Методическая статья

Визуализация миграции нейтрофилов в коже мыши для исследования ремоделирования субклеточных мембран в физиологических условиях

1.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/63581

⸱

10 мая 2022 г.

 ,  ,  , 
1Laboratory of Cellular and Molecular Biology, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, 2Lineberger Comprehensive Cancer Center, UNC-Chapel Hill

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Миграция нейтрофилов основана на быстром и непрерывном ремоделировании плазматической мембраны в ответ на хемоаттрактант и его взаимодействие с внеклеточным микроокружением. Здесь описана процедура, основанная на прижизненной субклеточной микроскопии для исследования динамики ремоделирования мембран в нейтрофилах, вводимых в ухо мышей под наркозом.

Аннотация

Изучение набора и функционирования иммунных клеток в тканях было очень активной областью в течение последних двух десятилетий. Нейтрофилы являются одними из первых иммунных клеток, которые достигают места воспаления и участвуют во врожденном иммунном ответе во время инфекции или повреждения тканей. До сих пор миграция нейтрофилов была успешно визуализирована с помощью различных экспериментальных систем in vitro , основанных на равномерной стимуляции, или ограниченной миграции по агарозным, или микрофлюидным каналам. Однако эти модели не повторяют сложное микроокружение, с которым нейтрофилы сталкиваются in vivo. Разработка методов, основанных на многофотонной микроскопии (МПМ), таких как прижизненная субклеточная микроскопия (ISMic), предлагает уникальный инструмент для визуализации и исследования динамики нейтрофилов с субклеточным разрешением в физиологических условиях. В частности, ухо живой мыши, находящейся под наркозом, дает экспериментальное преимущество для отслеживания интерстициальной миграции нейтрофилов в режиме реального времени благодаря его легкости доступа и отсутствию хирургического воздействия. ISMic обеспечивает оптическое разрешение, скорость и глубину захвата, необходимые для отслеживания как клеточных, так и, что более важно, субклеточных процессов в 3D с течением времени (4D). Кроме того, мультимодальная визуализация интерстициального микроокружения (т.е. кровеносных сосудов, резидентных клеток, внеклеточного матрикса) может быть легко выполнена с использованием комбинации трансгенных мышей, экспрессирующих выбранные флуоресцентные маркеры, экзогенное мечение с помощью флуоресцентных зондов, тканевую внутреннюю флуоресценцию и сигналы, генерируемые второй/третьей гармоникой. Этот протокол описывает: 1) подготовку нейтрофилов к адоптивному переносу в ухо мыши, 2) различные настройки для оптимальной субклеточной визуализации, 3) стратегии минимизации артефактов движения при сохранении физиологической реакции, 4) примеры ремоделирования мембран, наблюдаемых у нейтрофилов с использованием ISMic, и 5) рабочий процесс количественного анализа ремоделирования мембран у мигрирующих нейтрофилов in vivo.

Введение

Направленная миграция клеток является критическим событием, происходящим во время различных физиологических и патологических процессов, включая развитие, иммунный ответ, восстановление тканей, а также инициацию, прогрессирование и распространение опухоли 1,2. Этот процесс основан на специфических внеклеточных хемотаксических сигналах, воспринимаемых родственными рецепторами на плазматической мембране, а затем преобразуются в сложные внутриклеточные сигналы. Эти пути, в свою очередь, активируют миграцию клеток посредством ряда реакций, включая локальную активацию цитоскелета, транспортировку и ремоделирование мембран, а такжеполяризацию клеток. Хорошо охарактеризованы два различных типа миграции клеток: мезенхимальная и амебоидная4. Мезенхимальная миграция относительно медленная (<1 мкм/мин), зависит от сильной адгезии между клетками и внеклеточным матриксом (ВКМ) и зависит от деградации матрикса, вызванной металлопротеазами. Напротив, амебоидная миграция, характерная для иммунных клеток, быстро реагирующих на воспалительные сигналы, происходит быстрее (>10 мкм/мин) и использует слабые спайки для навигации по ВКМ. Независимо от модальности, миграция клеток требует постоянного ремоделирования плазматической мембраны, в результате чего на переднем крае клеток образуются выступающие структуры, которые тесно скоординированы с ретракцией мембраны в задней части1.

Чтобы разгадать молекулярные механизмы, лежащие в основе этих субклеточных процессов, крайне важно визуализировать динамику мембран в мигрирующих клетках с соответствующим временным и пространственным разрешением. Более того, поскольку ремоделирование мембран сильно зависит от свойств тканевого микроокружения, окружающего мигрирующие клетки, крайне важно визуализировать этот процесс непосредственно в нативной ткани, у живых животных. Это достигается с помощью прижизненной микроскопии (ВКМ)5. Самая первая визуализация ЭКО была проведена ~200 лет назад, когда экстравазация лейкоцитов была визуализирована с помощью простого трансиллюминационного микроскопа6, и после этого ЭКО использовалась в основном на полупрозрачных модельных организмах, таких как данио-рерио и дрозофила 7,8. В последние два десятилетия IVM успешно используется для исследования клеточных процессов у мышей, крыс и более крупных млекопитающих, таких как свиньи. Это стало возможным благодаря 1) значительному развитию конфокальной и многофотонной (МП) микроскопии и 2) развитию технологии редактирования генов, такой как CRISPR-Cas9, которая позволила быстро разработать различные животные модели для экспрессии флуоресцентно меченных белков и репортеров. Кроме того, визуализация отдельных клеток и их микроокружения во время таких процессов, как инициация опухоли, миграция клеток и иммунный ответ, стала возможной благодаря как другим формам экзогенного мечения, таким как системное введение красителей для мечения сосудистой сети10,11, так и возбуждению эндогенных молекул, таких как коллаген, посредством генерации второй гармоники (ГВГ)10. 12 и нервные волокна через генерацию третьей гармоники (THG)11,13. Наконец, усовершенствование методов минимизации артефактов движения, вызванных сердцебиением и дыханием, привело к развитию прижизненной субклеточной микроскопии (ISMic), которая позволила исследователям визуализировать и исследовать несколько субклеточных событий непосредственно у живых животных с уровнем разрешения, аналогичным тем, которые наблюдаются in vitro 14,15,16,17 . Примеры ISMic включают исследование динамики цитоскелета во время экзоцитоза 14,15,16,17 и эндоцитоза 15, динамическое ремоделирование цитоскелета во время миграции клеток17,18, митохондриальную локализацию и метаболизм 19,20 и передачу сигналов кальция в мозге 21.

