Модель перелома большеберцового пальца является клинически значимой моделью ортопедической травмы, включающей односторонний открытый перелом большеберцовой кости с внутренней фиксацией интрамедуллярного стержня и одновременным повреждением передней мышцы большеберцовой кости. Тепловая чувствительность в этой модели может быть измерена с помощью парадигмы нагревательной пластины 45 с.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Модель перелома большеберцового пальца: клинически значимая мышиная модель ортопедической травмы
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Модель перелома большеберцового пальца — это мышиная модель ортопедической травмы и хирургии, которая повторяет сложное повреждение мышц, костей, нервов и соединительных тканей, которое проявляется при этом типе травмы у людей. Эта модель была разработана, потому что предыдущие модели ортопедической травмы не включали одновременное повреждение нескольких типов тканей (костей, мышц, нервов) и не были по-настоящему репрезентативными для сложной ортопедической травмы человека. Поэтому авторы модифицировали предыдущие модели ортопедической травмы и разработали модель перелома большеберцовой кости и штифта. Эта модифицированная модель перелома состоит из одностороннего открытого перелома большеберцовой кости с внутренней фиксацией интрамедуллярного гвоздя (IMN) и одновременного повреждения передней большеберцовой мышцы (TA), что приводит к механической аллодинии, которая длится до 5 недель после травмы. В этой серии протоколов подробно описаны шаги по выполнению клинически значимой модели перелома большеберцовой кости при ортопедической травме с последующим модифицированным анализом горячей пластины для изучения ноцицептивных изменений после ортопедической травмы. В совокупности эти подробные, воспроизводимые протоколы позволят исследователям боли расширить свой инструментарий для изучения ортопедической боли, вызванной травмой.
Введение
Ортопедические травмы составляют 25% всех травм, ежегодно получаемых почти 500 миллионами человек во всем мире 1,2,3. Ортопедическая травма может быть связана со сложным повреждением мышц, костей, нервов и соединительной ткани, что требует госпитализации и хирургического вмешательства для обеспечения адекватного восстановления 3,4. Острая и хроническая боль после ортопедической травмы может привести к значительным физическим, психологическим и финансовым нагрузкам, которые влияют на качество жизни пациента 1,4. Кроме того, ортопедическая хирургия для стабилизации и фиксации переломов также связана с тяжелой острой и хронической послеоперационной болью 5,6,7,8,9.
Механизмы, лежащие в основе острой и хронической боли, связанной с травмой, должны быть лучше изучены для разработки более эффективных методов лечения. Для достижения этой цели необходимы надежные, воспроизводимые и клинически значимые доклинические модели. Поскольку большинство животных моделей ортопедической травмы не включали одновременное повреждение нескольких типов тканей (костей, мышц, нервов), они не были действительно репрезентативными для сложных ортопедических травм человека, например, травм после падений, автомобильных аварий или травм, связанных с войной. Поэтому мы разработали мышиную модель перелома большеберцового пальца для изучения основных проявлений такой травмы, включая повреждение костной и мышечной ткани, а также острую и хроническую боль11. Модель перелома большеберцовой кости состоит из одностороннего открытого перелома большеберцовой кости с внутренней фиксацией IMN и одновременной травмой мышцы ТА. Гистологические срезы ТА показывают повреждение мышцы, в котором развивается плотный фиброз с сопутствующей потерей крупных, зрелых мышечных волокон уже через 2 недели после травмы. Кроме того, костная мозоль перелома видна на микрокомпьютерной томографии (микрокомпьютерной томографии) через 4 недели после травмы и продолжает подвергаться ремоделированию11.
Различные анализы рефлексивного и нерефлексивного поведения могут быть использованы для оценки сенсорных и аффективных компонентов боли в модели перелома большеберцового пальца. Например, в этой модели можно использовать нити фон Фрея для демонстрации механической гиперчувствительности. Фактически, у мышей развивается длительная механическая гиперчувствительность в ипсилатеральной задней лапе после операции по перелому большеберцового пальца11. Еще одной особенно полезной поведенческой парадигмой является анализ горячей пластины, который традиционно измеряет латентность отхождения лапы от теплового стимула. Несмотря на то, что этот анализ используется уже несколько десятилетийи является поистине золотым стандартом в доклинических исследованиях боли, измерение рефлексивного поведения само по себеимеет свои ограничения. В результате мы разработали модифицированную парадигму горячей пластины, которая может захватывать элементы как рефлексивных, так и нерефлексивных реакций в условиях тепловогостимула.
