Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Несеквенирующий подход к быстрому обнаружению редактирования РНК

2.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/63591

⸱

21 апреля 2022 г.

 ,  , 
1Department of Bioscience and Biotechnology, Japan Advanced Institute of Science and Technology, 2BioSeeds Corporation, JAIST Venture Business Laboratory, Ishikawa Create Labo

В этой статье

Краткое содержание

Быстрое обнаружение и надежная количественная оценка событий редактирования РНК в геномном масштабе остаются сложными и в настоящее время полагаются на методы прямого секвенирования РНК. Протокол, описанный здесь, использует микротемпературный градиентный гель-электрофорез (μTGGE) в качестве простого, быстрого и портативного метода обнаружения редактирования РНК.

Аннотация

Редактирование РНК — это процесс, который приводит к посттранскрипционным изменениям последовательности в РНК. Обнаружение и количественная оценка редактирования РНК в основном зависят от методов секвенирования Сэнгера и секвенирования РНК. Однако эти методы могут быть дорогостоящими и трудоемкими. В этом протоколе портативная система электрофореза геля с градиентной микротемпературой (μTGGE) используется в качестве несеквенирующего подхода для быстрого обнаружения редактирования РНК. Процесс основан на принципе электрофореза, который использует высокие температуры для денатурации образцов нуклеиновых кислот при их перемещении по полиакриламидному гелю. В диапазоне температур фрагмент ДНК образует градиент полностью двухцепочечной ДНК к частично разделенным нитям, а затем к полностью разделенной одноцепочечной ДНК. Отредактированные РНК участки с различными нуклеотидными основаниями производят различные профили плавления в анализах μTGGE. Мы использовали подход, основанный на μTGGE, для характеристики различий между профилями плавления четырех отредактированных фрагментов РНК и их соответствующими неотредактированными (дикого типа) фрагментами. Оценки сходства паттернов (PaSSs) рассчитывались путем сравнения полосовых паттернов, полученных отредактированными и неотредактированными РНК, и использовались для оценки воспроизводимости метода. В целом, платформа, описанная здесь, позволяет обнаруживать даже одноосновные мутации в РНК простым, простым и экономически эффективным способом. Ожидается, что этот инструмент анализа поможет новым выводам молекулярной биологии.

Введение

Варианты одиночных нуклеотидов (SNV) в геномной РНК, включая варианты A-to-I, C-to-U и U-to-C, могут указывать на события редактирования РНК. Тем не менее, обнаружение SNV в РНК остается технически сложной задачей. Условно соотношение отредактированной и неотредактированной РНК определяется прямым секвенированием, аллель-специфической полимеразной цепной реакцией реального времени (ПЦР) или денатурирующей высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) приближается к 1,2,3,4,5,6. Однако эти подходы не являются особенно эффективными по времени или затратам, а их низкая точность, вызванная высоким уровнем шума, создает технологические узкие места для обнаружения SNV на основе РНК 7,8. Здесь мы описываем протокол, основанный на электрофорезе гель с температурным градиентом (TGGE) для идентификации однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) в качестве альтернативного метода, который устраняет необходимость в подходах прямого секвенирования РНК к анализу редактирования РНК.

Электрофорез является предпочтительным методом разделения и анализа биомолекул в лабораториях наук о жизни. TGGE позволяет разделять двухцепочечные фрагменты ДНК, которые имеют одинаковый размер, но имеют разные последовательности. Метод опирается на связанные с последовательностями различия в температурах плавления фрагментов ДНК и последующие изменения их подвижности в пористых гелях с линейным градиентом температуры 9,10. Плавление фрагментов ДНК генерирует специфические профили плавления. Как только домен с наименьшей температурой плавления достигнет соответствующей температуры в определенном положении в геле, произойдет переход от спиральной структуры к частично расплавленной структуре, и миграция молекулы практически остановится. Таким образом, TGGE использует как мобильность (информация о размере), так и структурные переходы фрагментов ДНК, вызванные температурой (информация, зависящая от последовательности), что делает его мощным подходом к характеристике фрагментов ДНК. Точками признаков в паттерне плавления TGGE, которые соответствуют трем структурным переходам молекулы ДНК, являются точка начальной диссоциации цепи, точка средней диссоциации цепи и точка концевой диссоциации цепи (рисунок 1). Вариации последовательностей внутри доменов, даже одноосновные различия, влияют на температуру плавления, следовательно, молекулы с различными последовательностями будут демонстрировать дискретные модели плавления (денатурации) в анализах TGGE. Таким образом, TGGE может быть использован для анализа SNV в геномной РНК и может быть бесценным высокопроизводительным методом обнаружения редактирования РНК. Это увеличение высокой пропускной способности теряется при использовании традиционного TGGE на основе гелевого электрофореза. Однако миниатюрная версия TGGE, названная microTGGE (μTGGE), может быть использована для сокращения времени электрофоретики геля и ускорения анализа с 100-кратным увеличением производительности11. Простота и компактность метода μTGGE были улучшены благодаря внедрению PalmPAGE12, применимой в полевых условиях, портативной и доступной системы гелевого электрофореза.

