеет возможности собирать данные, связанные с объемом, хотя результаты эхокардиографии в текущем исследовании также могут очертить объемы ЛЖ.
2. Обезболивание мышей, подготовка хирургических аппаратов, изоляция ОКЮР
ПРИМЕЧАНИЕ: Хирургические инструменты должны быть стерилизованы и автоклавированы перед использованием. Все этапы рекомендуется выполнять в асептических условиях. Также рекомендуется проводить эпиляцию за 1 день до ее проведения, чтобы сэкономить время во время процедуры визуализации, свести к минимуму потенциальные нежелательные стрессовые реакции у мышей, а также сохранить грудь и конечности чистыми и сухими.
- Обезболите мышь в индукционной камере, которая подключена к вапорайзеру, установленному на 4% изофлурана, смешанного с 0,8 л/мин кислорода. Когда мышь заснет или пропадет рефлекс щипкового хвоста, извлеките животное из индукционной камеры.
- Поместите животное в лежачем положении на медную пластину, которую утепляет грелкой. Соедините его нос с носовым конусом, к которому подается 1,5% изофлуран, смешанный с 0,8 л/мин кислорода для поддержания стабильного уровня анестезии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать медную пластину, так как она удобна в очистке и устойчива к ржавчине, хотя ее можно заменить другим типом металлической пластины. - Нанесите офтальмологическую мазь на глаза, чтобы предотвратить сухость под анестезией, и прикрепите конечности к медной пластине. Удалите волосы с шеи и груди с помощью крема для депиляции и очистите депиляемую область с помощью 75% этанола.
- Подготовьте необходимые хирургические инструменты, в том числе различные щипцы и ножницы (рисунок 2А; см. Таблицу материалов).
- Сделайте продольный срединный разрез, около 1 см, на шее изогнутыми щипцами для большого пальца и прямыми ножницами, между нижней челюстью и грудиной.
- Тупо рассеките левую и правую часть щитовидной железы с помощью двух пар щипцов. С помощью изогнутых тонких щипцов для большого пальца отделите стебельчатую мышцу и жировую ткань в правой паратрахеальной области, чтобы обнажить ПККА как можно дольше. Всегда избегайте травмирования блуждающего нерва, так как это может привести к гипотензии, брадикардии и смерти (рисунок 2B).
3. Катетеризация через ОККА и восходящую аорту под ультразвуковым контролем
- Проденьте под сосуд две шелковые нити 6-0, примерно по 5 см каждая. Перевязать дистальный ОККА тугим узлом с помощью одной нити и зафиксировать два конца тугого узла рядом с головой животного для поддержания легкого натяжения ОККА. Это действие облегчит катетеризацию на последующих этапах.
- Наложите свободный узел на проксимальный отдел ПКРК с помощью второй нити. При этом запечатанный участок ОККА наполняется кровью, что облегчает его разрез.
- С помощью небольших прижимных ножниц вырежьте клиновидное отверстие, расположенное на 1-2 мм проксимальнее тугого узла, чтобы открыть ОККА. Убедитесь, что размер разреза не слишком мал для введения катетера и не слишком велик, чтобы он мог защелкнуться во время введения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Настоятельно рекомендуется делать разрез под микроскопом. Прокол небольшого отверстия в сосуде иглой 26 G является альтернативным методом. - Подготовьте пластиковый катетер, содержащий металлическую проволоку (рисунок 2C). Растяните разрез с помощью изогнутых щипцов для связывания, вставьте пластиковый катетер, содержащий металлическую проволоку, в ОККА и двигайтесь вперед к ослабленному узлу.
- Разгрузите ослабленный узел, чтобы продвинуть катетер и проволоку примерно на 2 см. Перенесите медную пластину с изображением животного на ультразвуковую платформу животного, нанесите ультразвуковой гель на шею и грудную клетку мыши, а затем осторожно проведите катетер и провод через ОККА и восходящую аорту под ультразвуковым контролем.
4. Пункция аортальных клапанов под ультразвуковым контролем
- Соберите базальные ультразвуковые данные в режиме цветного допплера и импульсно-волновой допплерографии до того, как пластиковый катетер и металлическая проволока достигнут отверстия аорты.
- С помощью ультразвукового исследования одновременно и четко показывают восходящую аорту, выходной тракт ЛЖ, катетер и провод, когда катетер и провод достигают отверстия аорты, выпячивают кончик провода из катетера и прокалывают аортальные клапаны (Рисунок 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Когда аортальный клапан перфорирован, хирург должен быть в состоянии почувствовать этот разрыв. - Немного отодвиньте катетер и проволоку от отверстия аорты и соберите данные УЗИ после перфорации в режиме цветного допплера и импульсно-волнового допплеровского режима после пункции аортальных клапанов. Поток регургитанта имеет красный цвет во время сердечной диастолы в режиме цветной допплерографии и может быть количественно подтвержден в режиме допплерографии пульсовой волны.
