Методическая статья

Выделение, расширение и дифференцировка мезенхимальных стволовых клеток из инфрапателлярной жировой подушки козьего удушающего сустава

DOI:

10.3791/63617

⸱

2 августа 2022 г.

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences and Bioengineering, Indian Institute of Technology-Kanpur, 2The Mehta Family Centre for Engineering in Medicine, Indian Institute of Technology-Kanpur, 3Mechanobiology Institute, National University of Singapore

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Инфрапателлярные жировые мезенхимальные стволовые клетки (IFP-MSCs) могут быть легко выделены из инфрапателлярной жировой подушки коленного сустава. Они хорошо размножаются in vitro, образуют колонии КОЕ-F и дифференцируются на адипогенные, хондрогенные и остеогенные линии. Здесь приведена методология выделения, расширения и дифференциации ИФП-МСК от козьего удушающего сустава.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

IFP, присутствующий в коленном суставе, служит перспективным источником МСК. IFP является легкодоступной тканью, поскольку она обычно резецируется и выбрасывается во время артроскопических процедур и операций по замене коленного сустава. Кроме того, его удаление связано с минимальной заболеваемостью донорским участком. Недавние исследования показали, что IFP-МСК не теряют своей способности к пролиферации во время расширения in vitro и обладают независимым от возраста остеогенным дифференцировочным потенциалом. IFP-MSC обладают превосходным хондрогенным дифференцировочным потенциалом по сравнению с МСК, полученными из костного мозга (BMSCs) и стволовыми клетками, полученными из жировой ткани (ADSCs). Хотя эти клетки легко доступны от пожилых и больных пациентов, их эффективность ограничена. Следовательно, использование IFP-MSC от здоровых доноров важно для определения их эффективности в биомедицинских приложениях. Поскольку доступ к здоровому человеческому донору является сложной задачей, животные модели могут стать лучшей альтернативой для обеспечения фундаментального понимания. Крупные животные, такие как собаки, лошади, овцы и козы, играют решающую роль в трансляционных исследованиях. Среди них коза может быть предпочтительной моделью, поскольку удушающий сустав козы имеет наиболее близкую анатомию к коленному суставу человека. Кроме того, коза-IFP может выполнять более высокие показатели MSC, необходимые для применения регенерации тканей. Кроме того, низкая стоимость, доступность и соответствие принципам 3R для исследований на животных делают их привлекательной моделью. Данное исследование демонстрирует простой протокол выделения IFP-МСК из удушающего сустава коз и условий культивирования in vitro для их расширения и дифференцировки. Асептически изолированный ИФП от козы промывали, измельчали и переваривали ферментативно. После фильтрации и центрифугирования собранные клетки культивировали. Эти клетки были адгезивными, имели морфологию, подобную МСК, и демонстрировали замечательную клоногенную способность. Кроме того, они дифференцировались на адипогенные, хондрогенные и остеогенные линии, демонстрируя свою мультипотентность. В заключение, исследование демонстрирует выделение и расширение МСК, которые показывают потенциал в тканевой инженерии и регенеративной медицине.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) являются привлекательным кандидатом для клеточной терапии в регенеративной медицине 1,2. Они могут быть собраны из различных тканевых источников, таких как костный мозг, пуповина, плацента, пульпа зуба и подкожная жировая клетчатка3. Однако, поскольку доступность стволовых клеток у взрослых ограничена, а процедура их изоляции часто является инвазивной (что приводит к заболеваемости донорским участком), желательно иметь альтернативный источник стволовых клеток, который мог бы обойти эти проблемы.

Коленный сустав представляет собой депо различных типов клеток, таких как МСК, полученные из инфрапателлярной жировой прокладки, МСК, полученные из синовиальной мембраны, МСК, полученные из синовиальной жидкости, фибробласты связок, суставные хондроциты и т. Д. 4,5,6. Эти клетки имеют потенциал для широкого изучения в исследованиях на основе инженерии костно-мышечной ткани. Таким образом, коленный сустав может быть возможным и надежным источником нескольких типов МСК. Жировое депо, расположенное в коленном суставе, известное как инфрапателларная жировая подушка (IFP) или жировая подушка Хоффы, является перспективным и альтернативным выбором депо MSC. IFP является относительно легкодоступным и клинически доступным источником МСК, поскольку он обычно резецируется и выбрасывается как хирургические отходы во время артроскопии коленного сустава или открытой хирургии коленного сустава. Удаление IFP связано с минимальной заболеваемостью донорским участком, что также делает его привлекательным источником тканей. Имея аналогичный фенотипический профиль, МСК из IFP (IFP-MSC) обладают повышенным клоногенным потенциалом по сравнению с мезенхимальными стволовыми клетками, полученными из костного мозга (BM-MSC)6, и лучшей пролиферативной способностью по сравнению с подкожными стволовыми клетками, полученными из жировой клетчатки (ADSCs)7. Интересно, что по сравнению с МСК, полученными из синовиальной жидкости (SF-МСК), IFP-МСК не теряют свою пролиферативную способность при поздних проходах и не увеличивают время удвоения при поздних проходах. Это говорит о том, что во время клеточного расширения IFP-MSC могут достигать достаточно большого количества клеток для применения в тканевой инженерии in vitro без ущерба для скорости их пролиферации8. Недавние исследования также показали, что IFP-МСК обладают превосходным хондрогенным потенциалом дифференцировки по сравнению с МСК, полученными из костного мозга (BMSCs) и МСК, полученными из жировой ткани (ADSCs), вероятно, из-за их анатомической близости к суставному хрящу, что указывает на их пригодность для инженерии хрящевой ткани 6,7,9,10. Кроме того, они также обладают возрастно-независимым остеогенным потенциалом дифференциации11. Было показано, что внутрисуставная инъекция IFP-MSC уменьшает боль и улучшает функции коленного сустава у пациентов с остеоартритом (ОА)12,13. Кроме того, также сообщалось о сильных иммуносупрессивных реакциях и улучшенных иммуномодулирующих свойствах IFP-MSC в присутствии воспалительных цитокинов во время патологических состояний6.