Здесь новый протокол на основе TGGE используется для изучения трех типов сайтов редактирования РНК (A-to-I, C-to-U и U-to-C) в четырех генах, в том числе двух из тканей Arabidopsis thaliana и двух, экспрессируемых в клетках HEK293 млекопитающих (рисунок 1A). Протокол объединяет использование PalmPAGE (аппаратное обеспечение), портативной системы для быстрого обнаружения редактирования РНК, и uMelt (программное обеспечение)13. При среднем времени работы 15-30 мин этот протокол обеспечивает быструю, надежную и простую идентификацию редактирования РНК без необходимости применения подходов к прямому секвенированию РНК.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Оптимизация целевого фрагмента

ПРИМЕЧАНИЕ: При разработке этого протокола были использованы четыре отредактированных гена, в том числе два ядерных гена (AT2G16586 и AT5G02670) от A. thaliana, а также гены, кодирующие синий флуоресцентный белок (BFP) и улучшенный зеленый флуоресцентный белок (EGFP), экспрессируемый в клетках HEK293.

  1. Для идентификации фрагментов генов с различными профилями плавления, представляющих отредактированные и неотредактированные области, сгенерируйте прогнозируемые кривые плавления с помощью веб-инструмента uMelt HETS, расширения оригинального программного обеспечения uMelt13.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот инструмент предсказывает формы кривых плавления для гетеродуплексных и гомодуплексных продуктов.
  2. Для каждого гена-мишени разработайте три пары фрагментов генов (300-324 bp в длину). Каждая пара состоит из фрагмента с отредактированным сайтом и соответствующего фрагмента дикого типа с неотредактированным сайтом, расположенного либо на 5'-концевом конце, в средней позиции, либо на 3'-концевом конце.
  3. Для дальнейшего анализа выберите неотредактированную/отредактированную пару, которая показала максимальную разницу между областями плавления на оси спиральности. Для анализа μTGGE синтезируют выбранный фрагмент гена путем амплификации ПЦР, как описано в разделе 2 ниже.
  4. Проектирование прямых и обратных праймеров с использованием программного обеспечения DNADynamo (https://www.bluetractorsoftware.com/DynamoDemo.htm) и проверка с помощью инструмента NCBI Primer-BLAST.
  5. Разбавить грунтовки в БУФЕРЕ ТЭ (10 мМ Tris-HCl, содержащем 1 мМ ЭДТА· Na2) и хранить их в концентрации 100 пмоль/мкл. Перед применением разбавляют каждую грунтовку, установленную до концентрации 10 пмоль/мкл, используя дистиллированную воду.

