Заживление ран роговицы рыбок данио: от истирания до анализа закрытия раны

Краткое содержание

Этот протокол фокусируется на повреждении глазной поверхности рыбок данио путем истирания для оценки последующего закрытия раны на клеточном уровне. Этот подход использует глазной заусенец для частичного удаления эпителия роговицы и использует сканирующую электронную микроскопию для отслеживания изменений в морфологии клеток во время закрытия раны.

Аннотация

Как прозрачная поверхность глаза, роговица играет важную роль в ясном зрении. Благодаря своему расположению эта ткань склонна к экологическим нарушениям. Действительно, травмы глаз, наиболее часто встречающиеся клинически, - это травмы роговицы. В то время как заживление ран роговицы широко изучалось у мелких млекопитающих (то есть мышей, крыс и кроликов), исследования физиологии роговицы пренебрегли другими видами, включая рыбок данио, несмотря на то, что рыбки данио являются классической исследовательской моделью.

В этом отчете описывается метод выполнения истирания роговицы на рыбках данио. Рана выполняется in vivo на обезболенных рыбах с помощью глазного заусенца. Этот метод позволяет воспроизвести эпителиальную рану, оставляя остальную часть глаза нетронутой. После истирания контролируется закрытие раны в течение 3 ч, после чего рана реэпителизируется. С помощью сканирующей электронной микроскопии с последующей обработкой изображений можно исследовать форму эпителиальных клеток и апикальные выступы для изучения различных этапов закрытия эпителиальной раны роговицы.

Характеристики модели рыбок данио позволяют изучать физиологию эпителиальной ткани и коллективное поведение эпителиальных клеток при оспаривании ткани. Кроме того, использование модели, лишенной влияния слезной пленки, может дать новые ответы относительно реакции роговицы на стресс. Наконец, эта модель также позволяет очертить клеточные и молекулярные события, участвующие в любой эпителиальной ткани, подвергшейся физической ране. Этот метод может быть применен для оценки эффективности препарата при доклинических испытаниях.

Введение

Поскольку большинство эпителиев находятся в контакте с внешней средой, они склонны к физическим травмам, что делает их хорошо подходящими для изучения процессов заживления ран. Среди хорошо изученных тканей роговица является чрезвычайно полезной моделью в исследовании клеточных и молекулярных аспектов заживления ран. Как прозрачная внешняя поверхность, он обеспечивает физическую защиту глаза и является первым элементом, который фокусирует свет на сетчатке. Хотя структура и клеточный состав сетчатки различаются между видами¹, эти элементы роговицы, как правило, похожи во всех глазах камерного типа, независимо от вида.

Протокол

Все эксперименты были одобрены национальным советом по экспериментам на животных.

1. Препараты

1. Подготовьте раствор трицина, используемый для анестезии²⁶ заранее (0,4% раствор, используемый в этом протоколе). Используйте перчатки и храните материалы в вытяжном капюшоне, когда это возможно.
   1. На 50 мл 0,4% раствора взвесьте 200 мг порошка трикаина в пробирке объемом 50 мл. Растворите порошок примерно в 45 мл двухдистиллированной воды.
   2. Отрегулируйте рН раствора трицина до 7 с 1 М Трис (рН 8,8, ~1,25 мл). Добавьте раствор Триса в запас трикаина в аликвотах, тщательно перемешайт....

Результаты

Это исследование описывает метод с использованием офтальмологического заусенца в экспериментах по заживлению ран роговицы рыбок данио. Метод модифицирован по сравнению с предыдущими исследованиями на мышах, где было показано, что заусенец эффективно удаляет эпителиальные клеточные слои¹³. Проблемы при ранении роговицы рыбок данио включают относительно небольшой размер глаза, а в случае трудоемких экспериментов необходимость поддержания постоянного потока воды через жабры (как описано Сюй и его кол.......

Обсуждение

Физические травмы роговицы являются наиболее распространенной причиной визитов пациентов офтальмологии в больницу. Поэтому важно установить соответствующие модели для изучения различных аспектов патофизиологии роговицы. До сих пор мышь является наиболее часто используемой моделью для изучения заживления ран роговицы. Тем не менее, добавление глазных капель на мышиные раненые глаза для подтверждения влияния конкретных препаратов на заживление ран роговицы может быть затруднено. В этом отношении модель рыбок данио особенно.......

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
0,1M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7,4			раствора готовят из 1M sodium phosphate buffer (1M Na2 HPO4 отрегулированного до pH 7,4 с 1M2 PO4 ).
0,2M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7,4	Собственный		раствор получают из 1M натрий-фосфатного буфера (1M Na2 HPO4 отрегулированного до pH 7,4 с 1M2 PO4 ).
Наконечники с заусенцами 0,5 мм	Alger Equipment Company	BU-5S
1M Tris, pH 8,8	Собственные
клейкие вкладки	Agar Scientific	G3347N
Жернов Algerbrush, Полный инструмент	Alger Equipment Company	BR2-5
Хлопковые свопы	Heinz Herenz Hamburg	1030128
Препарирующая пластина	Мануфактурные
инструменты для препарирования	Fine Science Tools
двойная дистиллированная вода	на мануфактуре
Eppedorf tubes, 2 мл	любой поставщик
Этил3-аминобензоат метансульфонат соль	Sigma	A5040	Внимание: вызывает раздражение.
Глутаральдегид, 50% водный раствор, марка I	Sigma	G7651	Внимание: токсичен.
Лидокаина гидрохлорид	Sigma	L5647	Внимание: токсичен.
крепления	Agar Scientific	G301P
чашка Петри	Thermo Scientific	101VR20
индикаторные полоски	pH Macherey-Nagel	92110
Пластиковые ложки	любого поставщика
Пластиковые тубы, 15 мл	Greiner Bio-One	188271
Пластиковые тубы, 50 мл	Greiner Bio-One	227261
Сканирующий электронный микроскоп	FEI	Quanta 250 FEG
Мягкая губка	любого поставщика
Распылитель Coater	Quorum Technologies	GQ150TS
Стереомикроскоп	Leica

собственного