В этом протоколе подробно описаны различные этапы и процедуры для исследования ремоделирования клеточной мембраны с субклеточным разрешением во время миграции нейтрофилов в коже уха живой мыши с использованием ISMic. Этот подход основан на ранее описанных протоколах22,23 и адаптирован для достижения более высокого пространственного и временного разрешения.

Протокол

Все эксперименты и процедуры на животных были одобрены Национальным институтом рака (National Institutes of Health, Bethesda, MD, США) Комитетом по уходу и использованию животных (протоколы LCMB-031 и LCMB-035) и соответствовали всем соответствующим этическим нормам. Для экспериментов использовались как самцы, так и самки мышей в возрасте от 2 до 6 месяцев. Мыши-хозяева mT/mG и мыши дикого типа (WT) находятся на фоне FVB/NJ, в то время как мыши LyzM-Cre x mTmG находятся на фоне C57BL/6.

1. Материалы и подготовка реагентов и инструментов

  1. Смажьте тюбики, посуду и иглы/шприцы PBS + 1% BSA (без кальция и магния) на ночь при перемешивании.
  2. Тщательно очищайте поверхности и инструменты/инструменты, используемые для работы с животными, с использованием этанола на 70% или путем автоклавирования.
    1. Для очистки нейтрофилов подготовьте следующее: 3 пробирки по 15 мл, 1 чашка 60 мм, 1 пробирка по 1,5 мл; HBSS, содержащий 10 mM HEPES (pH 7,3); раствор для лизиса эритроцитов (ACK); Histopaque 1077; и Histopaque 1119.
  3. Для инъекций нейтрофилов приготовьте следующее: 1 штприц малого объема (10 мкл), 1 иглу со скошенной углом по 33 г, изофлуран и раствор для анестезии (кетамин, ксилазин и ацепромазин в дозе 80 мг·кг-1, 2 мг·кг-1 и 4 мг·кг-1 соответственно, в физиологическом растворе).

2. Очищение нейтрофилов от мыши-донора

  1. Усыпьте мышь-донора в соответствии с местными институциональными правилами.
  2. Соберите у животного длинные кости (бедренную кость, большеберцовую кость и плечевую кость), уделяя внимание сохранению целостности костей и избегая порезов головок костей во время сбора24.
  3. В посуде диаметром 60 мм с покрытием BSA удалите мышцы и жировую ткань. Разрежьте головки костей, чтобы получить доступ к костному мозгу, а затем промойте и гомогенизируйте костный мозг с помощью шприца (игла 27 G), наполненного HBSS.
  4. Отфильтруйте раствор в пробирку с покрытием BSA объемом 15 мл с помощью фильтра 40 мкм и центрифугируйте его при 400 x g в течение 5 минут при комнатной температуре (RT).
  5. Аспирируйте надосадочную жидкость, ресуспендируйте гранулу в 1 мл ACK на 30 с для лизирования эритроцитов, а затем добавьте 9 мл HBSS для остановки лизиса. Центрифугируйте раствор при 400 x g в течение 5 минут при RT.
  6. Приготовьте ступенчатый градиент плотности в пробирке объемом 15 мл с покрытием BSA, аккуратно поместив 4 мл 1119 Histopaque на дно пробирки, а затем аккуратно наложив 4 мл 1077 Histopaque на верхнюю часть. Будьте особенно осторожны, чтобы не перепутать два слоя.
  7. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу в 2 мл HBSS. Аккуратно нанесите раствор поверх ступенчатого градиента, приготовленного выше. Вращайтесь со скоростью 1 000 x g в течение 30 минут на RT с минимально возможной скоростью ускорения и замедления («предпочтительно без тормоза»).
  8. Из верхней части пробирки аккуратно отсасывайте половину слоя 1077 Histopaque. Соберите оставшуюся половину слоя 1077 Histopaque и верхнюю половину слоя 1119 Histopaque в свежую пробирку с покрытием BSA. Мутная клеточная суспензия между двумя слоями плотности содержит преимущественно нейтрофилы.
  9. Добавьте HBSS до конечного объема 15 мл и аккуратно перемешайте, перевернув пробирку. Вращайте при 400 x g в течение 5 минут по RT.
  10. После центрифугирования повторно суспензируйте и промойте клеточную гранулу 10 мл HBSS и отжмите при 400 x g в течение 5 минут при комнатной температуре. Повторите процедуру, а затем повторно суспендируйте гранулу в 15 мл HBSS, чтобы определить количество клеток с помощью счетчика клеток. Наконец, спин и ресуспендирование клеток в 1 мл HBSS и перенос в пробирку, покрытую BSA объемом 1,5 мл.
  11. После очистки суспензию нейтрофилов в пробирке, покрытой БСА, выдерживают при осторожном перемешивании в течение 30 минут на ротаторе пробирки при ЛТ до мечения и/или инъекции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Успешная очистка дает 10-20 x 106 нейтрофилов на мышь с чистотой 95%. Чистоту оценивают с помощью проточной цитометрии с использованием ранее описанных нейтрофильных маркеров (Ly6G+, Ly6C-, Gr1+ и CD11b+)25,26.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протоколы по выделению нейтрофилов из периферической крови человека и костного мозга мышей доступны ранее24,27.