- Сочтите удовлетворительной пиковую диастолическую скорость аортального кровотока (ПСВа) в пределах 300-500 мм/с. Если степень кровотока в регургитанте неудовлетворительна, повторите шаг 4.2.
- Дополнительно: Примените микроманометр до и сразу после перфорации аортальных клапанов, чтобы еще раз подтвердить наличие оттока регургитанта. Для проверки необходимо снизить конечное диастолическое давление в аорте (AEDP), а пульсовое давление в аорте увеличивается примерно на 20 мм рт.ст.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подробное описание того, как использовать катетер микроманометра для выполнения инвазивного измерения гемодинамики ЛЖ, было элегантно представлено в других разделах10,11.
5. Извлечение пластикового катетера и металлической проволоки, а также периоперационный уход
- Снимите гель для ультразвука и высушите мышь стерильной марлей или салфеткой после подтверждения успешной перфорации аортальных клапанов, затем осторожно извлеките пластиковый катетер с центральной металлической проволокой, перед перевязкой ОККА.
- Закройте кожу с помощью шелкового шва 5-0 сплошным швом и нанесите раствор повидон-йода на место наложения шва. Введите мышь мелоксикамом (0,13 мг) подкожно для обезболивания и поместите мышь в предварительно подогретую клетку под согревающим светом до полного пробуждения для восстановления.
6. Фиктивная хирургия
- Выполните разделы 1-3, как описано. Для мыши, управляемой бутафорией, выполните процедуры, аналогичные тем, которые описаны в разделе 4, без нарушения работы аортальных клапанов.
- Выполните раздел 5 так, как описано, хотя АР не должен присутствовать ни у одной из мышей, управляемых имитацией.
7. Оценка перфорации аортального клапана, морфологии и функции сердца с помощью эхокардиографии и инвазивного гемодинамического измерения
- После 4 недель АР используйте эхокардиографический B-режим, режим цветного допплера и режим допплерографии пульсовой волны для оценки кровотока дуги аорты в виде дуги аорты, а также измерьте PDVa в соответствии с шагом 4.1 и другими пунктами 1,12.
- Используйте эхокардиографию в B-режиме и M-режиме для оценки размеров и сократимости ЛЖ в виде парастернальной длинной оси, с получением конечно-диастолических (LVEDD) и конечно-систолических (LVESD) размеров ЛЖ, толщины задней стенки ЛЖ в конце диастолического (LVPWTd) и конечного систолического (LVPWTs) толщина, фракции выброса ЛЖ (LVEF) и фракционного укорочения (LVFS).
ПРИМЕЧАНИЕ: Подробное описание того, как пользоваться ультразвуковым аппаратом и работать с ультразвуковыми изображениями, было элегантно описано ранее12. - После эхокардиографической визуализации проводят инвазивное измерение гемодинамики в порядке, аналогичном шагу 4.3 и в другом месте10. Запишите максимальную скорость сжатия и релаксации (+dp/dt и −dp/dt). Вставьте микроманометр в левую общую сонную артерию (LCCA, а не RCCA), так как RCCA была навсегда перевязана во время операции AR.
- После инвазивного гемодинамического измерения усыпить мышь через вывих шейки матки. Вскрыть грудную клетку, промыть сердце 10% формалином с последующим добавлением 0,9% раствора хлорида натрия, иссечь сердце, отрезав аорту, и разрезать поперечно на уровне нижнего края левого предсердия. Получение изображений с помощью световой микроскопии.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Чтобы гарантировать успешную АР, мы проверили кровоток с помощью цветной допплерографии и допплерографии пульсовой волны. У мышей с АР в цветовом допплеровском спектре дуги аорты сразу после операции наблюдался отток регургитанта (красный), который отсутствовал у фиктивных мышей (отсутствовал поток в диастоле; Рисунок 3А). Последовательно, допплерография пульсовой волны продемонстрировала устойчиво повышенный поток регургитантов у мышей с АР (рис. 3B, C<...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Хирургическая индукция АР у мышей является технически сложным, новым методом, но имеет значительную трансляционную значимость. Чтобы овладеть этой техникой, хирург должен как минимум заранее ознакомиться с анатомией шейки матки и сердца у мышей, работой с мышами и эхокардиографией. Умелая операция при инвазивном измерении гемодинамики является плюсом. Для успешной работы AR следует уделить особое внимание нескольким критически важным шагам.
Вскрытие ОКЮР являе...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.
