Здесь мы описываем протокол получения экстракта сырого яда из морского анемона и выявления его гемолитической и фосфолипазной активности.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Идентификация гемолитической и фосфолипазной активности в сырых экстрактах из морских анемонов с помощью простых биоанализов
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Состав яда морского анемона включает полипептидные и небелковые молекулы. Цитолитические компоненты обладают высоким биотехнологическим и биомедицинским потенциалом для разработки новых молекулярных инструментов. Яд морского анемона находится в железистых клетках эктодермы и субклеточных структур, называемых нематоцистами, оба из которых распределены по всему телу морского анемона. Эта характеристика подразумевает проблемы, потому что клетки и нематоцисты должны быть лизированы для высвобождения компонентов яда с другими нетоксичными молекулами. Поэтому сначала яд получают из сырого экстракта (смесь различных и разнообразных молекул и тканевого мусора). Следующим шагом является обнаружение полипептидов со специфической биологической активностью. Здесь мы описываем эффективную стратегию получения сырого экстракта морского анемона и биоанализа для выявления присутствия цитолизинов. Первый шаг включает в себя недорогие и простые методы (цикл перемешивания и замораживания-оттаивания) для высвобождения цитолизинов. Мы получили самую высокую цитолитическую активность и белок (~500 мг белка из 20 г сухого веса). Далее полипептидную сложность экстракта анализировали с помощью геля SDS-PAGE, детектирующего белки с молекулярной массой от 10 кДа до 250 кДа. В гемолитическом анализе мы использовали эритроциты овец и определяли HU50 (11,1 ± 0,3 мкг/мл). Напротив, наличие фосфолипаз в сыром экстракте определяли с помощью яичного желтка в качестве субстрата в твердой среде с агарозой. В целом, это исследование использует эффективный и недорогой протокол для приготовления сырого экстракта и применяет воспроизводимые биоанализы для идентификации цитолизинов, молекул с биотехнологическими и биомедицинскими интересами.
Введение
Морские животные являются богатым источником биологически активных соединений. В последние десятилетия состав яда морского анемона привлек научное внимание, поскольку он включает в себя разнообразие полипептидов с гемолитической, цитотоксической, ферментативной (фосфолипаза, протеаза, хитиназа) и нейротоксической активностью и ингибирующим действием на протеолитическую активность1. Кроме того, эти полипептиды являются потенциальными источниками для разработки молекулярных инструментов в биотехнологическом и терапевтическом использовании 2,3.
Существует мало с....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Морские анемоны были собраны в соответствии с руководящими принципами Национальной комиссии по аквакультуре, рыболовству и продовольствию федерального правительства Мексики (номер разрешения PPF / DGOPTA 07332.250810.4060). Комитет по биоэтике Института биотехнологии Национального автономного университета Мексики одобрил все эксперименты с морскими анемонами. Образец овечьей крови был приобретен в Центре практического обучения и исследований в области животноводства и здоровья (CEPIPSA, Национальный автономный университет Мексики).
1. Сбор организмов
- Собирают морского анемона A. dowii.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здес....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Репрезентативные результаты протокола, использованные для получения сырого экстракта морского анемона, показали, что сочетание двух методов (перемешивание и циклы замораживания и оттаивания) приводило к эффективному разгрузке нематоцист, а общее количество белка составляло 500 мг (8 мг/мл) (рисунок 3).
Сложность белка сырого экстракта можно наблюдать от 10 кДа и более 250 кДа с помощью электрофореза SDS-PAGE. Кроме того, цитолизины были обнаружены в молекулярно-ма.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Высокий спрос на новые соединения с применением в различных областях науки и промышленности привел к изучению яда. Яд представляет собой богатый источник молекул, который служит шаблоном для генерации новых молекулярных инструментов. Однако сложность этих ядов требует реализации и сочетания различных методов их получения и изучения.
Здесь мы показываем метод получения и анализа яда морского анемона Anthopleura dowii, Verrill 1869, который может быть использован для исследования яда др.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующего интереса в отношении публикации данной статьи.