3. Мечение нейтрофилов

Примечание: Чтобы визуализировать нейтрофилы, они были выделены из мышей LyzM-Cre mT/mG , у которых миелоидные клетки экспрессируют мембранно-целевой пептид, слитый с GFP. Кроме того, очищенные нейтрофилы от мышей дикого типа (WT) были помечены in vitro. Следующие шаги описывают процедуру, используемую для мечения очищенных нейтрофилов коммерческим проникающим в клетки зеленым флуоресцентным красителем, и могут быть адаптированы к любому другому совместимому с МПМ флуоресцентному зонду по выбору.

  1. Добавьте зеленый флуоресцентный краситель (рекомендуемая производителем концентрация; в данном случае 1 мкМ) в суспензию нейтрофилов (очищенную от мыши WT) в пробирке, покрытой 1,5 мл БСА. Инкубировать в течение 30 мин при РТ при осторожном перемешивании в ротаторе с трубкой.
  2. Промойте три раза с использованием HBSS, отжмите при 400 x g в течение 5 минут при RT и повторно суспендируйте гранулу в 1 мл HBSS.
  3. Суспензию нейтрофилов в пробирке, покрытой БСА, выдерживают при осторожном перемешивании в ротаторе трубки при ЛТ до процедуры инъекции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Введение меченых нейтрофилов, проводимое сразу после мечения, является весьма предпочтительным. Однако при необходимости меченые нейтрофилы можно держать в состоянии перемешивания в течение дополнительных 10-15 мин после мечения без нарушения целостности ответа нейтрофилов in vivo. Длительное возбуждение (более 60 минут после мечения) приведет к сгущению, гибели нейтрофилов и вводящим в заблуждение наблюдениям in vivo.
  4. Непосредственно перед инъекцией суспендируйте клеточную гранулу в физиологическом растворе до плотности 2-5 х 106 клеток на 20 мкл.

4. Инъекция нейтрофилов

ПРИМЕЧАНИЕ: Анестезия должна проводиться в соответствии с рекомендациями местного Комитета по уходу за животными и их использованию.

  1. Поместите животное в закрытую камеру и введите 3%-5% изофлурана (расход 2 л/мин) с помощью калиброванного испарителя, подключенного к кислородному концентратору.
  2. Оцените, находится ли животное в бессознательном состоянии, проверив рефлекс отведения лапы при щиплении задней подушечки лапы. Затем переложите животное на грелку (37 ° C) для поддержания температуры тела. Продолжайте вводить изофлуран (1%-2%; скорость потока 0,5 л/мин) через носовой конус.
    ПРИМЕЧАНИЕ ПО БЕЗОПАСНОСТИ: Для ограничения воздействия токсичного изофлурана на персонал рекомендуется использовать систему дозаторов, оснащенную фильтрующим блоком, для повторного улавливания циркулирующего изофлурана.
  3. Чтобы оптимизировать качество изображения, удалите волоски из уха с помощью тонкого триммера. Эту процедуру также можно провести за день или два до эксперимента.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Использование крема для удаления волос не рекомендуется, так как известно, что он усугубляет воспалительную реакцию на коже мыши и приводит к артефактам визуализации.
  4. Положите животное на бок. С помощью хирургической ленты придерживайте край уха, и разровняйте его вдоль согревающей подушечки. Аккуратно наклейте ленту, чтобы не повредить ухо.
  5. Наполните шприц, оснащенный иглой 33 G, суспензией нейтрофилов (2-5 x 106 клеток на 20 мкл) и установите его на микроманипулятор.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Угол инъекции между иглой и ухом на грелке должен составлять от 10° до 30°, чтобы свести к минимуму повреждение тканей и повысить успех инъекции клеток.
  6. Аккуратно переместите иглу (скосом вверх) к уху и медленно прокалывайте кожу. Как только игла окажется внутри кожи, медленно нажмите на поршень и введите 2-3 мкл клеточной суспензии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следует избегать областей с видимыми кровеносными сосудами, так как повреждение кровеносного сосуда приводит к нежелательному и сложному иммунному ответу на инъекцию и проблемам с визуализацией.
  7. Повторите инъекцию в 2-3 разных областях уха, желательно на расстоянии 2-3 мм друг от друга. Не стоит «переполнять» ухо клеточной суспензией.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Инъекция должна быть выполнена в центр уха. Периферия уха тонкая и с ней нужно обращаться осторожно, так как ее можно легко повредить, в то время как центральная часть толще, содержит более крупные кровеносные сосуды и меньшее количество волосяных фолликулов, и может выдерживать большие объемы инъекций.
  8. Осторожно снимите хирургическую ленту и дайте животному прийти в сознание под присмотром. Дайте животному отдохнуть в течение 1 часа перед визуализацией, чтобы дать ткани и клеткам восстановиться после процедуры инъекции.

5. Анестезия при ЭКО

ПРИМЕЧАНИЕ: Более глубокая анестезия значительно улучшает качество изображения, уменьшая артефакты движения, вызванные сердцебиением и дыханием. Мышей, которым вводили нейтрофилы, подвергают химической анестезии, которая обеспечивает более глубокий седативный эффект, чем газовая анестезия. Анестезия должна проводиться в соответствии с рекомендациями местного Комитета по уходу за животными и их использованию.

