Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Оценка окисления жирных кислот в культивируемых костных клетках

797 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/63638

⸱

28 апреля 2022 г.

 ,  , 
1Department of Orthopaedic Surgery, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Research and Development Service, Baltimore Veterans Administration Medical Center

В этой статье

Краткое содержание

В настоящем протоколе описан анализ для оценки способности к окислению жирных кислот в культурах первичных костных клеток или соответствующих клеточных линий.

Аннотация

Ожидается, что формирование костной ткани путем дифференцировки остеобластов потребует значительных энергетических затрат, поскольку эти специализированные клетки должны синтезировать большие белки внеклеточного матрикса, составляющие костную ткань, а затем концентрировать ионы, необходимые для ее минерализации. Данные о метаболических потребностях в формировании костей появляются быстро. Хотя многое еще предстоит узнать, ожидается, что нарушения в промежуточном метаболизме способствуют заболеванию скелета. Здесь изложен протокол для оценки способности остеобластических клеток окислять 14С-меченых жирных кислот до 14СО2 и кислоторастворимых метаболитов. Жирные кислоты представляют собой богатый энергетический резерв, который может быть взят из кровообращения после кормления или после их высвобождения из запасов жировой ткани. Анализ, проводимый в колбах с культурами тканей Т-25, полезен для изучения прироста или потери функции генов на утилизацию жирных кислот и влияние анаболических сигналов в виде факторов роста или морфогенов, необходимых для поддержания костной массы. Также приводится подробная информация о возможности адаптации протокола для оценки окисления глюкозы или аминокислот, таких как глютамин.

Введение

Остеобласт, полученный из клеток-предшественников, присутствующих в костном мозге и надкостнице, отвечает за синтез и секрецию минерализованного, богатого коллагеном матрикса, из которого состоит костная ткань. Чтобы выполнить эту энергетически дорогостоящую задачу и внести свой вклад в пожизненное поддержание целостности скелета, эти специализированные клетки поддерживают обильный шероховатый эндоплазматический ретикулум, необходимый для синтеза белков внеклеточного матрикса 1,2 и многочисленные митохондрии с высоким мембранным потенциалом для сбора необходимой химической энергии из топливных субстратов 3,4. Важность этой последней функции иллюстрируется прекращением роста костей и развитием остеопении5,6, связанной с дефицитом энергии, как при ограничении калорий. Идентификация предпочтительного источника топлива для остеобласта и данные о метаболических потребностях остеобласта во время дифференцировки или в ответ на анаболическую сигнализацию появляются 7,8.

Длинноцепочечные жирные кислоты представляют собой богатый запас химической энергии, присутствующей в сыворотке крови и высвобождаемой из жировой ткани в ответ на снижение потребления калорий или повышенный расход энергии. После прохождения через клеточную мембрану и лигирования к коэнзиму А для повышения растворимости, жирные ацил-КоА транспортируются в митохондриальный матрикс двойными ферментами карнитинпальмитоилтрансферазы на внешней и внутренней мембранах митохондрий и карнитин-ацилкарнитиновой транслоказой7. В митохондриальном матриксе цепочка механизмов окисления β укорачивает ацил-КоА в 4-ступенчатом процессе, который генерирует ацетил-КоА, который входит в цикл ТСА (цикл трикарбоновых кислот) и восстанавливает эквиваленты. Катаболизм пальмитата (C16), наиболее распространенных жирных кислот у животных, через этот путь дает ~131 АТФ, что значительно больше, чем ~38 АТФ, образующихся приокислении глюкозы.