IFP-MSC являются многообещающим и альтернативным источником МСК; однако их терапевтическая польза в тканевой инженерии и регенеративной медицине относительно менее изучена. В существующих исследованиях IFP-MSC в основном использовались клетки человеческих доноров. Среди них в нескольких недавних исследованиях изучались IFP-МСК от здоровых доноров человека (пациенты без артрита, в возрасте 17-60 лет) 6,14, тогда как в большинстве исследований использовались IFP-MSC от пожилых пациентов, перенесших операцию по полной замене коленного сустава (больные пациенты в возрасте 70-80 лет). Поскольку известно, что как возраст, так и болезнь изменяют нормальное функционирование стволовых клеток (уменьшение количества и потеря функционального потенциала), это потенциально может привести к несоответствиям в результатах исследований на основе MSC 7,15,16,17. Кроме того, использование IFP-МСК у пациентов с патофизиологическими состояниями (например, артритом и ожирением) также создает трудности для понимания основных характеристик здоровых клеток in vitro, тем самым выступая в качестве ограничивающего фактора в разработке терапии на основе МСК. Для преодоления этих проблем жизненно важно использование IFP-MSC от здоровых доноров. Поскольку доступ к здоровому человеческому донору является сложной задачей, животные модели могут быть лучшей альтернативой. В связи с этим есть несколько исследований, в которых IFP был выделен от мышей18. Однако из-за небольшого размера жировой подушки у нормальных мышей жировые ткани нескольких животных были объединены, чтобы получить достаточное количество ткани для выполнения сложных экспериментальных процедур19. Следовательно, существует потребность в большой животной модели, которая могла бы удовлетворить требование к большему количеству клеток и одновременно соответствовать принципам 3R (уточнение, замена и уменьшение) в исследованиях на животных20. Использование крупных животных имеет значительные последствия в трансляционных исследованиях. В частности, в области тканевой инженерии опорно-двигательного аппарата был исследован ряд крупных животных, таких как собаки, свиньи, овцы, козы и лошади21. Коза (Capra aegagrus hircus) является отличным выбором крупного животного, так как ее удушающий сустав имеет самую близкую анатомию к коленному суставу человека 22,23,24. Субхондральная костная трабекулярная структура и толщина субхондральной кости коз аналогичны человеческим, а соотношение хряща к кости также, как сообщается, близко к человеческому21. Кроме того, козы были широко одомашнены по всему миру, что делает их легко доступными, когда они скелетно зрелые. Кроме того, низкие затраты на техническое обслуживание и простота в обращении сделали их привлекательной моделью животных для исследования22.

В настоящем исследовании продемонстрирован простой протокол выделения ИФП-МСК из удушающего сустава Capra aegagrus hircus (козы) и условия культивирования in vitro для их расширения и дифференциации. Изолированные клетки являются адгезивными, имеют MSC-подобную морфологию, образуют колонии КОЕ-F (колониеобразующие единицы-фибробласты) и обладают адипогенным, хондрогенным и остеогенным дифференцировочным потенциалом. Таким образом, IFP-MSC демонстрируют потенциал в качестве альтернативного источника МСК для биомедицинских применений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол основан на выделении IFP-MSC от коз. Козий ИФП и кровь были собраны с местной скотобойни. Поскольку такие коллекции тканей не входят в компетенцию Институционального комитета по этике животных, этическое одобрение не требовалось.