  1. Через час после восстановления после инъекции нейтрофилов обезболить животных подкожной инъекцией, содержащей смесь ксилазин/кетамин/ацепромазин (80 мг·кг-1, 2 мг·кг-1 и 4 мг·кг-1 соответственно) в физиологическом растворе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения воспроизводимости и надежности результатов животные должны находиться в тепле с момента введения анестезии до конца эксперимента с помощью грелки или циркуляционной прокладки для воды, подключенной к согревающему насосу.
  2. Для поддержания анестезии в течение 1 ч следует вводить смесь кетамина/ацепромазина (40 мг·кг-1 и 2 мг·кг-1 соответственно) подкожно каждые 40 минут. Периодически наблюдайте за мышами, находящимися под наркозом, на наличие признаков сознания, проверяя рефлекс отведения лапы.
  3. Кроме того, при процедурах визуализации продолжительностью более 1 часа нанесите на глаза стерильную немедикаментозную офтальмологическую мазь, чтобы предотвратить высыхание роговицы во время анестезии и поддерживать гидратацию тела путем подкожных инъекций физиологического раствора (200 мкл каждый час).
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, система на основе перфузии с цифровым управлением может быть использована для обеспечения периодического и плавного введения раствора для анестезии и/или подачи жидкости. Автоматический драйвер шприца может быть настроен на подачу желаемого объема анестетика и обеспечение гидратации в течение более длительного периода времени. С этой целью крылатая инфузионная игла может быть введена подкожно в спинную кожу животного и закреплена хирургической лентой.

6. Визуализация

ПРИМЕЧАНИЕ: Описанная здесь конфигурация на животных и параметры визуализации оптимизированы для инвертированного многофотонного микроскопа, оснащенного одной лазерной линией для возбуждения и одновременного сбора излучений от различных флуорофоров.

  1. Перед тем, как поместить животное под наркозом на предметный столик для микроскопа, убедитесь, что микроскоп включен и что предметный столик и линзы предварительно нагреты до 37 °C. Закройте отверстие на сцене стеклянным покровным стеклом (толщина #1 или 1,5), которое совмещено с нагретой линзой.
  2. Осторожно переместите животное на сцену. Если визуализация планируется в течение длительного времени (>1 ч), нанесите офтальмологическую мазь и закрепите перфузионную систему на основе крылатой инфузии, как описано выше.
  3. Поместите каплю физиологического раствора в центр покровного стекла и поместите на него ухо, введенное нейтрофилами. Аккуратно прижмите ухо стерильной ватной палочкой по центру покровного стекла, чтобы удалить воздушные карманы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Применение физиологического раствора (или PBS) между ухом и покровным стеклом снижает преломление света из-за воздушных карманов, тем самым обеспечивая равномерный показатель преломления и превосходное качество изображения.
  4. Закрепите ухо, аккуратно прижав деревянную палочку (извлеченную из ватного тампона) к боковой стороне уха ближе к голове животного и зафиксировав ее с помощью ленты (рисунок 1А).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Закрепленная деревянная палочка сводит к минимуму артефакты движения из-за сердцебиения и дыхания и значительно повышает качество изображения. Важно отметить, что деревянная палка должна быть закреплена ровно настолько, чтобы стабилизировать ухо без нарушения кровотока.
  5. С помощью окуляра микроскопа найдите интересующую область, а затем переключитесь в режим многофотонной съемки.
  6. Установите длину волны лазерного возбуждения на 900-930 нм, чтобы обеспечить одновременный сбор GFP/зеленого флуоресцентного красителя, mTomato, а также коллагена-I (через ГВГ).
  7. Установите соответствующий набор зеркал и комбинацию фильтров на детекторах для сбора излучаемого света (полосовые фильтры: синий = 410-460 нм, зеленый = 495-540 нм, красный = 580-640 нм).
    Введенные нейтрофилы, помеченные зеленым флуоресцентным красителем, демонстрируют сильную зеленую флуоресценцию, что делает их видимыми под окуляром микроскопа, даже если они введены в более глубокие части уха.
  8. Определите параметр, наиболее подходящий для конфигурации оборудования. Даже если мигрирующие клетки можно отследить с интервалом от 30 с до 1 минуты, субклеточные события можно получить с более высокой скоростью (не менее <10 с). В приведенном ниже примере представлены две различные установки визуализации, чтобы показать разницу между классическим IVM и ISMic.
    1. В классическом подходе IVM для отслеживания миграции клеток и исследования ткани мыши-хозяина (рис. 1) используйте 30-кратный объектив и гальванический сканер с размером изображения 512 x 512 пикселей (размер пикселя 0,83 мкм), а также установите смещение по оси Z с помощью моторизованного предметного столика с шагом 2 мкм, что позволяет визуализировать объем глубиной 30 мкм каждые 30 с.
    2. В подходе ISMic к высокодинамическому ремоделированию мембран при более высоком увеличении и разрешении (рис. 2) используйте объектив с кратным увеличением и резонансный сканер с 3-кратным усреднением и размером изображения 512 x 512 пикселей (размер пикселя 0,25 мкм) и установите смещение по оси Z с помощью пьезо с шагом 1 мкм. Позволяет визуализировать объем глубиной 20 мкм каждые 4-5 с.
  9. Запускает миграцию нейтрофилов, вызывая стерильную лазерную травму. Сфокусируйте возбуждающий лазер на высокой мощности, достаточной для достижения не менее 80мВт22, на узком участке ткани (20 мкм х 20 мкм) в течение 10 с.
  10. Определите лазерную травму по сильным аутофлуоресцентным сигналам, появляющимся во всех каналах, и по результирующему изменению расположения коллагена (Рисунок 1D).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения надежных результатов травма всегда должна быть индуцирована как можно дальше от кровеносных сосудов; В случае разрыва клетки крови, высвобождающиеся в ткани, повлияют на качество визуализации, а также приведут к сильной общей иммунной реакции.
  11. Сохраните данные в конце эксперимента для дальнейшего анализа.
  12. Усыпьте животное в соответствии с местными институциональными рекомендациями. При необходимости ткань может быть собрана для фиксации и дальнейшей обработки.