2. Экстракция РНК и Амплификация ОТ-ПЦР целевого фрагмента

  1. Экстракция РНК
    1. Извлекайте общую РНК из источника отредактированных и неотредактированных генов с использованием стандартных методов, таких как экстракция TRIzol14 или коммерчески доступных наборов.
    2. Выполняют синтез соответствующей кДНК с использованием стандартного протокола ОТ-ПЦР, как описано в шаге 2.2.
  2. Обратная транскрипция
    1. Добавьте 1 мкл олиго(dT) праймера, 1 мкл смеси dNTP 10 мМ, 10 мкл общей РНК и 10 мкл стерильной дистиллированной воды в микроцентрифужную трубку без нуклеазы.
    2. Нагревайте смесь при 65 °C в течение 5 мин, а затем инкубируйте на льду не менее 1 мин.
    3. Соберите содержимое трубки методом центрифугирования на максимальной скорости (12 000 х г) в течение 2-3 с и добавьте 4 мкл 5x буфера ReverTra Ace, 1 мкл 0,1 М DTT и 1 мкл M-MLV (вирус лейкемии мышей Молони) обратной транскриптазы (200 Ед/мкл, Таблица материалов).
    4. Аккуратно перемешайте, испешивая вверх и вниз. При использовании случайных грунтовок инкубируют трубку при 25 °C в течение 5 мин.
    5. Инкубируют трубку при 55 °C в течение 60 мин, а затем инактивируют реакцию нагреванием при 70 °C в течение 15 мин в цифровой сухой ванне/блочном нагревателе.
    6. Измерьте концентрацию кДНК с помощью спектрофотометра и храните ее при -25 °C.
  3. Амплификация ПЦР и подтверждающее секвенирование продуктов
    1. Добавьте следующие реагенты в безнуклеазную микроцентрифужную трубку: 4 мкл 5x Taq Polymerase Buffer, 2 мкл смеси dNTP 2 мМ, 2 мкл 25 мМ MgCl2, 1,6 мкл праймерного набора (вперед и назад; каждые 10 мМ), 2 мкл шаблона кДНК, 0,1 мкл Taq полимеразы (2,5 ЕД/мкл) и 8,3 мкл стерильной дистиллированной воды (конечный объем, 20 мкл).
    2. Выполняют ПЦР при следующих условиях циклирования: начальная денатурация при 95 °C в течение 2 мин; 35 циклов денатурации при 95 °C в течение 2 мин, отжига при подходящей температуре (в зависимости от конкретного используемого набора грунтовки) в течение 30 с и удлинения при 72 °C в течение 2 мин; а затем окончательное расширение при 72 °C в течение 7 мин.
    3. Для очистки продуктов ПЦР добавляют 2 ЕД экзонуклеазы I и 0,5 ЕД щелочной фосфатазы креветок (ExoSAP). Инкубируют трубку в термоциклере при 37 °C в течение 1 ч, затем 80 °C в течение 15 мин, а затем выдерживают при 4 °C до следующей стадии.
    4. Для подтверждающего секвенирования добавьте 11,5 мкл стерильной дистиллированной воды, 2,5 мкл прямого или обратного праймера и 1 мкл продуктов ПЦР (с ExoSAP) в новую микроцентрифужную трубку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте услуги секвенирования ДНК (например, Eurofins Genomics) для анализа секвенирования.
    5. Чтобы проверить специфичность продуктов ПЦР, выполните секвенирование как с прямыми, так и с обратными праймерами. Пары грунтовок, используемые в репрезентативном анализе, приведены в таблице 1.
    6. Очищенные продукты ПЦР разбавляют до концентрации 200 нг/мкл деионизированной водой. Затем смешайте 6 мкл очищенного продукта с 3 мкл 6-кратного гелевого нагрузочного красителя в пробирке объемом 250 мкл и увеличьте общий объем до 12 мкл стерильной водой. Хранить препарат ПЦР (при -25 °C) до готовности к приему μTGGE, как описано ниже.

3. Анализ μTGGE

ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ μTGGE выполняется с использованием миниатюрной и экономической системы. Обзор всей системы, включая гелевые кассеты, держатель для гелевых кассет, горизонтальную платформу для гелевого электрофореза, блок питания и систему визуализации геля, показан на рисунке 2.

  1. Сборка гелевых кассет
    1. Гелевая кассета, используемая для анализа μTGGE, показана на рисунке 2А. Конструкция состоит из трех 1-дюймовых гелевых пластин: нижней гелевой пластины, верхней гелевой пластины и пластины с полосовым оперением. Поместите верхнюю гелевую пластину между двумя другими пластинами и соберите в держатель для гелевой кассеты для полимеризации геля.
  2. Препарат полиакриламидного геля
    1. Добавить 7,2 г мочевины в пробирку объемом 50 мл и растворить в 10 мл стерильной воды. Нагрейте образец в микроволновой печи в течение 20-30 с, а затем доведите его до комнатной температуры (RT).
    2. Добавьте в раствор 3 мл 5x буфера Tris/borate/EDTA (TBE) (Таблица материалов), 2,25 мл 40% (мас./об.) акриламида/биса (19:1), 75 мкл 10x персульфата аммония и 15 мкл тетраметилэтилендиамина.
    3. Немедленно медленно налейте раствор геля в держатель для гелевой кассеты, избегая образования пузырьков воздуха.
  3. Генерация профилей плавления с помощью установки μTGGE
    1. Используйте миниатюрную, экономичную версию аппарата μTGGE, показанную на рисунке 2 , с градиентом температуры (25-65 °C), установленным перпендикулярно направлению миграции ДНК.
    2. Замочите верхнюю и нижнюю буферные прокладки электрофореза (0,5 см х 2,5 см) в 2 мл 1 буфера TBE.
    3. Поместите гелевую кассету в горизонтальный блок камеры электрофореза и расположите верхнюю и нижнюю буферные прокладки соответствующим образом, как показано на рисунке 2.
    4. Затем загрузите 10 мкл продукта ПЦР в среднюю (более длинную) лунку и 1 мкл продукта ПЦР в каждую боковую лунку.
    5. После 1 мин ожидания подключите блок питания и подайте напряжение 100 В в течение 12 мин при линейном температурном градиенте от 25-65 °C.
    6. После того, как пробег завершится, достаньте кассету и снимите верхнюю стеклянную крышку.
    7. Налейте на гель 300 мкл 10-кратного пятна SYBR Gold. Визуализируйте плавильные профили с помощью синего светодиодного фонарика, установленного в электрофоретическом устройстве размером с ладонь.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мягкий файл изображения геля должен быть сохранен для расчета показателя сходства паттернов (PaSS).
    8. Повторите каждый электрофоретический эксперимент 3 раза, чтобы подтвердить воспроизводимость данных.

