Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Формулировка и характеристика экзосомно-носительской системы дофамина

3.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/63624

⸱

4 апреля 2022 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 

В этой статье

Краткое содержание

В данной работе мы стремились получить рецептуру путем дофаминовой загрузки изолированных экзосом стволовых клеток из желейных мезенхимальных стволовых клеток Уортона. Выделение и характеристика экзосом, загрузка препарата в полученные экзосомы и цитотоксическая активность разработанной лекарственной формы описаны в данном протоколе.

Аннотация

Экзосомы размером от 40 до 200 нм составляют наименьшую подгруппу внеклеточных везикул. Эти биологически активные везикулы, секретируемые клетками, играют активную роль в межклеточном грузе и коммуникации. Экзосомы в основном содержатся в жидкостях организма, таких как плазма, спинномозговая жидкость, моча, слюна, околоплодные воды, молозиво, грудное молоко, суставная жидкость, сперма и плевральная кислота. Учитывая размер экзосом, считается, что они могут играть важную роль в заболеваниях центральной нервной системы, поскольку они могут проходить через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ). Таким образом, это исследование было направлено на разработку системы наноносителей на основе экзосом путем инкапсуляции дофамина в экзосомы, выделенные из желейных мезенхимальных стволовых клеток Уортона (WJ-MSCs). Экзосомы, прошедшие процесс характеризации, инкубировали с дофамином. Экзосомы, нагруженные дофамином, были повторно охарактеризованы в конце инкубации. Экзосомы, нагруженные дофамином, были исследованы в анализах на высвобождение лекарств и цитотоксичность. Результаты показали, что дофамин может быть успешно инкапсулирован в экзосомах, и что экзосомы, загруженные дофамином, не влияют на жизнеспособность фибробластов.

Введение

Экзосомы, биологически активные везикулы со значительными особенностями, имеют размер от 40 нм до 200 нм. Экзосомы происходят из клеточной мембраны и образуются в результате высвобождения эндосом1. Эти структуры служат межклеточными коммуникаторами и взаимодействуют с соседними клетками, облегчая передачу активных молекул. Экзосомы могут быть выделены из множества различных источников. К ним относятся биологические жидкости, такие как плазма, моча, спинномозговая жидкость, слюна, а также клеточные линии, культивируемые в условиях in vitro . Экзосомы играют важную роль в устранении повреждений нервов благодаря содержащимся в них биомакр....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: См. Таблицу материалов для получения подробной информации, относящейся ко всем материалам и оборудованию, используемым в этом протоколе.

1. Культивирование и криоконсервация желейных мезенхимальных стволовых клеток Уортона

  1. Извлеките WJ-MSC (из ATCC) из морозильной камеры с температурой -80 °C. Высевают клетки в колбу, содержащую среду DMEM-F12 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS). Инкубируют их при температуре 37 °C в инкубаторе, содержащем 5%СО2.
  2. Меняйте питательную среду каждые 2 дня. Проходите клетки, когда они достигнут 80% слияния. Промойте клетк....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Выделение и характеристика экзосом
Стволовые клетки Уортонского желе культивируют и инкубируют в безсывороточной среде в течение 48 ч, когда культура достигает достаточной плотности. После окончания инкубации надосадочную жидкость хранят при температуре -20 °С. Собранные надосадочные жидкости разбавляют ПБС и подвергают ультрацентрифугированию (рисунок 1). Полученное решение анализируется с помощью NTA и DLS анализов. Экзосомы стерилизуют, пропуская через фильтр 0,22 мкм.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Экзосомы представляют собой небольшие мембранные везикулы размером 40-200 нм, секретируемые большинством типов клеток, например, МСК1. Способные обеспечивать коммуникацию между клетками, экзосомы могут проникать в клетки различными путями, такими как эндоцитоз, фагоцитоз, микропиноцитоз, липидно-опосредованная интернализация и слияние33,44. По сравнению с другими системами наноносителей, липиды и холестерин, обнаруженные на поверхности экз.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Работа была в основном поддержана финансированием исследований, предоставленным Научно-исследовательскими проектами Технического университета Йылдыз (TSA-2021-4713).