Исследования с использованием радиоактивно меченых липидов показали, что кость занимает значительную часть циркулирующих липидов 9,10, в то время как генетическая абляция ферментов, критически важных для катаболизма липидов, приводит к снижению активности остеобластов и потере костной массы 9,11. Представленный здесь протокол использует меченую 14С-меченную жирную кислоту для оценки способности культивируемых остеобластов полностью метаболизировать жирные кислоты до CO2 или кислоторастворимых метаболитов, которые представляют собой промежуточные этапы в процессе окисления. Несмотря на то, что использование радиоактивности является обязательным, метод прост, требует ограниченных инвестиций и может быть адаптирован для использования с другими метаболитами и типами клеток, мечеными радиоактивными метками.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

В этом протоколе используется преобразование [1-14C]-олеиновой кислоты в 14CO2 в качестве индикатора окислительной способности жирных кислот. Местное управление по радиационной безопасности утвердило протокол использования радиоактивных материалов до начала экспериментов. Все процедуры облучения проводились за плексигласовым экраном с использованием соответствующих средств индивидуальной защиты. Местный комитет по уходу за животными и их использованию одобрил протокол перед использованием первичных клеток.

1. Окисление жирных кислот в культивируемых остеобластах

  1. Субкультивируют первичные кальвариальные остеобласты12 или остеобластическую клеточную линию, такую как Mc3t3-E1, и помещают в колбы Т-25 (5 x 105 клеток/колбу) в α-MEM, содержащем 10% фетальной бычьей сыворотки, 100 ЕД/мл пенициллина и 0,1 мкг/мл стрептомицина.
    1. Засейте 3-4 колбы для каждой группы лечения (т.е. контрольной и генной нокаутной или носительной и фармакологической терапии) для использования в эксперименте. Засейте дополнительно 1-2 колбы для каждой группы лечения для нормализации количества клеток или концентрации белков. Инкубируйте колбы с культурами в увлажнённом инкубаторе для клеточных культур при температуре 37 °C с 5%CO2.
  2. Культивируйте клетки в течение 2-3 дней, пока колбы не сливаются. Индуцируйте конфлюентные культуры к дифференцировке, добавив 50 мкг/мл аскорбиновой кислоты и 10 мМ β-глицеринфосфата (см. Таблицу материалов) в питательную среду и продолжайте культивирование до 14 дополнительных дней.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сывороточное голодание (добавление 0,5%-1% FBS) в течение ночи необходимо, если планируется лечение фактором роста. Снижение процента FBS ограничивает количество немеченых липидов в культуре и позволяет максимально эффективно использовать экзогенные факторы роста. Если необходимо проверить действие гормонов, используется FBS, лишенный древесного угля.
  3. За день до эксперимента подготовьте фильтровальную бумагу, пробки из резиновой втулки размером 15 мм x 30 мм и центральные лунки из полипропилена (см. Таблицу материалов).
    1. Сложите полоску фильтровальной бумаги размером 1 см х 10 см в форме веера и поместите ее в ведро полипропиленового центра лунки. Продавите рычаг полипропиленового центра через центр резиновой втулки и опустите полипропиленовый центр в колбу Т-25. Затем запечатайте колбу с помощью пробки от втулки (рисунок 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Может потребоваться отрегулировать расположение полипропиленового центра, чтобы гарантировать, что он не соприкасается с питательной средой. Во время эксперимента полипропиленовый центр хорошо предотвращает соприкосновение фильтровальной бумаги с маркировочной средой и позволяет собирать 14СО2.
  4. В день эксперимента конъюгировали [1-14С]-олеиновую кислоту с бычьим сывороточным альбумином (БСА) путем смешивания 20% бычьего сывороточного альбумина в фосфатно-солевом буфере (5 мкл на колбу) с 0,1 мкКи/мл [1-14С]-олеиновой кислоты (0,6 мкл/колба) в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл.