Этот модифицированный анализ горячей пластины определяет задержку первоначального ответа, как и в исходном тесте горячей пластины, и увеличенный период наблюдения для регистрации дополнительных ноцифенсивных свойств. Классифицируя эти расширенные модели поведения по отдельным категориям (вздрагивание, облизывание, защита, прыжки), можно зафиксировать нерефлексивную реакцию на тепловой стимул. Вздрагивание – это быстрое удаление лапы и/или растопырение пальцев, но конечность быстро возвращается к горячей пластине. Облизывание и укус задних и передних лап определяются как вылизывание для анализа. Охрана — это непрерывное поднятие конечности за пределы момента, когда заканчивается афферентная ноцицептивная информация. Наконец, прыжки — это удаление всех четырех конечностей с поверхности горячей пластины. Эти модели поведения можно анализировать по отдельности и группировать вместе с особой тщательностью, чтобы по-прежнему отмечать начальную задержку отклика.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все методы, использованные при проведении данного исследования, были выполнены в соответствии с рекомендациями и одобрением Административной группы Стэнфордского университета по уходу за лабораторными животными (APLAC #33114) в соответствии с рекомендациями Американской ветеринарной медицинской ассоциации и Международной ассоциации по изучению боли. Мышей (C57BL/6J, возраст 9-11 недель на момент поступления, возраст 11-12 недель на момент начала исследования) содержали по 2-5 человек в клетке и содержали в течение 12-часового цикла свет/темнота в контролируемой температуре среде с ограниченным доступом к пище и воде. Самцы мышей весили около 25 г в начале исследования. Смотрите Таблицу материалов для получения подробной информации обо всех материалах, использованных в этом исследовании.
1. Базовые измерения поведения
- Поскольку мыши быстро учатся на горячей пластине, не записывайте исходный уровень для мышей в этом анализе. Вместо этого сравните мышей с контрольной группой, не получившей травм.
2. Анестезия/подготовка
- Обезболить мышь ингаляционным изофлураном 2%-4%.
- Защемление пальца ноги щипцами и использование рефлекса выпадения пальца ноги для подтверждения глубины анестезии.
- Обильно нанесите глазную смазку на глаза мыши, чтобы предотвратить сухость во время анестезии.
- Подложите под мышь кусок марли и с помощью машинки для стрижки удалите волосы с правой ноги мыши до коленного сустава.
- Очистите волосы от хирургической области с помощью марли, а затем выбросьте марлю.
- Продезинфицируйте операционную область с помощью ватного тампона, смоченного в растворе йода.
3. Хирургия
- После очистки операционной области и подтверждения глубины анестезии с помощью скальпеля сделайте разрез кожи на медиальной поверхности правой ноги от дистального отдела большеберцовой кости до проксимального отдела большеберцовой кости, остановившись на уровне нижнего коленного сустава (рисунок 1А).
- Высушите участок с помощью ватного тампона, уделяя особое внимание проксимальному отделу большеберцовой кости.
- С помощью сверла с круглым сверлом 0,6 мм просверлите отверстие на проксимальном конце большеберцовой кости на уровне бугристости большеберцовой кости, на ~2 мм дистальнее линии сустава (рис. 1B).
- Затем введите иглу 27 G через это отверстие/остеотомию вниз по медуллярной оси кости, чтобы установить канал, а затем извлеките иглу (Рисунок 1B).
- Затем с помощью костной пилы надрежьте большеберцовую кость на стыке средней и дистальной третей (~5-6 мм дистальнее места остеотомии) с латеральной стороны, вызвав травму передней мышцы большеберцовой кости (Рисунок 1D).