1. Выделение ИФП-МСК из бедренно-сустава козьего колена

  1. Соберите козий бедренный сустав (образец), охватывающий ~ 15 см каждая из бедренной и большеберцовой областей задних конечностей. Немедленно поместите образец в стерилизованную коробку для сбора проб и храните его при 4 °C для транспортировки в лабораторию для дальнейшей обработки. Обрабатывайте образцы асептически в шкафу биобезопасности, используя стерилизованные хирургические инструменты на протяжении всей процедуры (рисунок 1, шаг 1).
  2. Поместите образец на чашку Петри толщиной 150 мм и тщательно промойте его автоклавным фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS), дополненным антибиотиками (5 мкг / мл амфотерицина B, 200 ЕД / мл пенициллина-стрептомицина и 50 мкг / мл ципрофлоксацина), чтобы избежать загрязнения. Всегда следите за тем, чтобы образец поддерживался гидратированным с помощью PBS.
  3. Внимательно изучите анатомические области образца. Для облегчения доступа к суставной капсуле убедитесь, что дополнительные ткани из обеих длинных костей полностью удалены (рисунок 1, шаг 2).
  4. Чтобы добиться этого, сначала одной рукой проведите торцевую поверхность бедренной кости и острыми ножницами срежьте продольно по направлению к суставу. Удалите окружающие мышцы и жировую ткань из кости во время процесса. Будьте осторожны, чтобы ткань, окружающая непосредственную суставную капсулу, оставалась нетронутой изначально.
  5. Аналогично сделайте еще один разрез на большеберцовом конце образца и удалите мышцы и жировую ткань из большеберцовой кости. Убедитесь, что обе длинные кости полностью обнажены, а суставная капсула хорошо видна после этого шага (рисунок 1, шаг 3).
  6. Затем сделайте разрез с обеих сторон синовиальной мембраны, чтобы разрезать сочленяющийся сустав (рисунок 1, шаг 4). Отрежьте коленную чашечку как от синовиальной мембраны, так и от связок надколенника, используя свежую партию стерилизованных ножниц и щипцов. Немедленно храните отделенную надколенную чашечку в чашке Петри, содержащей PBS (рисунок 1, шаг 5).
  7. Удалите всю жировую подушку, присутствующую на внутренней поверхности надколенника, ножницами и щипцами и соберите жировую подушку в другую свежую чашку Петри (рисунок 1, шаг 6). Измельчите собранную жировую прокладку с помощью скальпеля. Включите другие хирургические инструменты (например, ножницы или хирургические лезвия) по мере необходимости для получения наименьших возможных жировых кусочков / сегментов ~ 2-3 мм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хороший фарш имеет решающее значение для получения хорошего выхода клеток. Всегда держите ткань гидратированной и не дайте ей высохнуть на любом этапе процедуры изоляции.
  8. Переложите измельченную ткань с помощью шпателя в центрифужную трубку объемом 50 мл и промыть ее PBS, дополненной антибиотиками при комнатной температуре (RT), в течение 15 минут в смесителе пробирки. Повторите шаг стирки 3x, 15 мин каждый.
  9. Для ферментативного пищеварения инкубируют измельченную ткань (~5 г) в модифицированной среде Dulbecco's Eagle's Media (DMEM с низким содержанием глюкозы), содержащей 1,5 мг/мл коллагеназы типа II (20 мл) и дополненной 2% FBS при 37 °C в течение 12-16 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте сбраживание в смесителе в пробирке со скоростью ~15 оборотов в минуту (об/мин).
  10. Осторожно аспирируйте переваренную ткань и фильтруйте ее через клеточный ситечко (70 мкм), чтобы удалить любую непереваренную ткань. Центрифугировать фильтрат в 15 мл центрифужной трубки при 150 х г в течение 5 мин. Удалите супернатант и промыть гранулу с низким содержанием глюкозы DMEM не менее 2x.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Медленно перелейте переваренную ткань в ситечко, чтобы избежать разлива. Используйте центрифужную трубку малого объема (15 мл), чтобы получить хорошую гранулу.
  11. Повторно суспендируют полученную клеточную гранулу в полной среде DMEM (DMEM с низким содержанием глюкозы, дополненной 10% FBS и антибиотиками [2,5 мкг/мл амфотерицина, 100 ЕД/мл пенициллина-стрептомицина и 25 мкг/мл ципрофлоксацина]), называемых в протоколе расширительными средами на последующих этапах.
  12. Высевают клетки на чашки Петри 150 мм и культивируют их в расширительной среде, дополненной 5 нг/мл основного фактора роста фибробластов (bFGF) и 50 мкг/мл 2-фосфо-L-аскорбиновой кислоты тринатриевой соли. Инкубируйте клетки при 37 °C в инкубаторе с 5% CO2 , чтобы позволить клеткам прилипать и размножаться. Ежедневно контролируйте прикрепление и рост клеток.

2. Поддержание и расширение изолированных клеток

  1. Меняйте среду каждые 3 дня, пока клетки не станут сливающимися. Добавляйте свежую 5 нг/мл bFGF и 50 мкг/мл 2-фосфо-L-аскорбиновой кислоты тринатриевой соли непосредственно в чашку Петри каждый раз, когда среда меняется. После того, как клетки становятся на 80%-90% сливающимися, клетки субкультурируются.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Удаление неприсоединяющихся сущностей во время каждого изменения мультимедиа. В случае, если капли масла видны после 3 дней инкубации, промыть клетки PBS 1x, а затем добавить свежие носители в чашку Петри. Продолжайте промывать PBS перед каждой заменой среды до тех пор, пока капли масла не будут полностью удалены.
  2. Субкультурирование клеток: Удалите расширительную среду из чашки Петри и вымойте клетки 1x с PBS. Добавьте в блюдо 4 мл 0,25% трипсина/ЭДТА и инкубируйте клетки при 37 °C в инкубаторе с 5%CO2 в течение 4 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Слияние (80%-90%) достигается в течение 7 дней. Равномерно распределите раствор трипсина/ЭДТА по всей поверхности чашки Петри во время трипсинизации.
  3. Вытесните клетки, постукивая по пластине сбоку и наблюдая под микроскопом, чтобы подтвердить, что все клетки отделены. Нейтрализуют трипсин после добавления равного объема (4 мл) расширительной среды.
  4. Соберите диссоциированные ячейки с помощью пипетки в свежую полипропиленовую трубку объемом 15 мл и центрифугу при 150 х г в течение 5 мин при RT. Выбросьте супернатант и повторно суспендируйте гранулу в нужном объеме расширительной среды.
  5. Подсчитывают клетки с помощью стандартного метода подсчета клеток и субкультуры в 150 мм чашках Петри при плотности посева 1 х 104 клетки/см2 для дальнейшего расширения. Для всех анализов используют сливающийся монослой клеток прохода под номером Р2-Р5.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Криоконсервация избыточных клеток.