    1. Затем поместите пробирку в коническую пробирку объемом 50 мл и инкубируйте при температуре 37 °C в течение 30 минут, осторожно встряхивая. Подготовьте 1-2 дополнительных колбы для конъюгатов олеиновой кислоты-БСА, чтобы учесть ошибку пипетирования.
  5. Извлеките питательную среду из колбы для культуры тканей и замените ее 1,5 мл свежей среды для голодания сыворотки (шаг 1.2).
  6. Для каждой колбы смешайте 5,6 мкл раствора олеиновой кислоты-БСА (шаг 1.4) с 2 мкл 100 мМ раствора карнитина и 1 мл питательной среды для получения раствора для маркировки. Добавьте этикетировочный раствор в колбы для культур. Сохраните лишний раствор, чтобы прочитать общее количество активности, добавленной в анализ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор для мечения не добавляют в дополнительные колбы, предназначенные для количественного определения количества клеток или концентрации белка.
  7. Опустите полипропиленовые центральные лунки, содержащие фильтровальную бумагу, в колбу, а затем закройте ее резиновой пробкой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Крайне важно, чтобы полипропиленовый центр не контактировал с питательной средой. Это приведет к перекрестному загрязнению фильтровальной бумаги радиоактивной меткой жирной кислотой вместо CO2.
  8. Инкубировать клеточные культуры в течение 3 ч при 37 °C с 5%CO2.
  9. Для сбора 14CO2 введите 150 мкл 1 N NaOH в лунку полипропиленового центра для смачивания фильтровальной бумаги и 200 мкл 1 М хлорной кислоты в питательную среду. Введите NaOH и хлорную кислоту, протолкнув иглу через резиновую пробку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Резиновую пробку не следует снимать с колбы. Это может привести к утечке 14CO2 . Для облегчения инъекции держите колбу в вертикальном положении, а затем вернитесь в положение для культивирования после завершения инъекций.
  10. Инкубируйте колбы при температуре 55 °C в течение 1 ч.
  11. Откройте колбы после охлаждения их в колпаке для клеточных культур. Удалите фильтрующие бумаги из полипропиленовых центральных лунок пинцетом и поместите их в 3-4 мл сцинтилляционной жидкости (см. Таблицу материалов) в сцинтилляционный флакон.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 100 мкл избыточного раствора для мечения добавляют к 3-4 мл сцинтилляционной жидкости для измерения общего количества активности. 100 мкл базальной питательной среды (без [1-14С]-олеиновой кислоты) добавляют к 3-4 мл сцинтилляционной жидкости для измерения фоновой активности.
  12. После инкубации при комнатной температуре в течение 1 ч или в течение ночи измерьте радиоактивность в отсчетах в минуту (cpm) с помощью сцинтилляционного счетчика (см. Таблицу материалов).
  13. Чтобы нормализовать результаты CPM, выделяйте белковые экстракты из немеченых колб T-25 для каждого условия культивирования. Промойте 5 мл фосфатно-солевого буфера, добавьте 1 мл буфера для лизиса клеток RIPA в каждую колбу и соскребите поверхность клеток скребком.
    1. Перенесите буфер RIPA в микроцентрифужную пробирку с помощью пипетки и центрифугируйте при давлении 19 000 x g в течение 20 минут при 4 °C. Перенесите надосадочную жидкость с помощью пипетки в свежую микроцентрифужную пробирку и определите концентрацию белка в соответствии с протоколом анализа ВСА (см. Таблицу материалов).
    2. Разделите исходные показания cpm со сцинтилляционного счетчика на концентрацию белка, чтобы получить нормализованное cpm 14CO2 (Таблица 1).
  14. Соблюдайте местные требования по утилизации сцинтилляционных флаконов, материалов для клеточных культур, среды, шприцев и т.д. Обеззараживание рабочих поверхностей и проведение испытаний на радиоактивные стеклоочистители в соответствии с местными требованиями.