7. Репрезентативный анализ данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Данные могут быть визуализированы и проанализированы с помощью программного обеспечения микроскопа, программного обеспечения сторонних производителей или специализированных программ. Процедура и используемые инструменты зависят от конкретных потребностей исследователей. Здесь показан один из примеров рабочего процесса для количественной оценки кривизны мембраны и локальных изменений площади на переднем крае и в задней части мигрирующих нейтрофилов.

  1. Откройте файлы изображений с помощью Imaris или Fiji, чтобы визуализировать миграцию нейтрофилов в 4D и определить качество эксперимента.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Компании Imaris и Fiji могут считывать формат изображений микроскопов нескольких марок.
  2. Обработайте данные с помощью следующих шагов, запустив настраиваемые скрипты кода MATLAB. Чтение выбранных файлов изображений с помощью пакета Bio-Formats28 для MATLAB. Сегментируйте каждый кадр 3D-объема с помощью алгоритмаОцу 29 для идентификации отдельных ячеек.
  3. Отслеживание идентифицированных объектов на основе минимального критерия смещения30.
  4. Определение активных контуров и границ объекта.
    1. Создание максимальной проекции для каждого объекта, идентифицированного на временном интервале.
    2. Примените функцию bwboundaries в MATLAB к max-проекции каждого идентифицированного объекта из шага 7.2 для создания 100 граничных точек.
    3. Оптимизируйте граничные точки, определенные с помощью алгоритма динамического контура, для достижения субпиксельной точности31 (рисунок 3A) с помощью функций пакета MATLAB, загруженного через http://www.iacl.ece.jhu.edu/static/gvf/.
    4. Наложите границы объекта и индекс траектории объекта, определенный трекингом на шаге 7.3, с максимальной проекцией исходного изображения для создания на выходе наложенного 2D-фильма для визуализации и ручной проверки.
  5. В наложенном видеоролике вручную выберите все объекты, определенные как перемещающиеся ячейки, исключив объекты, не являющиеся ячейками, соприкасающиеся с объектами и объекты с неполными границами. Запишите индексы отслеживания, начальные и конечные кадры траекторий каждой ячейки в электронную таблицу, которая будет использоваться в качестве входных данных для следующих шагов, реализуемых скриптами кода MATLAB.
  6. Отслеживайте точки границ ячеек от каждого кадра к следующему в соответствии с минимальным критерием смещения. Используйте функцию Polyarea в MATLAB для вычисления области, подчеркнутой соседними граничными точками на двух последовательных временных интервалах (рисунок 3C). Если локальная граница ячейки выходит за пределы ячейки, присвойте изменение области положительного знака. Если локальная граница ячейки перемещается внутрь ячейки, присвойте изменение области отрицательного знака.
  7. Измерьте локальную кривизну мембраны в каждой граничной точке для каждой рамы, подогнав соседние граничные точки к окружности (5 с каждой стороны; всего 11)32 (рис. 3B).
  8. Создавайте кимографы с помощью функции imagesc в MATLAB (рисунки 3D,E), чтобы показать изменения субклеточных особенностей с течением времени и соотнести их с положением клетки.

Результаты

Здесь представлены два различных набора результатов, иллюстрирующих классические IVM и ISMic, которые обеспечивают клеточное и субклеточное разрешение соответственно. В первом примере нейтрофилы были выделены из мыши дикого типа (WT), помечены Cell Tracker Green для окрашивания цитоплазмы и введены трансгенной мыши, экспрессирующей флуоресцентный белок, нацеленный на плазматическую мембрану (мышь mTomato, также известная как mT/mG33, рисунок 1 и фильм 1 и фильм 2). Эта мышь-реципиент позволила визуализировать структурные особенности в тканях уха, такие как кровеносные сосуды, резидентные клетки и волосяные фолликулы (рис. 1C и Видео 1) с помощью подхода на основе IVM (шаг 6.8.1). Коллагеновые волокна, выявленные с помощью ГВГ (обнаруженные на половине длины волны возбуждения), были расположены в сложной сети в дерме, куда вводились нейтрофилы. По краю волосяных фолликулов (СН) наблюдался слой эпителиальных клеток (т.е. кератиноцитов). Иногда визуализировались артефакты из остаточных волос, приводящие к локальному углублению кожи (H). Повреждения, вызванные лазером, были легко визуализированы благодаря их сильной аутофлуоресценции, обнаруженной во всех каналах, и изменениям расположения коллагена (рис. 1D). Более полное представление о 3D-архитектуре кожи и локализации введенных нейтрофилов можно оценить в фильме 1, который изображает Z-стек кожи от внешнего к внутреннему слоям и объемный 3D-рендеринг. Покадровая съемка показала, что нейтрофилы берут образцы кожи уха и взаимодействуют с ВКМ и тканями хозяина (Фильм 2). Визуализация с таким разрешением и получение Z-стека каждые 30 с позволяет отслеживать клетки и измерять параметры подвижности (т.е. скорость и направленность), но точный и детальный анализ ремоделирования мембран при таком разрешении является сложной задачей.

Во втором примере ремоделирование мембран оценивали с помощью подхода ISMic (шаг 6.8.2) с использованием mGFP-экспрессирующих нейтрофилов, выделенных из LyzM-cre mT/mG мышей и введенных животным WT (рисунок 2A, экспериментальная блок-схема). С помощью протокола ISMic (Видео 3 и неподвижные изображения на Рисунке 2B) и при лазерной травме наблюдается динамическое ремоделирование плазматической мембраны во время миграции, а также четко визуализируется образование выступов мембраны на переднем крае и ретракция задней части клеток (Рисунок 2 и Фильм 3). Покадровые последовательности, показанные в фильме 3 , показывают сложность взаимодействия с ECM. Действительно, нейтрофилы мигрировали через интерстициальное пространство, перемещаясь либо вдоль волокон, либо в пространствах между ними. Наконец, количественные аспекты, такие как изменения кривизны и изменения площади в передней и задней части ячеек, были количественно оценены для каждой временной точки. Используя в качестве примера клетку, описанную на рисунке 2В , локальную динамику плазматической мембраны анализировали с помощью алгоритмического конвейера (см. шаг 7) на основе идентификации 100 граничных точек, лежащих под поверхностью клетки (рисунок 3А). Изменения локальной кривизны (рисунок 3B) и области, подчеркнутой выступами плазматической мембраны (рисунок 3C), были рассчитаны для каждой граничной точки и представлены для каждого временного интервала в виде кимографов (рисунок 3D, E). Как передняя, так и задняя части клеток сохраняют более высокую кривизну, чем боковые стороны клеток (Рисунок 3D); отрицательные изменения области (ретракции, синие области) более заметны в задней части клеток, чем на переднем крае, где положительные изменения области более заметны (выступы, красные области) (рис. 3E).