Благодарности
Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (81941002, 82170389, 82170255, 81730009, 81670228 и 81500191), Фондом науки о лабораторных животных Комиссии по науке и технике муниципалитета Шанхая (201409004300 и 21140904400), Проектом по науке и технологиям в области здравоохранения Шанхайского нового района Пудун (PW2019A-13) и Программой отличных молодых медицинских талантов «Восходящее солнце» Шанхайской восточной больницы (2019xrrcjh03).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Медная пластина | JD.com Инк. | Настроить | 20 X 15 см или больше предварительно оплачивается |
| Изогнутые щипцы для завязывания | 66 Технологии Vision | 53324А | для растяжения и изоляции мышц, тканей и сосудов |
| Грелку | JD.com Инк. | Чанчжи 55 | Согреваем медную пластину и мышку кстати |
| Изогнутые щипцы для завязывания с длинной рукой | МЕЧЕНИЧ | ТС-15 | для растяжения сосуда |
| Металлическая проволока (нержавеющая сталь) | JD.com Инк. | Диаметр 0,18 мм | Работа с пластиковым катетером для прокола аортальных клапанов |
| Иглодержатель | Шанхай Цзиньчжун | 131110 | Наложение швов на кожу |
| Пластиковый катетер | Программное обеспечение Anilab и Инструменты | ПЭ-0402 | работа с металлической проволокой для прокола аортальных клапанов |
| Напорный катетер | Миллар Инструментс | СПР 835 | Размер 1,4F |
| Устройство сбора данных о давлении и аналогово-цифровой преобразователь | Инструменты AD | Лабораторная диаграмма 5 | Соединен с напорным катетером |
| Резать ножницами | Сучжоу Шицян | Более прочный 13Cr | для разреза кожи |
| Ножницы Smallpinping | Шанхай Цзиньчжун | YBE030 | к разделке сосуда |
| Стереомикроскоп | Корпорация Olympus | СМЗ845 | для разреза и интубации сосуда |
| Щипцы для прямого завязывания | 66 Технологии Vision | 53320А | для растяжения и изоляции мышц, тканей и сосудов |
| Тергазим ферментативный моющий | Alconox, Inc. | 13051.0 | Удаляет белковые материалы, ткани и кровь из катетера |
| Щипцы большого пальца | Сучжоу Шицян | 5307В | для зажима и растяжения кожи и мышц |
| Гель для ультразвука | ПАРКЕР | Аквасоник-100 | для передачи ультразвукового сигнала |
| Система ультразвуковой визуализации | Визуальная Соника | 2100 | включает в себя B-режим, M-модель, цветной допплер и доппер пульсовой волны |
| Испаритель | RWD Медико-биологические науки | Р540 | для анестезии |
Ссылки
- You, J., et al. Differential cardiac hypertrophy and signaling pathways in pressure versus volume overload. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 314 (3), 552-562 (2018).
- Wu, J., et al. Variations in energy metabolism precede alterations in cardiac structure and function in hypertrophic preconditioning. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 7, 602100(2020).
- Houser, S. R., et al. Animal models of heart failure: a scientific statement from the American Heart Association. Circulation Research. 111 (1), 131-150 (2012).
- Pilz, P. M., et al. Large and small animal models of heart failure with reduced ejection fraction. Circulation Research. 130 (12), 1888-1905 (2022).
- Bartelds, B., et al. Differential responses of the right ventricle to abnormal loading conditions in mice: pressure vs. volume load. European Journal of Heart Failure. 13 (12), 1275-1282 (2011).
- Badheka, A. O., et al. Trends of hospitalizations in the United States from 2000 to 2012 of patients >60 Years with aortic valve disease. The American Journal of Cardiology. 116 (1), 132-141 (2015).
- Wu, J., et al. Left ventricular response in the transition from hypertrophy to failure recapitulates distinct roles of Akt, β-arrestin-2, and CaMKII in mice with aortic regurgitation. Annals of Translational Medicine. 8 (5), 219(2020).
- Qi, Y. F. Aortic regurgitation and heart valve disease in mice. Journal of Thoracic Disease. 7 (10), 1676-1677 (2015).
- Zhou, Y. Q., Zhu, S. N., Foster, F. S., Cybulsky, M. I., Henkelman, R. M. Aortic regurgitation dramatically alters the distribution of atherosclerotic lesions and enhances atherogenesis in mice. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 30 (6), 1181-1188 (2010).
- Michel, L., et al. Real-time pressure-volume analysis of acute myocardial infarction in mice. Journal of Visualized Experiments. (137), e57621(2018).
- Wu, J., et al. Early estimation of left ventricular systolic pressure and prediction of successful aortic constriction in a mouse model of pressure overload by ultrasound biomicroscopy. Ultrasound in Medicine & Biology. 38 (6), 1030-1039 (2012).
- Li, L., et al. Assessment of cardiac morphological and functional changes in mouse model of transverse aortic constriction by echocardiographic imaging. Journal of Visualized Experiments. (112), e54101(2016).
- Toischer, K., et al. Cardiomyocyte proliferation prevents failure in pressure overload but not volume overload. Journal of Clinical Investigation. 127 (12), 4285-4296 (2017).
- Patten, R. D., Aronovitz, M. J., Bridgman, P., Pandian, N. G. Use of pulse wave and color flow Doppler echocardiography in mouse models of human disease. Journal of the American Society of Echocardiography. 15 (7), 708-714 (2002).
- Nakanishi, M., et al. Genetic disruption of angiotensin II type 1a receptor improves long-term survival of mice with chronic severe aortic regurgitation. Circulation Journal. 71 (8), 1310-1316 (2007).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