3. Оценка клоногенной способности ИФП-МСК с помощью колониеобразующего анализа (КОЕ-Ф)

  1. Для анализа КОЕ-F засейте клетки в расширительной среде в 6-луночную тканевую культуральную пластину при плотности посева 50-100 клеток/см2. Добавьте носитель для получения окончательного объема 3 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимизируйте концентрацию клеток для анализов и лечения.
  2. Культивируйте клетки в течение 12 дней при 37 °C в инкубаторе 5% CO2 в стандартных условиях культивирования, чтобы позволить клеткам образовывать колонии. Меняйте медиафайлы каждые 3 дня. Будьте нежны при смене средств массовой информации.
  3. Через 12 дней промыть колонии 1 раз PBS и зафиксировать их с использованием 20% метанола в течение 20 мин при RT. Окрасьте колонии кристаллическим фиолетовым красителем (0,5% [мас./об.] в 20% метаноле) в течение 20 мин при RT. Подсчитайте отдельные колонии с помощью перевернутого микроскопа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Колония определяется как кластер из более чем 50 клеток.

4. Потенциал дифференциации IFP-MSC

  1. Индуцирование адипогенной дифференциации IFP-МСК
    1. Чтобы индуцировать адипогенез, засейте клетки с плотностью 25 х 103 клеток/см2 в 24-луночную тканевую культуральную пластину. Добавляют среду для получения конечного объема 500 мкл. Культивируйте клетки при 37 °C в 5% CO2 инкубаторе.
    2. Однажды после слияния замените расширительную среду 500 мкл адипогенной дифференцирующей среды. Требуется примерно 2 дня, чтобы клетки достигли слияния.
    3. Получают адипогенные дифференцирующие среды, дополняя расширительные среды (DMEM + 10% FBS + 2,5 мкг/мл амфотерицина, 100 Ед/мл пенициллина-стрептомицина и 25 мкг/мл ципрофлоксацина) 25 мМ D (+)-глюкозой, 10 мкг/мл инсулина, 1 мкМ дексаметазона и 100 мкМ индометацина.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Дифференциация сред нестабильна при 4 °C через 1 месяц; следовательно, подготавливайте средства массовой информации по мере необходимости.
    4. Рассмотрим клетки, культивируемые в расширительной среде, дополненной глюкозой 25 мМ D (+), как неиндуцированные контрольные элементы. Меняйте носитель каждые 3 дня в течение 14 дней. По истечении 14 дней промывайте клетки 1 раз PBS. Фиксируйте клетки с помощью нейтрального буферизованного формалина (NBF; 4 % формальдегида в PBS) в течение 15 мин при 4 °C.
    5. После фиксации промыть скважины 1x дистиллированной водой, а затем инкубировать ячейки с 60% изопропанолом в течение 5 мин при RT. После удаления изопропанола окрашивают липидные капли путем инкубации клеток 500 мкл рабочего раствора красителя Oil Red O в течение 5 мин на RT. Промыть скважины 1x дистиллированной водой для удаления несвязанного красителя и изображения клеток с помощью перевернутого микроскопа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте стандартный раствор Oil Red O (ORO), растворив 300 мг ORO в 100 мл 99% изопропанола. Для приготовления рабочего раствора смешайте три части запаса ORO и две части дистиллированной воды и дайте ему перемешаться на RT в течение 10 мин. Процедите смесь, используя фильтровальную бумагу 0,2 мкм. Рабочее решение готово к использованию. Исходный раствор можно приготовить и хранить на RT в течение 1 месяца в темноте, тогда как рабочий раствор должен быть свежеприготовлен перед каждым использованием/окрашиванием.
  2. Индуцирование хондрогенной дифференциации МСК ИФП
    1. Выделение козьей плазмы:
      1. Готовят 3,4% (мас./об.) натрия-цитрата в дистиллированной воде. Добавьте 5 мл приготовленного раствора цитрата натрия в центрифужную трубку объемом 50 мл.
      2. Соберите 45 мл свежеизолированной козьей крови в ту же пробирку. Немедленно наклоните трубку, чтобы тщательно смешать кровь с цитратом натрия, чтобы предотвратить свертывание и транспортировать ее в лабораторию при 4 °C.
      3. Центрифугируют собранную козью кровь при 1000 х г в течение 20 мин при 4 °C. Перенесите супернатант (плазму) в свежую трубку внутри шкафа биобезопасности. Фильтруйте плазму через фильтры 0,2 мкм, аликвоту и храните при -20 °C для дальнейшего использования.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте температуру 2-8 °C при обработке образцов. Важно свести к минимуму циклы замораживания-оттаивания плазмы.
    2. Культивируйте расширенные клетки до 80%-90% конфлюзии, диссоциируйте клетки с помощью раствора трипсина/ЭДТА и гранулируйте клетки при 150 х г в течение 5 мин в 15 мл центрифужной трубки. Повторно суспендируют гранулу в плазме козы при плотности 2 х 106 клеток на 50 мкл плазменного раствора.
    3. Добавьте каплю плазмосодержащих клеток (50 мкл) на стерилизованную 90-миллиметровую чашку Петри, а затем добавьте хлорид кальция в конечной концентрации 0,3% (мас./об.). Хорошо перемешать для получения сшитого плазменного гидрогеля.
    4. Инкубировать изготовленный гидрогель при 37 °C в течение 40 мин. После инкубации переносят гидрогели на 24-луночные тканевые культуральные пластины, содержащие хондрогенные среды.
    5. Получают хондрогенные среды, дополняя DMEM низким содержанием глюкозы 10 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинеэтансульфоновой кислотой (HEPES), 1,25 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (BSA), 1 мМ пролина, 50 мкг/мл 2-фосфо-L-аскорбиновой кислоты тринатриевой соли, 100 нМ дексаметазона, 1x инсулина, трансферрина, селенита натрия + линолеина-BSA (ITS+1), антибиотиков (2,5 мкг/мл амфотерицина, 100 Ед/мл пенициллина-стрептомицина и 25 мкг/мл ципрофлоксацина), и 10 нг/мл, преобразующий фактор роста - β1 (TGF-β1).
    6. Гидрогели, культивируемые в полной среде DMEM (DMEM с низким содержанием глюкозы с 10% FBS и антибиотиками [2,5 мкг / мл амфотерицина, 100 ЕД / мл пенициллина-стрептомицина и 25 мкг / мл ципрофлоксацина]) без TGF-β1, считаются неиндуцированными контрольными группами. Меняйте носитель каждые 3 дня в течение 14 дней.
    7. После 14 дней хондрогенной дифференцировки клеток в гидрогелях плазмы промыть гидрогели PBS 3x в течение 5 мин каждый, а затем зафиксировать образцы в NBF в течение 3 ч.
      ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Формальдегид является потенциальным канцерогеном и может вызвать раздражение носа, горла и легких при вдыхании. Выполните все процедуры, связанные с формальдегидом в вытяжке.