figure-results-1
Рисунок 1: IVM нейтрофилов в коже уха мыши. (A) Схематический рисунок установки уха на предметном столике микроскопа. (B) Экспериментальная блок-схема. (C) Репрезентативное изображение кожи уха мыши mTomato, которой были введены флуоресцентно меченые нейтрофилы, с различными проекциями. Волосяной фолликул (HF), кровеносный сосуд (BV), эпидермис (E), дерма (D), базальный слой клеток (BCL) и артефакт волоса (из-за остаточного волоса на поверхности кожи, H). (D) Репрезентативное изображение кожи мыши после стерильной лазерной травмы: синий канал (справа), зеленый и красный каналы (посередине), объединенное изображение (слева). Повреждение видно в левой части изображения в виде сильного автофлуоресцентного излучения в зеленом и красном каналах, а также нарушения ВКМ, наблюдаемого образованием отверстия в волокнах коллагена-I. В C и D, Грин: нейтрофилы; Красный: ткань мыши-хозяина; Голубой: Коллаген-I ГВГ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Покадровая съемка миграции нейтрофилов mGFP в ухе мыши WT. (А) Экспериментальная блок-схема. (B) Репрезентативные кадры из фильма 3. (C) Объемная визуализация одной и той же ячейки для визуализации 3D организации мембраны. Область высокой динамики мембраны проиллюстрирована стрелкой (красная для втягивания и синяя для выступа). (D) Визуализация объема визуализируемой ячейки крупным планом и под наклоном. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Конвейер анализа для количественной оценки динамики мембраны, собранный с помощью ISMic. (A) Определение контура клетки и перераспределение граничных точек (100 граничных точек) между двумя последовательными кадрами для нейтрофилов mGFP, описанных на рисунке 2B. (B) Цветные границы представляют собой локальную кривизну мембраны, определенную для каждой граничной точки. (C) Локальная область изменяется между двумя последовательными кадрами (текущий: синий, а следующий: красный). Зелеными областями обозначены результаты отслеживания локального движения мембраны. Желтыми стрелками обозначено общее направление смещения мембраны. (D) Кривизна границы кимографа клетки во времени. Вертикальная ось представляет индексы граничных точек, где 1 и 100 представляют заднюю часть ячейки в соответствии с направлением ее миграции. (E) Кимограф локального изменения площади, отражающий выпячивание мембраны (красный) и ретракцию мембраны (синий) клетки с течением времени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Фильм 1: Меченые зеленым цветом нейтрофилы, визуализированные в ухе мыши mTomato с помощью IVM. Красный: ткань мыши-хозяина томата. Голубой: Коллаген-I ГВГ; Зеленый: нейтрофилы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот фильм.

Фильм 2: IVM нейтрофилов, мигрирующих в коже уха мыши mTomato. Видео представляют собой проекции стека изображений максимальной интенсивности, полученные за 27 минут с частотой кадров 5 кадров/с. Красный: ткань мыши-хозяина томата. Голубой: Коллаген-I ГВГ; Зеленый: нейтрофилы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот фильм.

Фильм 3: ИСМика ремоделирования мембраны во время миграции нейтрофилов в ухе мыши WT. Видео представляют собой проекции стека изображений максимальной интенсивности, полученные в течение 8 минут с частотой кадров 10 кадров/с. Красный: ткань мыши-хозяина томата. Голубой: Коллаген-I ГВГ; Зеленый: нейтрофил mGFP; Светло-зеленый: одаренный нейтрофил. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот фильм.

Обсуждение

Несмотря на десятилетия достижений в области миграции клеток и ремоделирования мембран, очень немногие исследования использовали IVM для визуализации субклеточных особенностей у живых животных. Процедуры, описанные в этом протоколе, являются мощным инструментом для получения нового представления о миграции нейтрофилов у живых животных и, в частности, о ремоделировании плазматических мембран во время этого процесса. Такой подход позволяет исследовать миграцию нейтрофилов в физиологических условиях с учетом присущей микроокружению тканей сложности. Действительно, использование МПМ позволяет визуализировать множественные особенности в ткани хозяина с помощью комбинации линий мышей, экспрессирующих выбранные флуоресцентные маркеры, экзогенное мечение тканей, возбуждение эндогенной флуоресценции и сигналы, генерируемые с помощью ГСП или THG12,13.

Одной из потенциальных проблем, которую следует учитывать в этой процедуре, является фотоповреждение. Несмотря на то, что МПМ в целом безопаснее, чем конфокальная микроскопия, в отношении фотообесцвечивания и фототоксичности, необходимо соблюдать осторожность при визуализации живых тканей34. Фототоксичность может значительно ухудшить результаты, создавая артефакты визуализации, начиная от небольших ярких пятнышек и заканчивая большими участками поврежденной ткани, или подавляя/стимулируя различные внутриклеточные пути. Для предотвращения фототоксичности мощность лазера должна быть сведена к минимуму, а также должны быть разработаны соответствующие средства контроля для проверки поддержания физиологических условий (например, измерение кровотока, зонды для окислительного стресса)35,36. Кроме того, в этой специфической процедуре, которая затрагивает кожу, настоятельно рекомендуются штаммы альбиноса, поскольку меланин, присутствующий у животных с темной шерстью, более чувствителен к фототоксичности 36,37,38.