ВАЖНО: Медиальный доступ к перелому не приведет к мышечной травме. - Зажмите проксимальный конец большеберцовой кости, удерживайте дистальный конец большеберцовой кости между большим и указательным пальцами и используйте противодавление для завершения перелома кости (Рисунок 1C).
- Повторно введите иглу 27 G в интрамедуллярное пространство через проксимальный отдел большеберцовой кости и продвигайте ее через место перелома к дистальному сегменту кости, чтобы выровнять перелом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Керамический имплантат аналогичного размера может быть вставлен вместо иглы 27 G в областях визуализации, где металл нежелателен. Несмотря на то, что здесь имплантат не выполняется, возможным имплантатом является керамический винт (см. Таблицу материалов). - Затем разрежьте иглу/пластиковый имплантат вровень с корой большеберцовой кости с помощью режущих плоскогубцев.
- Уберите кровь и убедитесь, что кровотечение остановилось, прежде чем продолжить.
- Как только кровотечение остановится, закройте рану прерывистым шелковым швом 5-0.
ВАЖНО: Ни в коем случае не оставляйте животное без присмотра на любом этапе операции. Наблюдайте за животным до тех пор, пока оно не сможет самостоятельно мобилизоваться, и возвращайте его в кагематы только после того, как оно полностью выздоровеет.
4. После операции
- После операции вводите мышам бупренорфин 0,05 мг кг-1 путем подкожной инъекции два раза в день в течение двух дней в соответствии с местными протоколами.
- Наблюдайте за мышами в постнаркозном периоде и на протяжении исследования следующим образом: два раза в день в течение первых 2 дней, а затем ежедневно до 3 недель, а затем еженедельно.
- Оцените поведенческие изменения мышей, указывающие на сильный стресс или болезнь, такие как вялость, взъерошенная шерсть или потеря веса на >20%. Обратите внимание на любые вопросы, связанные с мобильностью и доступом к еде или воде.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хирургические журналы и журналы после ухода должны заполняться после операции и при каждом осмотре и храниться в течение неопределенного времени для аудита Комитета по уходу за животными и их использованию в учреждениях.
5. Испытание горячей плиты
ПРИМЕЧАНИЕ: Посттравматические измерения можно начинать через 7 дней после операции по перелому большеберцового пальца. Чтобы избежать эффекта обучения в этой парадигме, проведите тест один раз после операции и сравните с контрольной группой без травм.
- Настройка
- Поместите конфорку в конфигурацию так, чтобы освещение находилось над головой, а пластиковый цилиндр находился по центру пластины.
- Установите температуру на 50 °C и поместите камеру перед панелью, осторожно следя за тем, чтобы вся закрытая территория была в поле зрения.
ВАЖНО: В этом исследовании использовалась стандартная 8-битная цветная промышленная камера, которая записывает до 76 кадров в секунду.
- Проба
- Поместите мышей в комнату для тестирования не менее чем на 30 минут, чтобы они привыкли.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что в помещении для тестирования не слишком жарко или холодно, чтобы не исказить результаты. - Поместите мышь в цилиндр и начните запись.
- Записывайте движения в течение 45 секунд после первого контакта ног мыши.
- Повторите шаги 5.2.1-5.2.3 с остальными членами когорты, поддерживая температуру при каждом последующем испытании.
- Измерьте задержку (в секундах) до первого отклика (обычно вздрагивания), что является классическим результатом работы горячей плиты.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол, разработанный в этой лаборатории, дополнительно оценивает как рефлексивные (вздрагивание), так и нерефлексивные (облизывание, защита и прыжки).
- Поместите мышей в комнату для тестирования не менее чем на 30 минут, чтобы они привыкли.
- Анализ
- Оценивайте сеансы горячей плиты с помощью программы просмотра, которая предоставляет временную метку с миллисекундами.
- Рассмотрите возможность использования программного обеспечения NCH Prism на Mac OS. Загрузите это программное обеспечение бесплатно через Интернет (см. Рисунок 2 и Таблицу материалов).
- После загрузки откройте программу и нажмите на опцию «Продолжить использование демо-версии». Затем нажмите на большой зеленый знак плюса, чтобы загрузить записи с горячей пластины.