    8. Удалите NBF, промойте гидрогели PBS 3x в течение 5 мин каждый, а затем инкубируйте в 35% (мас./об.) сахарозы в RT на ночь, чтобы раствор полностью абсорбировался в образцы. Акклиматизируйте гидрогели в соединении с оптимальной температурой резания (OCT) в течение 3 ч. Встраивайте образцы в ОКТ-соединение с использованием силиконовых форм под жидким азотом.
    9. Нарежьте образцы толщиной 10-12 мкм на стеклянных слайдах с желатиновым покрытием с помощью криотома и храните их при -20 °C для будущего использования. Чтобы исследовать наличие или отложение внеклеточного матрикса после хондрогенной дифференцировки, окрашивают срезы красителем Alcian Blue и Safranin-O, которые связываются с сульфатированными гликозаминогликанами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для приготовления красителя Alcian Blue растворите 1 г красителя Alcian Blue в 100 мл 0,1 N HCl и тщательно перемешайте в смесителе в пробирке на ночь. Раствор можно хранить при РТ в течение 1 месяца в темноте. Для приготовления красителя Сафранин-О растворите 0,1 г красителя Сафранин-О в 100 мл дистиллированной воды и тщательно перемешайте в смесителе в пробирке на ночь.
    10. Для окрашивания Alcian Blue промыть секции гидрогеля 1x дистиллированной водой в течение 5 мин. Чтобы исправить участки, добавьте 4% NBF к слайдам и высиживайте в течение 30 минут.
    11. Промыть секции 1x дистиллированной водой в течение 5 мин, а затем 2x с 0,1 N HCl в течение 30 с каждая. Снимите HCl и аккуратно высушите слайды папиросной бумагой. Добавить приготовленное пятно Alcian Blue в секции и инкубировать в течение 30 мин при 37 °C в увлажненной камере.
    12. Промыть несвязанный краситель 0,1 N HCl, а затем дистиллированной водой в течение 3 мин. Обезвоживание срезов в абсолютном этаноле, очистка их в ксилоле и, наконец, установка окрашенных участков в смолистую среду для визуализации.
    13. Для окрашивания Сафранин-О промыть секции гидрогеля дистиллированной водой 1x в течение 5 мин. Чтобы исправить участки, добавьте 4% NBF к слайдам и высиживайте в течение 30 минут. Промыть секции 1x дистиллированной водой в течение 5 мин, а затем окунуть горки в 1% уксусной кислоты на 10-15 с. Аккуратно высушите горки папиросной бумагой.
    14. Добавьте приготовленный краситель Сафранин-О к секциям и инкубируйте в течение 10 мин на RT. Несвязанный краситель промыть 100% этанолом. Окуните слайды в 100% этанол на 5 мин. Высушите горки на воздухе, очистите их в ксилоле и, наконец, установите окрашенные участки в смолистую среду для визуализации.
  3. Индуцирование остеогенной дифференциации МСК ИФП
    1. Чтобы индуцировать остеогенную дифференцировку, трипсинизируют клетки, как указано ранее (Шаг 2.2.). Засейте клетки плотностью 3 х 103 клетки/см2 в 24-луночную тканевую культуральную пластину. Добавляют среду для получения конечного объема 500 мкл. Культивируйте клетки при 37 °C в 5% CO2 инкубаторе. Через 1 день после посева заменить расширительную среду 500 мкл остеогенной дифференцировки.
    2. Готовят остеогенные среды, дополняя расширительные среды (DMEM + 10% FBS + 2,5 мкг/мл амфотерицина, 100 Ед/мл пенициллина-стрептомицина и 25 мкг/мл ципрофлоксацина) 25 мМ D (+)-глюкозой, 10 нМ дексаметазона, 10 мМ β-глицерофосфата, 50 мкг/мл 2-фосфо-L-аскорбиновой кислоты тринатриевой соли и 10 нМ витамина D3.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки, культивируемые в расширительных средах, дополненных глюкозой 25 мМ D (+), считаются неиндукционными контрольными элементами.
    3. Меняют остеогенные среды каждые 3 дня в течение 14 дней или 28 дней. По истечении 14 дней измеряют степень остеогенеза путем окрашивания щелочной фосфатазой (ALP).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы подготовить субстрат для окрашивания ALP, растворите одну таблетку 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфата (BCIP)/nitroblue Tetrazolium (NBT) в 10 мл дистиллированной воды в 15 мл центрифужной трубки. Дайте таблетке полностью раствориться. Раствор подложки готов к использованию. Поскольку раствор субстрата нельзя хранить дольше, исходя из необходимости, разбейте таблетку пополам и растворите ее в 5 мл дистиллированной воды. Чтобы подготовить буфер пермеабилизации, добавьте буфер Tris (100 мМ) и хлорид магния (5 мМ) в дистиллированную воду. Добавьте в раствор Triton X100 (0,1%) и дайте ему раствориться. Отрегулируйте рН раствора до 9,25-9,75.
    4. Для окрашивания ALP, после 14 дней индукции, удалите среду и промывайте клетки PBS. Фиксируйте клетки с помощью NBF (4%) в течение 1 мин. Промыть клетки PBS и пермеат с помощью подготовленного лизисного буфера в течение 2-3 мин.
    5. Добавьте 500 мкл приготовленного раствора субстрата к клеткам и дайте ему инкубироваться в течение 15 мин до 1 ч, в зависимости от уровня экспрессии. Проверьте развитие фиолетового/синего цвета между ними.
    6. Вынуть раствор субстрата и промыть дистиллированной водой. Визуализируйте окрашенные клетки с помощью перевернутого микроскопа.
    7. По истечении 28 дней измеряют степень кальцификации после остеогенной индукции окрашиванием Alizarin Red-S.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для приготовления окрашивающего раствора Alizarin Red-S (40 мМ) растворите 2 г Alizarin Red-S в 100 мл дистиллированной воды и отрегулируйте рН до 4,1-4,3 с HCl или NH4OH. Процедить раствор через мембрану 0,22 мкм и хранить при 4 °C в темноте. Важен рН раствора; поэтому рекомендуется либо сделать свежий раствор, либо повторно измерить рН раствора, если ему более 1 месяца.
    8. Для окрашивания Alizarin Red-S, после 28 дней индукции, удаляют среду и промывают клетки 1x холодным PBS. Зафиксируйте клетки, используя 70% этанол в течение 1 ч при 4 °C.
    9. Снимите фиксатор и промыть клетки 2x дистиллированной водой. Полностью удалите воду и добавьте в каждую лунку по 1 мл раствора Ализарина Ред-С.
    10. Инкубируют клетки раствором в течение 1 ч на RT и визуализируют клетки с помощью перевернутого микроскопа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Выделение ИФП-МСК из бедренно-сустава козы
Этапы, связанные с изоляцией IFP-MSC от удушающего сустава козы, изображены на рисунке 1. Жировая подушка, присутствующая во внутренней нешарниринговой поверхности надколенника, удалялась, измельчалась и ферментативно переваривалась. IFP-MSC были успешно выделены и культивированы in vitro (рисунок 2A).