Среди основных ограничений процедуры можно выделить используемую систему микроскопа и природу нейтрофилов. Несмотря на то, что использование МПМ значительно увеличивает глубину визуализации тканей по сравнению с другими методами световой микроскопии (например, конфокальной, вращающимся диском), возможность визуализации субклеточной динамики в ухе ограничена самыми дальними слоями ткани (80-100 мкм). Это связано с интенсивным рассеянием света, создаваемым толстым слоем ECM, что затрудняет исследование миграции в более глубоких слоях. Еще одним ограничением является тот факт, что нейтрофилы очень короткоживущие и не могут удерживаться в культуре достаточно долго, чтобы выполнять методы редактирования генов. Это можно преодолеть с помощью конструирования мышей для производства нейтрофилов, лишенных специфических генов или содержащих выбранные мутации, что, конечно, увеличивает стоимость и продолжительность исследований.

Описанные здесь процедуры, хотя и предназначены для исследования динамики мембран, могут быть адаптированы для решения любого клеточного биологического вопроса не только в нейтрофилах, но и в других типах иммунных клеток и мигрирующих клетках. Информация, собранная с помощью IVM с малым увеличением о клеточном поведении (например, миграционный фенотип, скорость и направленность клеток)22), может быть дополнена и коррелирована с механистической информацией, полученной с помощью ISMic о репозиционировании органелл, секреции белка, эндоцитозе, ядерной динамике, динамике кальция, организации цитоскелета и нетозе. Использование фармакологических и/или генетических манипуляций может подчеркнуть роль конкретных молекулярных путей в интересующем нас процессе, что делает этот подход уникальным и очень мощным.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Это исследование было поддержано внутренней исследовательской программой Национальных институтов здравоохранения, Национального института рака, Центра исследований рака.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1,5 мл пробиркиСША Scientific4036-3204
15 мл пробиркиCorning430766
1 мл шприцCovidien8881501400
27 г иглаKendall827112
27 г крылатый инфузионный наборTerumoSV*27EL
30x объективOlympusUPLSAPO30XS1,05 NA, Погружной кремний
40x объективOlympusUPLSAPO40XS1,23 NA, силиконовое масло погружение
60 мм посудаFalcon353002
шприц 6 млKendall8881516937
ацепромазин (10 мг/мл)Vet one13985-587-50
ACK лизисный буферQualityBiological 118-156-101
BalanceAndEK-1200A
BSASigma AldrichA9647
Сетчатый фильтр для ячеек 40 & микро; mSigma AldrichCLS431750
FijiImageJN/AПрограммное обеспечение для визуализации/анализа изображений
Fluoview SoftwareOlympusN/AПрограммное обеспечение для сбора
данных FVB штамм мышиJacksonN/AFVB фон
Система газовой анестезииPatterson veterinary07-8915712Link 7 модель
Green Cell трекерThermoC2925Растворенный в клеточной культуре качества ДМСО до концентрации 1 мМ (1000x)
Крем для удаления волосNairN/A
HBSS (без Ca2+, Mg2+)Gibco14175-095
HEPES 1 M pH 7.3Качество Биологический118-089-721
Histopaque 1077Sigma Aldrich10771-100ML
Histopaque 1991Sigma Aldrich11191-100ML
ImarisBitplaneN/AПрограммное обеспечение для визуализации/анализа изображений
IsofluraneVet one13985-528-40
Кетамин (100 мг/мл)Vet one13985-584-10
LyzM-cre x mT/mGсгенерировано в лабораторииN/AC57BL/6J фон
Ручной микроманипуляторWPIM3301R
MATLABMatWorksН/ДПрограммное обеспечение
для анализа mtomato штамм мышисгенерированный в лабораторииN/AmT/mG, FVB фон
Многофотонный лазерSpectra PhysicsInsight DS+
Многофотонный микроскопOlympusMPE-RS
Nanofil 10 &; L шприцWPINANOFIL
Nanofil 33 G иглаWPINF33BV-2
Объективный нагревательBioptechsN/A
Контроллер объективного нагревателяBioptechs150803
Офтальмологическая мазьMajorNDC 0904-6488-38
Концентратор кислородаCaireVisionAire 5
PBS (без Ca2+, Mg2+)Quality Biological114-058-131
Физиологический растворQuality Biological114-055-101
Сценический нагревательOkolabN/A
Контроллер сценического нагревателяOkolabH401-T
Хирургическая лента3M1538-1Гипоаллергенный
Драйвер шприцаHarvard ApparatusPHD Ultra
Грелки ParklandScientificA2789B
Согревающий насосParklandScientific TP-700
Ксилазин (100 мг/мл)Vet one13985-704-10
,