- После загрузки дважды щелкните по отдельному файлу, чтобы открыть его в формате видео. Используйте курсор в нижней части окна, чтобы медленно перетащить видео по всей длине и начать озвучивание.
ВАЖНО: Независимо от используемого программного обеспечения, обязательно смотрите видео в максимально возможном окне, чтобы избежать потери временного разрешения при перетаскивании курсора временной метки по видео.
- Отформатируйте таблицу следующим образом.
- Чтобы правильно запустить предоставленные скрипты R, напишите заголовки столбцов точно так, как указано ниже, без заглавных букв и пробелов, и в указанном порядке: mouseid, behavior, start, end.
- Вводите данные в начальный и конечный столбцы с точностью до трех знаков после запятой без ведущих нулей и двоеточий (например: 2,001)
- Для каждого видео запишите каждый случай болевого поведения (с точностью до мс). Обратите внимание, что регистрируются только случаи болевого поведения со стороны двух задних лап. Не записывайте поведение двух передних лап.
- Записывайте вздрагивание/щелчок просто как «вздрагивание», включая быстрое отведение лапы и/или разведение пальцев, но конечность быстро возвращается к горячей пластине, если они не исследуют/не ходят. Считайте вздрагивание пальцев без фактического поднятия всей лапы также вздрагиванием. Не записывайте поведение вздрагивания/пролистывания дольше 500 мс. Если запись записана как таковая, перетащите курсор через это поведение как можно медленнее, так как вполне вероятно, что в этом промежутке произошло несколько вздрагиваний и/или защит.
- Ищите длительное поднятие/защиту конечности за пределами того момента, когда заканчивается афферентная ноцицептивная информация, и запишите это как защиту.
- Записывайте вылизывание/кусание задней лапы как вылизывание.
- Запишите снятие сразу всех четырех конечностей с горячей плиты как прыжк.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если мышь вздрагивает, а затем, подняв лапу, продолжает ухаживать за ней, облизывая/защищая, а затем разделяет поведение без наложения временных меток. Создайте отдельную таблицу для каждой экспериментальной группы.
- Используйте предоставленные скрипты R, чтобы начать анализ данных.
- Используйте "Behavior_Raster_v2. R" для создания растрового графика (как показано ниже) для визуализации общего поведения.
- Используйте "Behavior_duration. R" для записи таблицы, содержащей пять листов, в рабочий каталог.
ПРИМЕЧАНИЕ: На первом листе указана общая продолжительность всех болевых поведений, задержка до первого болевого поведения и общее количество болевых поведений. Каждый последующий лист предоставляет эту информацию для индивидуального болевого поведения. - Используйте "Behavior_bins. R" для написания двух электронных таблиц; один с ячейками по 500 мс, показывающими совокупную продолжительность поведения в каждой временной точке, а другой с областью под кривой для профиля продолжительности поведения каждой мыши.
- Наконец, используйте "Cumulative_Sums.R" для написания двух электронных таблиц, но для кумулятивного суммирования поведения.
- Оценивайте сеансы горячей плиты с помощью программы просмотра, которая предоставляет временную метку с миллисекундами.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Модель ортотравмы перелома большеберцового пальца воспроизводит костное, мышечное и болевое поведение, наблюдаемое при сложной травме человека. Как показано на рисунке 1C, перелом большеберцовой кости со временем заживает, образуя мозоль на месте перелома, которая все еще видна через 4 недели после травмы. В результате бокового доступа с помощью костной пилы, описанного выше (шаг 3.5), передняя большеберцовая мышца повреждается, становясь обширно фиброзной, что проявляется в повышенном отлож...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Критические шаги в рамках протокола
Крайне важно поддерживать стерильные условия на протяжении всей операции. Кроме того, правильный уход за животными до, во время и после операции имеет первостепенное значение для успешного создания модели. Как упоминалось ранее в протоколе, при проведении операции необходимо переломить кость с боковой стороны, чтобы обеспечить травму мышц. Будьте осторожны, чтобы не сломать большеберцовую кость слишком низко (ниже рекомендуемого мес...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет соответствующих конфликтов интересов, которые можно было бы раскрыть.