Расширение и клоногенная способность IFP-МСК<...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В настоящем протоколе предусмотрен простой, надежный и воспроизводимый метод выделения МСК из козьей ИФП. Клетки, выделенные с помощью этого метода, были успешно использованы в наших предыдущих исследованиях для регенерации тканей in vitro. Было отмечено, что изолированные клетки были пролиферативными, реагировали на различные факторы роста и сохраняли свою биологическую активность при посеве на электрораскупленные волокна и каркасы25,26. Кроме того, был...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SH признает поддержку со стороны Института постдокторской стипендии IIT Kanpur и гранта SYST от DST (SEED Division) (SP/YO/618/2018). AM выражает признательность Индийскому технологическому институту Канпура (IIT-Kanpur) за стипендию Института. DSK признает Гириша Джанкината профессором кафедры и кафедры биотехнологии, Индия, для финансирования (BT/PR22445/MED/32/571/2016). AM, SH и DSK благодарят Семейный центр инженерии в медицине Мехта в IIT-Kanpur за их щедрую поддержку.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
&бета;-глицерофосфатSigma-AldrichG9422-10G10 мМ
0,25% трипсин-0,02% ЭДТАHi-MediaTCL049
15-мл центрифужная пробиркаCorning
2-фосфо-L-аскорбиновая кислота тринатриевая сольSigma49752-10G50 &микро; г/мл
2-пропанолСигма-ОлдричI9516
4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота (HEPES)HiMediaTCL021-50ml10 мМ
50-мл центрифужная пробиркаCorning
Alcian BlueHi-MediaRM471Для суфированных гикозаминогликанов окрашивание
Alizarin Red SS D Fine-Chem Limited26048-25GДля осаждения кальция
амфотерицин BHiMediaA0112.5 &; г/мл
Основной фактор роста фибробластов (bFGF)Sino Biologicals10014-HNAE5 нг/мл bcip
/nbt Субстрат АЛФSigmaB5655-5TABДля окрашивания ЩФ
Шкаф
BSAHiMediaMB-083Длинное название: Бычья сыворотка Альбумин (1,25 мг/мл )
Клеточный фильтрHiMediaTCP-18270 &микро; m
ЦентрифугаREMI
ЦипрофлоксацинRANBAXY LAB. ОграниченныйB17407T12.5 & микро; г/мл
кристалл VioletS D Fine-Chem Limited42555
D(+)-глюкозаMerck1.94925.052125 мМ
ДексаметазонSigma-AldrichD29151 &m; M
DMEM LGSIGMAD5523Длинное название: Dulbecco' s Модифицированный Eagle' s Media Этанол с низким содержанием глюкозы
Merck 100983
FBSGibco10270Длинное название: Фетальная бычья сыворотка
Раствор формальдегида 37%-41%Merck61780805001730
ИндометацинSigma-AldrichI7378100 &микро; М
инсулинСигма-ОлдричI9278 10& микро; г/мл
Инвертированный микроскопNikon Eclipse TS 100
ITS + 1Sigma-AldrichI2521-5mLДлинное название: инсулин, трансферрин, селенит натрия + линолевая-BSA
L-ProlineHiMediaTO-109-25G1 мМ
Магния хлоридMerck61751605001730Для лизиса буфера
MethanolMeck1.07018.2521
Микропипетки и стерильные наконечники (20 & микро; L, 200 & микро; L, 1000 & микро; L)Термонаучный
анализатор клеток MUSEMerck MilliporeДля подсчета клеток
ОКТ-соединениеTissue-Tek4583Длинное название: Оптимальная температура резки
Масло Red O dyeS D Fine-Chem Limited54304Для окрашивания липидной вакуолью
Пенициллин-стрептомицинHiMediaA007100 Ед/мл
Петри посуда (150 мм и 90 мм)NEST
Safranin OS D Fine-Chem Limited50240Для окрашивания суфированных гикозаминогликанов
Цитрат натрияSigma-AldrichC34343,4 % (по объему)
Стерильные ножницы, щипцы и скальпелиДля выделения IFP-MSC
СахарозаMerck1.94953.052135 % (по объему)
TGF- &бета; 1Sino BiologicalsПолное название: Трансформирующий фактор роста- &бета; 1 (10 нг/мл)
Инкубатор для культуры тканей 37 ° C, 5% CO2Thermoscientific
Tris bufferMerck61771405001730Для лизисного буфера
Triton X100S D Fine-Chem Limited40632Для лизисного буфера
Тип II коллагеназаGibco171010151,5 мг/мл
Витамин D3SigmaC9756-1G10 нМ
Луночные планшеты (6 -WP и 24-WP)гнездо
биологической безопасности