Ссылки

  1. Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. Cell migration. Comprehensive Physiology. 2 (4), 2369-2392 (2012).
  2. Oudin, M. J., Weaver, V. M. Physical and chemical gradients in the tumor microenvironment regulate tumor cell invasion, migration, and metastasis. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 81, 189-205 (2016).
  3. Devreotes, P., Horwitz, A. R. Signaling networks that regulate cell migration. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (8), 005959(2015).
  4. Alexandrova, A. Y., Chikina, A. S., Svitkina, T. M. Actin cytoskeleton in mesenchymal-to-amoeboid transition of cancer cells. International Review of Cell and Molecular Biology. 356, 197-256 (2020).
  5. Masedunskas, A., et al. Intravital microscopy. Bioarchitecture. 2 (5), 143-157 (2012).
  6. Wagner, R. Explanatory panels on physiology and development history 1839. , Leopold Voss. Leipzig, Germany. (1839).
  7. Yaniv, K., et al. Live imaging of lymphatic development in the zebrafish. Nature Medicine. 12 (6), 711-716 (2006).
  8. Vinegoni, C., et al. Mesoscopic fluorescence tomography for in-vivo imaging of developing Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (30), e1510(2009).
  9. Sack, F. -U. Intravital microscopy of pulmonary microcirculation after single lung transplantation in pigs. Transplantation Proceedings. 38 (3), 737-740 (2006).
  10. Rehberg, M., Krombach, F., Pohl, U., Dietzel, S. Label-free 3D visualization of cellular and tissue structures in intact muscle with second and third harmonic generation microscopy. PloS One. 6 (11), 28237(2011).
  11. Weigelin, B., Bakker, G. -J., Friedl, P. Intravital third harmonic generation microscopy of collective melanoma cell invasion: Principles of interface guidance and microvesicle dynamics. Intravital. 1, 32-43 (2012).
  12. Poole, J. J. A., Mostaço-Guidolin, L. B. Optical microscopy and the extracellular matrix structure: A review. Cells. 10 (7), 1760(2021).
  13. Weigelin, B., Bakker, G. -J., Friedl, P. Third harmonic generation microscopy of cells and tissue organization. Journal of Cell Science. 129 (2), 245-255 (2016).
  14. Ebrahim, S., et al. Dynamic polyhedral actomyosin lattices remodel micron-scale curved membranes during exocytosis in live mice. Nature Cell Biology. 21 (8), 933-939 (2019).
  15. Shitara, A., et al. Cdc42 negatively regulates endocytosis during apical membrane maintenance in live animals. Molecular Biology of the Cell. 30 (3), 324-332 (2019).
  16. Masedunskas, A., et al. Role for the actomyosin complex in regulated exocytosis revealed by intravital microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (33), 13552-13557 (2011).
  17. Subramanian, B. C., et al. The LTB4-BLT1 axis regulates actomyosin and β2-integrin dynamics during neutrophil extravasation. The Journal of Cell Biology. 219 (10), 201910215(2020).
  18. Yan, S. L. S., Hwang, I. -Y., Kamenyeva, O., Kehrl, J. H. In vivo F-Actin filament organization during lymphocyte transendothelial and interstitial migration revealed by intravital microscopy. iScience. 16, 283-297 (2019).
  19. Porat-Shliom, N., et al. In vivo tissue-wide synchronization of mitochondrial metabolic oscillations. Cell Reports. 9 (2), 514-521 (2014).
  20. Takihara, Y., et al. In vivo imaging of axonal transport of mitochondria in the diseased and aged mammalian CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10515-10520 (2015).
  21. Calvo-Rodriguez, M., et al. Increased mitochondrial calcium levels associated with neuronal death in a mouse model of Alzheimer's disease. Nature Communications. 11, 2146(2020).
  22. Lämmermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).
  23. Li, J. L., et al. Intravital multiphoton imaging of immune responses in the mouse ear skin. Nature Protocols. 7 (2), 221-234 (2012).
  24. Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (77), e50586(2013).
  25. Rose, S., Misharin, A., Perlman, H. A novel Ly6C/Ly6G-based strategy to analyze the mouse splenic myeloid compartment. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 81 (4), 343-350 (2012).
  26. Lakschevitz, F. S. Identification of neutrophil surface marker changes in health and inflammation using high-throughput screening flow cytometry. Experimental Cell Research. 342 (2), 200-209 (2016).
  27. Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil Isolation Protocol. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (17), e745(2008).
  28. MATLAB - Bio-Formats 6.1.0 documentation. , Available from: https://docs.openmicroscopy.org/bio-formats/6.1.0/users/matlab/index.html (2022).
  29. Otsu, N. A Threshold selection method from gray-level histograms. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9, 62-66 (1979).
  30. Crocker, J. C., Grier, D. G. Methods of digital video microscopy for colloidal studies. Journal of Colloid and Interface Science. 179, 298-310 (1996).
  31. Xu, C., Prince, J. L. Snakes, shapes, and gradient vector flow. IEEE Transactions on Image Processing: A Publication of the IEEE Signal Processing Society. 7 (3), 359-369 (1998).
  32. Driscoll, M. K., et al. Automated image analysis of nuclear shape: what can we learn from a prematurely aged cell. Aging. 4 (2), 119-132 (2012).
  33. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  34. Tauer, U. Advantages and risks of multiphoton microscopy in physiology. Experimental Physiology. 87 (6), 709-714 (2002).
  35. Débarre, D., Olivier, N., Supatto, W., Beaurepaire, E. Mitigating phototoxicity during multiphoton microscopy of live Drosophila embryos in the 1.0-1.2 µm wavelength range. PloS One. 9 (8), 104250(2014).
  36. Masedunskas, A., et al. Intravital microscopy: a practical guide on imaging intracellular structures in live animals. Bioarchitecture. 2 (5), 143-157 (2012).
  37. Ng, L. G., et al. Visualizing the neutrophil response to sterile tissue injury in mouse dermis reveals a three-phase cascade of events. The Journal of Investigative Dermatology. 131 (10), 2058-2068 (2011).
  38. Wu, X. S., et al. Melanoregulin regulates a shedding mechanism that drives melanosome transfer from melanocytes to keratinocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (31), 2101-2109 (2012).

Перепечатки и разрешения

Теги

Интравитальная микроскопиясубклеточная визуализациявизуализация кожи мышимногофотонная микроскопиядинамика плазматической мембранымодель лазерного повреждениятайм-лапс визуализациявзаимодействие с внеклеточным матриксом
Визуализация миграции нейтрофилов в коже мыши для исследования ремоделирования субклеточных мембран в физиологических условиях
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.