Благодарности
Эта работа была поддержана Программой апойо проекта исследований и инноваций в области технологий (PAPIIT) с номером гранта IT200819. Авторы выражают признательность Тому Масселману, Rock Paper Editing, LLC, за проверку английской грамматики этой рукописи; и техническая помощь Саманты Хименес (СИСЕСЕ, Энсенада) и Хуана Мануэля Барбосы Кастильо (Институт физики Селулара, УНАМ). Мы также благодарим д-ра Аугусто Сезара Лизаразо Чапарро (CEPIPSA) за получение овечьей крови. Мы особенно благодарим д-ра Хосе Санигера Блесу, ICAT-UNAM, за оборудование в его лаборатории для видеозаписи.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 15 мл коническая центрифужная пробирка | Corning | 430766 | |
| 2-бромофенол синий | Sigma | B75808 | |
| 2-меркаптоэтанол | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | |
| 50 мл конические центрифужные пробирки | Corning | 430828 | |
| уксусной кислотой ледяной | J.T. Baker | 9515-03 | |
| Акриламид | Promega | V3115 | |
| Agarose | Promega | V3125 | |
| Бисаакриламид | Promega | V3143 | |
| Фракция альбумина в сыворотке крупного рогатого скота V | Sigma | A3059-100G | |
| Bradford Protein Анализы | Bio-Rad | 5000006 | |
| хлорида кальция | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Клеточные культуральные планшеты 96 лунок, V-образное дно | Corning | 3894 | |
| Центрифуга | Eppendorf | 5804R | |
| Центрифуга пробирки | Corning | CLS430829 | |
| система ChemiDoc MP | Bio-Rad | 1708280 | |
| Лимонная кислота | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| Clear flat.bottom, 96-луночные планшеты | Thermo Scientific | 3855 | |
| Coomassie Brilliant Blue G-250 | Bio-Rad | #1610406 | |
| Coomassie brilliant blue R-250 | Bio-Rad | 1610400 | |
| Dextrose | J.T. Baker | 1916-01 | |
| Корпус без воздуховодов | Labconco | Vertical | https://imagej.nih.gov/ij ImageJ 1.53c |
| Gel Doc EZ | Bio Rad. | Система документирования геля | |
| Глицерин | Sigma-Aldrich | G5516-4L | |
| Гемоцитометр | Marienfeld | 650030 | |
| ImageJ (программное обеспечение) | NIH, США | Версия 1.53c | |
| Инкубатор 211 | Labnet | I5211 DS | |
| метанол | J.T. Baker | 9049-03 | |
| Мини-ПРОТЕЙ тетраклетка | Bio-Rad | 1658000EDU | |
| Na2HPO4 | J.T. Baker | 3824-01 | |
| NaCl | J.T. Baker | 3624-01 | |
| 2PO4. H2O | J.T. Baker | 3818-05 | |
| Origin версия программного обеспечения | 9 | Для проектирования участка с сигмоидальными корректировками | |
| Петридиш | Сокол 351007 | ||
| Набор Пипетмана | Gilson | F167380 | |
| Сборный мини-гель | BioRad | 1658004 | |
| Предварительно окрашенный протеиновый лестница | Thermo Scientific | 26620 | |
| Коктейль ингибиторов протеазы | Roche | 11836153001 | |
| белковый анализ Концентрат красителя | Био-рад | 5000006 | |
| Родамин 6G | Sigma-Aldrich | 252433 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| Дигидрат цитрата натрия | JT Baker | 3646-01 | |
| Спектрофотометр | THERMO SCIENTIFIC | G10S UV-VIS | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | 77-86-1 | |
| Вольт Источник питания | Hoefer | PS300B |
Ссылки
- Frazão, B., Vasconcelos, V., Antunes, A. Sea anemone (Cnidaria, Anthozoa, Actiniaria) toxins: an overview. Marine Drugs. 10 (8), 1812-1851 (2012).
- Jayathilake, J. M. N. J., Gunathilake, K. V. K. Cnidarian toxins: recent evidences for potential therapeutic u....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