4. Расчеты PaSS

ПРИМЕЧАНИЕ: Расчеты выполняются с помощью программного обеспечения μTGGE Analyzer.

  1. Загрузите и откройте программное обеспечение.
  2. Откройте файл JPEG, содержащий изображение геля. Обратите внимание, что программное обеспечение будет принимать только файлы формата JPEG.
  3. Нажмите на кнопку Frame (Рамка ) и выберите соответствующую область (рамку) гелевого изображения.
  4. Нажмите на кнопку Coordinate Correction (Коррекция координат ) и добавьте две опорные точки, как показано на рисунке 1B.
  5. Нажмите кнопку Добавление точек функций и добавьте точки выборки, как показано на рисунке 1B. Затем сохраните обработанные данные изображения геля в формате μTGGE (*.tgg).
  6. Нажмите кнопку «Образец» и выберите опцию «Поиск простых точек», чтобы сравнить два или более изображений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Использование μTGGE для идентификации изменений однонуклеотидного основания в событиях редактирования РНК
Для этого протокола использовались четыре отредактированных гена (таблица 1), включая ген BFP, продуцируемый в клетках HEK293 (с редактированием C-to-U РНК ферментами деаминазы аполипопротеина B мРНК, редактирующего ферментный комплекс; APOBEC115), ген EGFP, содержащий охристый стоп-кодон (TAA), продуцируемый в клетках HEK293 (с редактированием РНК A-to-I а...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Редактирование РНК играет важную роль в биологии; однако современные методы обнаружения редактирования РНК, такие как хроматография и секвенирование, представляют собой несколько проблем из-за их высокой стоимости, чрезмерных временных требований и сложности. Протокол, описанный здесь, представляет собой простой, быстрый и экономически эффективный метод обнаружения редактирования РНК, который использует портативную, микроразмерную систему на основе TGGE. Эта система может быть использована для дифференциации отредактиров...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантом на научные исследования от Японского общества содействия науке (17H02204 и 18K19288). Ручика получил финансовую поддержку японского правительства (стипендия MEXT). Мы благодарим г-жу Радхику Бияни (Лаборатория Такаги, JAIST) и д-ра Кирти Шарму (Корпорация BioSeeds) за помощь в проведении экспериментов, связанных с электрофорезом.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2U ExoIТакара2650AЭкзонуклеаза I
40(w/v)%-акриламид/бис (19:1)ТермофишерAM9022
Персульфат аммония (APS)Термо Фишер17874
Центрифуга Мини-спинЭппендорф5452000034
Цифровая сухая ванна/блочный обогревательТермофишерNA
Смесь Gold Taq Polymerase MasterPromegaM7122
LATaq ДНК-полимеразаТАКАРАRR002ATaq полимераза
micro-TGGE  Держатель для кассетBioSeeds Corp.BS-GE-CH
микро-TGGE аппаратLifetech Corp.TG
micro-TGGE гель-кассетаBioSeeds Corp.BS-TGGE-C
NanoDrop 1000ТермофишерND-1000Спектрофотометр
Мини-комплект Plant RneasyЦягэн74904
ReverTra Ace Master MixTOYOBOTRT101M-MLV (вирус мышиного лейкоза Молони) обратная транскриптаза
Комплект Rneasy MiniЦягэн74104
Щелочная фосфатаза креветокТакара2660B
SYBR Gold окрашивается гель-окрашиванием нуклеиновой кислотыТермофишерS11494
Буфер TBEТермофишерB52
Тетраметилэтилендиамин (TEMED)Теск Накалая33401-72
Тестировали мочевину, нуклеазу и протеазуТеск Накалая35940-65