2. Кислоторастворимый метаболитный сбор

Примечание: 3-часовой инкубационный период, используемый на шаге 1.8 выше, может быть недостаточным для окисления всей полностью олеиновой кислоты [1-14С], поглощенной клетками, доСО2. Поток в пути окисления жирных кислот также можно оценить путем измерения радиоактивности в кислоторастворимой фракции.

  1. Соберите 1 мл подкисленной среды из каждой обработанной колбы Т-25 и переложите ее в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
  2. Добавьте 60 мкл 20% BSA и 100 мкл 16 М хлорной кислоты.
  3. Сделайте вихрь и инкубируйте в течение ночи при температуре 4 °C.
  4. Затем вортекс и центрифуга при 20 000 x g в течение 30 мин при 4 °C.
  5. Добавьте 200 мкл надосадочной жидкости в сцинтилляционную жидкость и измерьте активность (шаг 1.12).
  6. Нормализуйте показания в соответствии с концентрацией белка или измерениями ДНК (шаг 1.13.1).

3. Измерение окисления глюкозы или аминокислот

  1. Замените 14С-меченых олеиновых кислот на 14С-меченых глюкоз или 14С-меченых аминокислот, чтобы измерить окисление этих молекул топлива.
  2. Подготавливают культуры остеобластов в соответствии с шагами 1.1-1.2.
  3. Чтобы начать эксперимент, извлеките питательную среду из колбы для культуры тканей и замените ее 1,5 мл свежей среды для голодания сыворотки.
  4. Приготовьте мечающий раствор из 0,6 μКи 14С-меченых глюкозы или 14С-меченных аминокислот в 1 мл голодающих сред и добавьте в колбы.
  5. Выполните шаги 1.6-1.13.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Ферментативная активность карнитинпальмитоилтрансферазы-1 (Cpt1) и карнитина пальмитоилтрансферазы-2 (Cpt2) необходима для окисления длинноцепочечных жирных кислот в митохондриях. Cpt1 является ферментом, ограничивающим скорость в метаболическом пути, но три изоформы (Cpt-1a, Cpt-1b и Cpt-1c) кодируются в геномах млекопитающих, и генетическое нарушение одной изоформы может привести к компенсационной регуляции другой изоформы13. В отличие от него, Cpt2 кодируется одним геном. В эксперименте, показа...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Описанная выше методика позволяет провести прямую оценку окисления жирных кислот, поскольку измеряемые выходные данные составляют 14CO2, собранных на фильтровальной бумаге, пропитанной NaOH, и кислоторастворимых метаболитов, собранных после подкисления культуры хлорной кислотой. Коммерчески доступные наборы для анализа, в которых используются флуоресцентно меченые молекулы липидов или аналоги липидов, могут измерять поглощение липидов, но они не определяют катаболиз...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана премией Merit Review Award от Службы биомедицинских лабораторных исследований и разработок Управления по исследованиям и разработкам по делам ветеранов (BX003724) и грантом от Национального института диабета, заболеваний пищеварительной системы и почек (DK099134).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
[1-14C]-Олеиновая кислотаPerkin ElmerNEC317050UC
15 x 30 мм резиновые пробкиVWR89097-542
1 мл шприцBD прецизионный309628
иглой 25 G (25 G x 1 1/2 in)BD прецизионный305127
аскорбиновой кислотойSigma AldrichA4403
BCA Набор для анализа белкаThermo Fisher23225Другие наборы также подходят
Beckman Scintillation Counter, или аналогBeckman CoulterLS6000SC
Бета-глицеринфосфатSigma AldrichG6626
Бычья сыворотка АльбуминSigma Aldrich126609
карнитинSigma AldrichC0283
БуферПротокол поддается типичным буферам для лизиса (т.е. RIPA)
Рассекающие щипцыДоступны из нескольких источников
Набор для количественного определения ДНК Доступныиз нескольких источников
Dulbecco' s Фосфатно-солевой буферCorning20-030-CV
Фетальная сывороткаДоступно из нескольких источников
Микроцентрифужные пробирки, 1,5 млДоступно из нескольких источников
Минимальная эссенсиальная среда, альфа-модификацияCorning10-022-CV
Пенициллин-стрептомицинGibco15140122
Хлорная кислотаSigma Aldrich50439
Полипропиленовые центральные лункиVWR72760-048
Гидроксид натрияSigma AldrichS5881
T-25 Колба для культуры тканей горловиныCorning430639
инкубатор для культуры
Трипсин (0,25%)-EDTAGibco25200056
Ultima Gold (сцинтилляционный раствор)PerkinElmer6013329
Ватман хроматографическая бумагаSigma AldrichWHA3030917
для клеточного лизиса крупного рогатого скота тканей