Благодарности
GM получает стипендию NDSEG Graduate Fellowship и почетную стипендию Stanford Bio-X Graduate Fellowship. VLT поддерживается грантами NIH NIGMS #GM137906 и Фондом Риты Аллен.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 27 г иглы | Medsitis | 305136 | https://medsitis.com/products/bd-precisionglide-27-g-x-1-1-4-hypodermic-needles-305136?variant=39724583299 |
| 5-0 шов | esuture | SN5668 | https://www.esutures.com/product/0-in-date/2-/132-/16552-medtronic-monosof-black-18-p-11-cutting-SN5668/ |
| Спиртовые тампоны | Amazon | B00VS4F91W | https://www.amazon.com/Dynarex-Alcohol-Prep-Sterile-Medium/dp/B00VS4F91W |
| Альтернативные сверла | Rio Grande | 341602 | https://www.riogrande.com/product/BuschTungstenVanadiumRoundBur Набор0314мм/341602 |
| Насадка для пилы по кости | Amazon | B07DSXR3NY | https://www.amazon.com/dp/B07DSXR3NY |
| Бупренорфин | Fidelis Pharmaceuticals | https://ethiqaxr.com/ordering/ | |
| Керамический имплантат (альтернатива штифту) | RISystem | RIS.221.103 | https://risystem.com/platefixation/mousescrew |
| Chux (Впитывающая пеленка) | Fisher Научная | NC0059881 | мышей https://www.fishersci.com/shop/products/underpad-17x24-chux-300-cs/nc0059881#?keyword=true |
| C57BL/6J | Лаборатория Джексона | Jax #00664 | https://www.jax.org/strain/000664 |
| Ватные палочки | Uline | S-18991 | https://www.uline.com/Product/Detail/S-18991/First-Aid/Cotton-Tipped-Applicators-Industrial-6 |
| Плоскогубцы | для резкиAmazon | B076XYVS6Y | https://www.amazon.com/iExcell-Diagonal-Cutting-Nippers-Chrome-Vanadium/dp/B076XYVS6Y |
| Дрель | Жевательные | 129044 | https://www.chewy.com/dremel-cordless-dog-cat-rotary-nail/dp/156127 |
| Сверла | B00HVIGSX2 | ||
| https://www.amazon.com/Universal-Diamond-Dremel-Rotary-Tool/dp/B00HVIGSX2 Электробритва | Kent Scientific | CL9990-KIT | https://www.kentscientific.com/products/trimmer-combo-kit/ |
| Смазка для глаз | Amazon | B07H2NLCX5 | https://www.amazon.com/OptixCare-Lube-Plus-Hyaluron-Horses/dp/B07H2NLCX5 |
| Марлевые салфетки 2" x 2" | Amazon | B07GHDTB53 | https://www.amazon.com/Covidien-Curity-Sterile-Peel-Back-Package/dp/B07GHDTB53 |
| Марлевые салфетки 4" x 4" | Amazon | B00KJ6YFTC | https://www.amazon.com/Covidien-6309-Curity-Gauze-Pads/dp/B00KJ6YFTC |
| Видеокамера высокой четкости | The Imaging Source | DFK 22AUC03 | https://www.theimagingsource.com/products/industrial-cameras/usb-2.0-color/dfk22auc03/?adsdyn&gclid=Cj0KCQiA3-yQBhD3ARIsAHuHT64uIIlImBvh_ toh-3GFSgBcL_fRc1gQTDyXlqDEa Qu4n2_VbWEiRuIaAiueEALw_wcB |
| Ингаляционная анестезия система | Kent Scientific | https://www.kentscientific.com/products/vaporizer-with-vetflo-single-channel-anesthesia-stand/ | |
| Раствор йода | Amazon | B005FR7XIK | https://www.amazon.com/Dynarex-Povidone-Iodine-Scrub-Solution/dp/B005FR7XIK |
| палочки для взятия йода | Amazon | B001V9QKMG | https://www.amazon.com/POVIDONE-IODINE-SWAB-1202-25Box/dp/B001V9QKMG |
| Изофлуран | Калифорнийская аптека | для | |
| NCH Prism Программное обеспечение | https://www.nchsoftware.com/prism/index.html | ||
| пластиковый цилиндр | Amazon | B08R5KM5B6 | https://www.amazon.com/FixtureDisplays-Acrylic-Diameter-Thickness-15140-8-NPF/dp/B08R5KM5B6 |
| физиологический раствор | Fisher Scientific | NC9054335 | https://www.fishersci.com/shop/products/saline-injection-0-9-10ml/NC9054335 |