Ссылки

  1. Chateigner-Boutin, A. L., Small, I. A rapid high-throughput method for the detection and quantification of RNA editing based on high-resolution melting of amplicons. Nucleic Acids Research. 35 (17), 114(2007).
  2. Chen, Y. C., et al. A real-time PCR method for the quantitative analysis of RNA editing at specific sites. Analytical Biochemistry. 375 (1), 46-52 (2008).
  3. Barbon, A., Vallini, I., La Via, L., Marchina, E., Barlati, S. Glutamate receptor RNA editing: a molecular analysis of GluR2, GluR5 and GluR6 in human brain tissues and in NT2 cells following in vitro neural differentiation. Molecular Brain Research. 117 (2), 168-178 (2003).
  4. Gallo, A., Thomson, E., Brindle, J., O'Connell, M. A., Keegan, L. P. Micro-processing events in mRNAs identified by DHPLC analysis. Nucleic Acids Research. 30 (18), 3945-3953 (2002).
  5. Schiffer, H. H., Heinemann, S. F. A Quantitative method to detect RNA editing events. Analytical Biochemistry. 276 (2), 257-260 (1999).
  6. Burns, C. M., et al. Regulation of serotonin-2C receptor G-protein coupling by RNA editing. Nature. 387 (6630), 303-308 (1997).
  7. Marian, A. J. The bottleneck in genetic testing. Circulation Research. 117 (7), 586-588 (2015).
  8. Bird, A. Genome biology: Not drowning but waving. Cell. 154 (5), 951-952 (2013).
  9. Jones, B. M., Knapp, L. A. Temporal temperature gradient electrophoresis for detection of single nucleotide polymorphisms. Methods in Molecular Biology. 578, Clifton, N.J. 153-165 (2009).
  10. Riesner, D., et al. Temperature-gradient gel electrophoresis of nucleic acids: analysis of conformational transitions, sequence variations, and protein-nucleic acid interactions. Electrophoresis. 10 (5-6), 377-389 (1989).
  11. Biyani, M., Nishigaki, K. Hundred-fold productivity of genome analysis by introduction of micro-temperature gradient gel electrophoresis. Electrophoresis. 22 (1), 23-28 (2001).
  12. Rathore, H., Biyani, R., Kato, H., Takamura, Y., Biyani, M. Palm-size and one-inch gel electrophoretic device for reliable and field-applicable analysis of recombinase polymerase amplification. Analytical Methods. 11 (39), 4969-4976 (2019).
  13. Dwight, Z., Palais, R., Wittwer, C. T. uMELT: prediction of high-resolution melting curves and dynamic melting profiles of PCR products in a rich web application. Bioinformatics. 27 (7), 1019-1020 (2011).
  14. Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA using TRIzol (TRI Reagent). Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), (2010).
  15. Bhakta, S., Sakari, M., Tsukahara, T. RNA editing of BFP, a point mutant of GFP, using artificial APOBEC1 deaminase to restore the genetic code. Scientific Reports. 10 (1), 17304(2020).
  16. Azad, T. A., Qulsum, U., Tsukahara, T. Comparative activity of adenosine deaminase acting on RNA (ADARs) isoforms for correction of genetic code in gene therapy. Current Gene Therapy. 19 (1), 31-39 (2019).
  17. Ruchika, O. C., Sakari, M., Tsukahara, T. Genome-wide identification of U-To-C RNA editing events for nuclear genes in Arabidopsis thaliana. Cells. 10 (3), 635(2021).
  18. Tsukahara, T. The U-to-C RNA editing affects the mRNA stability of nuclear genes in Arabidopsis thaliana. Biochemical and Biophysical Research Communications. 571, 110-117 (2021).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Микро-TGGEэлектрофорез в градиенте температурдетектирование модификаций РНКанализ профиля плавленияполиакриламидный гельпоказатель сходства паттерновПЦР-амплификациясинтез кДНКокрашивание SYBR Gold
Несеквенирующий подход к быстрому обнаружению редактирования РНК
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.