Ссылки

  1. Cameron, D. A. The fine structure of osteoblasts in the metaphysis of the tibia of the young rat. Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9, 583-595 (1961).
  2. Dudley, H. R., Spiro, D. The fine structure of bone cells. Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 11 (3), 627-649 (1961).
  3. Shapiro, I., Haselgrove, J. in Ch. 5, Bone Metabolism and Mineralization. Bone Vol. 4. Hall, B. K. , CRC Press. 99-140 (1991).
  4. Komarova, S. V., Ataullakhanov, F. I., Globus, R. K. Bioenergetics and mitochondrial transmembrane potential during differentiation of cultured osteoblasts. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 279 (4), 1220-1229 (2000).
  5. Bolton, J. G., Patel, S., Lacey, J. H., White, S. A prospective study of changes in bone turnover and bone density associated with regaining weight in women with anorexia nervosa. Osteoporosis International. 16 (12), 1955-1962 (2005).
  6. Nussbaum, M., Baird, D., Sonnenblick, M., Cowan, K., Shenker, I. R. Short stature in anorexia nervosa patients. Journal of Adolescent Health Care. 6 (6), 453-455 (1985).
  7. Alekos, N. S., Moorer, M. C., Riddle, R. C. Dual effects of lipid metabolism on osteoblast function. Frontiers in Endocrinology. 11, 578194(2020).
  8. Karner, C. M., Long, F. Glucose metabolism in bone. Bone. 115, 2-7 (2018).
  9. Kim, S. P., et al. Fatty acid oxidation by the osteoblast is required for normal bone acquisition in a sex- and diet-dependent manner. JCI Insight. 2 (16), 92704(2017).
  10. Niemeier, A., et al. Uptake of postprandial lipoproteins into bone in vivo: impact on osteoblast function. Bone. 43 (2), 230-237 (2008).
  11. Helderman, R. C., et al. Loss of function of lysosomal acid lipase (LAL) profoundly impacts osteoblastogenesis and increases fracture risk in humans. Bone. 148, 115946(2021).
  12. Jonason, J. H., O'Keefe, R. J. Isolation and culture of neonatal mouse calvarial osteoblasts. Methods in Molecular Biology. 1130, 295-305 (2014).
  13. Haynie, K. R., Vandanmagsar, B., Wicks, S. E., Zhang, J., Mynatt, R. L. Inhibition of carnitine palymitoyltransferase1b induces cardiac hypertrophy and mortality in mice. Diabetes, Obesity & Metabolism. 16 (8), 757-760 (2014).
  14. Long, C. P., Antoniewicz, M. R. High-resolution (13)C metabolic flux analysis. Nature Protocols. 14 (13), 2856-2877 (2019).
  15. Divakaruni, A. S., et al. Etomoxir inhibits macrophage polarization by disrupting CoA homeostasis. Cell Metabolism. 28 (3), 490-503 (2018).
  16. Raud, B., et al. Etomoxir actions on regulatory and memory T cells are independent of cpt1a-mediated fatty acid oxidation. Cell Metabolism. 28 (3), 504-515 (2018).
  17. Frey, J. L., et al. Wnt-Lrp5 signaling regulates fatty acid metabolism in the osteoblast. Molecular and Cellular Biology. 35 (11), 1979-1991 (2015).
  18. Frey, J. L., Kim, S. P., Li, Z., Wolfgang, M. J., Riddle, R. C. beta-catenin directs long-chain fatty acid catabolism in the osteoblasts of male mice. Endocrinology. 159 (1), 272-284 (2018).
  19. Li, Z., et al. Glucose transporter-4 facilitates insulin-stimulated glucose uptake in osteoblasts. Endocrinology. 157 (11), 4094-4103 (2016).
  20. Lee, J., et al. Loss of hepatic mitochondrial long-chain fatty acid oxidation confers resistance to diet-induced obesity and glucose intolerance. Cell Reports. 20 (3), 655-667 (2017).
  21. Kim, S. P., et al. Sclerostin influences body composition by regulating catabolic and anabolic metabolism in adipocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (52), 11238-11247 (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Дифференцировка остеобластовформирование костной тканиметаболические потребностизаболевания скелетажирные кислоты с 14Cминерализация костианаболические сигналыокисление глюкозы

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.