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Han, Y., et al. Mesenchymal stem cells for regenerative medicine. Cells. 8 (8), (2019).
  2. Pittenger, M. F., et al. Mesenchymal stem cell perspective: cell biology to clinical progress. NPJ Regenerative Medicine. 4 (1), 22(2019).
  3. Guo, Y., Yu, Y., Hu, S., Chen, Y., Shen, Z. The therapeutic potential of mesenchymal stem cells for cardiovascular diseases. Cell Death & Disease. 11 (5), 349(2020).
  4. Ge, Z., Goh, J. C. H., Lee, E. H. Selection of cell source for ligament tissue engineering. Cell Transplantation. 14 (8), 573-583 (2005).
  5. Harvanová, D., Tóthová, T., Sarissky, M., Amrichová, J., Rosocha, J. Isolation and characterization of synovial mesenchymal stem cells. Folia Biologica. 57 (3), 119-124 (2011).
  6. Kouroupis, D., et al. Infrapatellar fat pad-derived MSC response to inflammation and fibrosis induces an immunomodulatory phenotype involving CD10-mediated Substance P degradation. Scientific Reports. 9 (1), 10864(2019).
  7. Lopa, S., et al. Donor-matched mesenchymal stem cells from knee infrapatellar and subcutaneous adipose tissue of osteoarthritic donors display differential chondrogenic and osteogenic commitment. European Cells & Materials. 27, 298-311 (2014).
  8. Garcia, J., et al. Characterisation of synovial fluid and infrapatellar fat pad derived mesenchymal stromal cells: The influence of tissue source and inflammatory stimulus. Scientific Reports. 6 (1), 24295(2016).
  9. Tangchitphisut, P., et al. Infrapatellar fat pad: an alternative source of adipose-derived mesenchymal stem cells. Arthritis. 2016, 4019873(2016).
  10. Ding, D. -C., et al. Human infrapatellar fat pad-derived stromal cells have more potent differentiation capacity than other mesenchymal cells and can be enhanced by hyaluronan. Cell Transplantation. 24 (7), 1221-1232 (2015).
  11. Khan, W., Adesida, A., Tew, S., Andrew, J., Hardingham, T. The epitope characterisation and the osteogenic differentiation potential of human fat pad-derived stem cells is maintained with ageing in later life. Injury. 40 (2), 150-157 (2009).
  12. Koh, Y. G., et al. Mesenchymal stem cell injections improve symptoms of knee osteoarthritis. Arthroscopy. 29 (4), 748-755 (2013).
  13. Koh, Y. G., Choi, Y. J. Infrapatellar fat pad-derived mesenchymal stem cell therapy for knee osteoarthritis. Knee. 19 (6), 902-907 (2012).
  14. Kouroupis, D., Willman, M. A., Best, T. M., Kaplan, L. D., Correa, D. Infrapatellar fat pad-derived mesenchymal stem cell-based spheroids enhance their therapeutic efficacy to reverse synovitis and fat pad fibrosis. Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 44(2021).
  15. Stocco, E., et al. Infrapatellar fat pad stem cells responsiveness to microenvironment in osteoarthritis: from morphology to function. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 323(2019).
  16. Hindle, P., Khan, N., Biant, L., Péault, B. The infrapatellar fat pad as a source of perivascular stem cells with increased chondrogenic potential for regenerative medicine. Stem Cells Translational Medicine. 6 (1), 77-87 (2017).
  17. Stolzing, A., Jones, E., McGonagle, D., Scutt, A. Age-related changes in human bone marrow-derived mesenchymal stem cells: consequences for cell therapies. Mechanisms of Ageing and Development. 129 (3), 163-173 (2008).
  18. Wu, C. L., Diekman, B. O., Jain, D., Guilak, F. Diet-induced obesity alters the differentiation potential of stem cells isolated from bone marrow, adipose tissue and infrapatellar fat pad: the effects of free fatty acids. International Journal of Obesity (2005). 37 (8), 1079-1087 (2013).
  19. Barboza, E., et al. Profibrotic infrapatellar fat pad remodeling without M1 macrophage polarization precedes knee osteoarthritis in mice with diet-induced obesity. Arthritis & Rheumatology. 69 (6), 1221-1232 (2017).
  20. Allen, M. J., Hankenson, K. D., Goodrich, L., Boivin, G. P., von Rechenberg, B. Ethical use of animal models in musculoskeletal research. Journal of Orthopaedic Research. 35 (4), 740-751 (2017).
  21. Moran, C. J., et al. The benefits and limitations of animal models for translational research in cartilage repair. Journal of Experimental Orthopaedics. 3 (1), (2016).