....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,22 & микро; м мембранный фильтрAisimoИспользуется для процесса стерилизации
0,45 мкм; m шприцевой фильтрAisimoИспользуется для процесса стерилизации
15 мл Falcon tubeNestИспользуется на стадии культивирования клеток
25 см2 колбы для клеточных культур (Falcon, TPP tissue culture flasksNestИспользуется на стадии культивирования клеток
50 мл Falcon tubeNestИспользуется на стадии
культивирования клеток75 см<суп>2 колбы для клеточных культур (Falcon, колбы для культуры тканей TPPГнездоИспользуется на стадии культивирования клеток
96 луночных планшетов (микропланшеты Falcon, TPP)Merck MilliporeИспользуется на стадии культивирования клеток
АцетонитрилСигма271004-1LИспользуется для анализа ВЭЖХ
АвтоклавNUVE-OT 90LИспользуется для процесса стерилизации
Клетка Кабина для культивирования культурHera Safe KSИспользуется для процесса культивирования клеток
ЦентробежнаяHitachiCF16RNИспользуется на этапе выделения экзосом
CO2 инкубаторе с Safe Cell UVPanasonicИспользуется для процесса культивирования
клеток Дофамина гидрохлорид H8502-10GSigmaH8502-10GИспользуется при загрузке
экзосомами дофаминомМодифицированная смесь питательных веществ Eagle's Medium-F12SigmaRNBJ7249Используется в качестве среды для культивирования
клеток Фетальная бычья сыворотка-FBSCapricornFBS-16AИспользуется путем добавления в среду для клеточной культуры.
Морозильная камера -80° CPanasonicMDF-U5386S-PEДля хранения клеток и полученных экзосом
ХолодильникPanasonicMPR-215-PEИспользуется для хранения клеточных культур и других материалов
Высокоэффективная жидкостная хроматография-ВЭЖХAgilent TechnologiesИсследовано наличие дофамина из содержимого полученной рецептуры.
Микроскоп - PrimovertZeissИспользуется для наблюдения за клетками в клеточной культуре.
Анализ МТТBiomatikИспользуется для измерения жизнеспособности клеток
NanoSight NS300Malvern panalyticalMalvern panalyticalИспользуется для определения характеристик экзосом
Optima XPN-100 УльтрацентрифугаBeckman CoulterИспользуется на этапе выделения экзосом:
таблетка PBSBiomatik43602При приготовлении раствора PBS
Penicilin/ Раствор стрептомицинаCapricornPB-SЕго добавляли в среду для предотвращения контаминации в культуре клеток.
ПипеткаAssist Isolab
Precision balance-KernKern-ABJ220-4NMИспользовалась при приготовлении растворов
Q500 SonicatorQsonica, LLCИспользовалась для расщепления экзосом в анализе ВЭЖХ
SaponinSigma47036-50G-FИспользовалась путем добавления его в общий раствор в процессе загрузки экзосомами дофамина.
Спектростар-Нано-СпектрофотометрияBMG LABTECHИспользуется для анализа МТТ и выпуска лекарств
Статистическая пакетная программаSPSS 22
Vorteks-FinePCRFinePCR-FineVortexИспользуется для однородного смешивания растворов
Водяная баня 37 ° C-SenovaSenovaИспользуется в клеточной культуре step
Wharton' s желейные мезенхимальные стволовые клеткиATCC
ZetaSizerMalvern Nano ZSMalvern Nano ZSИспользуется для характеристики экзосом
SPSS 22

Ссылки

  1. Ingato, D., Lee, J. U., Sim, S. L., Kwon, Y. L. Good things come in small packages: Overcoming challenges to harness extracellular vesicles for therapeutic delivery. Journal of Controlled Release. 241, 174-185 (2016).
  2. Riazifar, M., et al.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Система доставки на основе экзосоминкапсуляция дофаминавнеклеточные везикулыгематоэнцефалический барьерэкзосомы из желе вартаонаанализ траектории наночастицсерийное центрифугированиеанализ высвобождения лекарственного веществаанализ цитотоксичностиМТТ-тест