| Скальпель | Fisher Scientific | 12-000-162 | https://www.fishersci.com/shop/products/high-precision-10-style-scalpel-blade/12000162#?keyword= |
| Ручка для скальпеля | Amazon | B0056ZX1R8 | https://www.amazon.com/Swann-Morton-Scalpel-Handle-blades/dp/B0056ZX1R8 |
| Thermal установка предпочтения места | BIOSEB | BIO-T2CT | https://www.bioseb.com/en/pain-thermal-allodynia-hyperalgesia/897-thermal-place-preference-2-temperatures-choice-nociception-test.html |
Ссылки
- Edgley, C., et al. Severe acute pain and persistent post-surgical pain in orthopaedic trauma patients: a cohort study. British Journal of Anaesthesia. 123 (3), 350-359 (2019).
- Pointer, S. Trends in Hospitalised Injury, Australia: 1999-00 to 2010-11. Australian Institute of Health and Welfare. , (2013).
- James, S. L., et al. Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 354 diseases and injuries for 195 countries and territories, 1990–2017: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study. The Lancet. 392 (10159), 1789-1858 (2018).
- Shen, H., Gardner, A. M., Vyas, J., Ishida, R., Tawfik, V. L. Modeling complex orthopedic trauma in rodents: Bone, muscle and nerve injury and healing. Frontiers in Pharmacology. 11, 620485(2021).
- Gerbershagen, H. J., et al. Pain intensity on the first day after surgery: A prospective cohort study comparing 179 surgical procedures. Anesthesiology. 118 (4), 934-944 (2013).
- Clay, F. J., Watson, W. L., Newstead, S. V., McClure, R. J. A systematic review of early prognostic factors for persisting pain following acute orthopedic trauma. Pain Research and Management. 17 (1), 35-44 (2012).
- Williamson, O. D., et al. Predictors of moderate or severe pain 6 months after orthopaedic injury: A prospective cohort study. Journal of Orthopaedic Trauma. 23 (2), 139-144 (2009).
- Friesgaard, K. D., et al. Persistent pain is common 1 year after ankle and wrist fracture surgery: a register-based questionnaire study. British Journal of Anaesthesia. 116 (5), 655-661 (2016).
- Holmes, A., et al. Predictors of pain severity 3 months after serious injury. Pain Medicine. 11 (7), 990-1000 (2010).
- Guo, T. -Z., et al. Immobilization contributes to exaggerated neuropeptide signaling, inflammatory changes, and nociceptive sensitization after fracture in rats. The Journal of Pain. 15 (10), 1033-1045 (2014).
- Tawfik, V. L., et al. Angiotensin receptor blockade mimics the effect of exercise on recovery after orthopaedic trauma by decreasing pain and improving muscle regeneration. The Journal of Physiology. 598 (2), 317-329 (2020).
- Deuis, J. R., Dvorakova, L. S., Vetter, I. Methods used to evaluate pain behaviors in rodents. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 284(2017).
- Porreca, F., Navratilova, E. Reward, motivation, and emotion of pain and its relief. Pain. 158, Suppl 1 43-49 (2017).
- Corder, G. F., et al. Loss of mu-opioid receptor signaling in nociceptors, and not spinal microglia, abrogates morphine tolerance without disrupting analgesic efficacy. Nature Medicine. 23 (2), 164-173 (2017).
- Huck, N. A., et al. Temporal contribution of myeloid-lineage TLR4 to the transition to chronic pain: A focus on sex differences. Journal of Neuroscience. 41 (19), 4349-4365 (2021).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