  22. Kuyinu, E. L., Narayanan, G., Nair, L. S., Laurencin, C. T. Animal models of osteoarthritis: classification, update, and measurement of outcomes. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 11 (1), 19(2016).
  23. Chu, C. R., Szczodry, M., Bruno, S. Animal models for cartilage regeneration and repair. Tissue Engineering Part B: Reviews. 16 (1), 105-115 (2010).
  24. Proffen, B. L., McElfresh, M., Fleming, B. C., Murray, M. M. A comparative anatomical study of the human knee and six animal species. The Knee. 19 (4), 493-499 (2012).
  25. Bhutada, S. S., Sriram, M., Katti, D. S. Sulfated carboxymethylcellulose conjugated electrospun fibers as a growth factor presenting system for tissue engineering. Carbohydrate Polymers. 268, 118256(2021).
  26. Waghmare, N. A., Arora, A., Bhattacharjee, A., Katti, D. S. Sulfated polysaccharide mediated TGF-β1 presentation in pre-formed injectable scaffolds for cartilage tissue engineering. Carbohydrate Polymers. 193, 62-72 (2018).
  27. Arora, A., Mahajan, A., Katti, D. S. TGF-β1 presenting enzymatically cross-linked injectable hydrogels for improved chondrogenesis. Colloids & Surfaces B: Biointerfaces. 159, 838-848 (2017).
  28. Arora, A., Sriram, M., Kothari, A., Katti, D. S. Co-culture of infrapatellar fat pad-derived mesenchymal stromal cells and articular chondrocytes in plasma clot for cartilage tissue engineering. Cytotherapy. 19 (7), 881-894 (2017).
  29. Mahajan, A., Singh, A., Datta, D., Katti, D. S. Bioinspired injectable hydrogels dynamically stiffen and contract to promote mechanosensing-mediated chondrogenic commitment of stem cells. ACS Applied Materials & Interfaces. 14 (6), 7531-7550 (2022).
  30. Nakano, T., Wang, Y. W., Ozimek, L., Sim, J. S. Chemical composition of the infrapatellar fat pad of swine. Journal of Anatomy. 204 (4), 301-306 (2004).
  31. Sun, Y., Chen, S., Pei, M. Comparative advantages of infrapatellar fat pad: an emerging stem cell source for regenerative medicine. Rheumatology. 57 (12), 2072-2086 (2018).
  32. Han, W., et al. Infrapatellar fat pad in the knee: is local fat good or bad for knee osteoarthritis. Arthritis Research & Therapy. 16 (4), 1-8 (2014).
  33. Bae, S. H., et al. L-ascorbic acid 2-phosphate and fibroblast growth factor-2 treatment maintains differentiation potential in bone marrow-derived mesenchymal stem cells through expression of hepatocyte growth factor. Growth Factors. 33 (2), 71-78 (2015).
  34. Priya, N., Sarcar, S., Majumdar, A. S., SundarRaj, S. Explant culture: a simple, reproducible, efficient and economic technique for isolation of mesenchymal stromal cells from human adipose tissue and lipoaspirate. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 8 (9), 706-716 (2014).
  35. Tsuji, K., et al. Effects of different cell-detaching methods on the viability and cell surface antigen expression of synovial mesenchymal stem cells. Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).
  36. Jing, W., et al. Explant culture: an efficient method to isolate adipose-derived stromal cells for tissue engineering. Artificial Organs. 35 (2), 105-112 (2011).
  37. Sherman, L. S., Condé-Green, A., Naaldijk, Y., Lee, E. S., Rameshwar, P. An enzyme-free method for isolation and expansion of human adipose-derived mesenchymal stem cells. Journal of Visualized Experiments. (154), e59419(2019).
  38. Muttigi, M. S., et al. Matrilin-3 codelivery with adipose-derived mesenchymal stem cells promotes articular cartilage regeneration in a rat osteochondral defect model. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (3), 667-675 (2018).
  39. Toghraie, F., et al. Treatment of osteoarthritis with infrapatellar fat pad derived mesenchymal stem cells in Rabbit. The Knee. 18 (2), 71-75 (2011).
  40. Chen, H. -H., et al. Infrapatellar fat pad-derived mesenchymal stromal cell product for treatment of knee osteoarthritis: a first-in-human study with evaluation of the potency marker. Cytotherapy. 24 (1), 72-85 (2022).
  41. Kouroupis, D., Bowles, A. C., Best, T. M., Kaplan, L. D., Correa, D. CD10/Neprilysin enrichment in infrapatellar fat pad-derived mesenchymal stem cells under regulatory-compliant conditions: implications for efficient synovitis and fat pad fibrosis reversal. The American Journal of Sports Medicine. 48 (8), 2013(2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи