Протокол здесь описывает измерение пространственной организации зрительных осей глаз комнатной мухи, нанесенных на карту автоматическим устройством, с использованием явления псевдопупила и механизма зрачка фоторецепторных клеток.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Автоматизированное картографирование визуального пространства составных глаз комнатной мухи
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
В данной работе описывается автоматическое измерение пространственной организации зрительных осей глаз насекомых, которые состоят из нескольких тысяч зрительных единиц, называемых омматидиями. Каждый омматидий отбирает оптическую информацию под небольшим сплошным углом, с приблизительной гауссовской распределенной чувствительностью (половина ширины порядка 1°), центрированной вокруг визуальной оси. Вместе омматидии собирают визуальную информацию из почти панорамного поля зрения. Пространственное распределение визуальных осей, таким образом, определяет пространственное разрешение глаза. Знание оптической организации сложного глаза и его остроты зрения имеет решающее значение для количественных исследований нейронной обработки визуальной информации. Здесь мы представляем автоматизированную процедуру картирования зрительных осей сложного глаза, используя внутреннее, in vivo оптическое явление, псевдопупил, и механизм зрачка фоторецепторных клеток. Мы описываем оптомеханическую установку для сканирования глаз насекомых и используем экспериментальные результаты, полученные от комнатной мухи Musca domestica, чтобы проиллюстрировать этапы процедуры измерения.
Введение
Компактность зрительных систем насекомых и ловкость их владельцев, демонстрирующая высокоразвитую обработку визуальной информации, заинтриговали людей как из научных, так и из ненаучных слоев. Составные глаза насекомых были признаны мощными оптическими устройствами, обеспечивающими острые и универсальные зрительные способности 1,2. Мухи, например, хорошо известны своей быстрой реакцией на движущиеся объекты, а пчелы славятся тем, что обладают цветовым зрением и поляризационным зрением2.
Составные глаза членистоногих состоят из многочисленных анатомически сходных единиц, омматидий, каждая из которых увенчана фасеточной линзой. У Двукрылых (мух) сборка фасетных линз, известных в совокупности как роговица, часто приближается к полушарию. Каждый омматидий пробы падающего света с небольшого сплошного угла половинной ширины порядка 1°. Омматидии двух глаз вместе отбирают примерно полный сплошной угол, но зрительные оси омматидий распределены неравномерно. Некоторые области глаз имеют высокую плотность зрительных осей, что создает область высокой пространственной остроты, в просторечии называемую ямкой. Оставшаяся часть глаза имеет более грубое пространственное разрешение 3,4,5,6,7,8,9.
Количественный анализ оптической организации сложных глаз имеет решающее значение для детальных исследований нейронной обработки визуальной информации. Исследования нейронных сетей мозга насекомого10 часто требуют знания пространственного распределения омматидиальных осей. Кроме того, сложные глаза вдохновили несколько технических инноваций. Многие инициативы по созданию био-вдохновленных искусственных глаз были построены на существующих количественных исследованиях реальных сложных глаз 11,12,13. Например, полупроводниковый датчик с высоким пространственным разрешением был разработан на основе модели глаз насекомых 11,14,15,16,17. Однако разработанные до сих пор устройства не реализовали фактические характеристики существующих глаз насекомых. Точное представление о сложных глазах насекомых и их пространственной организации потребует подробных и надежных данных от естественных глаз, которые не являются широко доступными.
Основной причиной скудости данных является крайняя утомительность имеющихся процедур построения графиков пространственных характеристик глаз. Это мотивировало попытки создать более автоматизированную процедуру картирования глаз. В первой попытке автоматизированного анализа глаз насекомых Дуглас и Велинг18 разработали процедуру сканирования для картирования размеров фасеток в роговице и продемонстрировали ее осуществимость для нескольких видов мух. Здесь мы расширяем их подход, разрабатывая методы не только сканирования граней роговицы, но и оценки визуальных осей омматидий, к которым принадлежат фасетки. Мы представляем случай с глазами комнатной мухи, чтобы проиллюстрировать соответствующие процедуры.
Экспериментальная установка для сканирования глаз насекомых является: частично оптической, т.е. микроскопом с камерой и оптикой освещения; частично механическая, т.е. гониометрическая система для вращения исследуемого насекомого; и частично вычислительное, т.е. использование программных драйверов для приборов и программ для выполнения измерений и анализов. Разработанные методы охватывают целый ряд вычислительных процедур, от захвата изображений, выбора каналов камеры и установки пороговых значений обработки изображений до распознавания отдельных фасетных местоположений с помощью ярких пятен света, отраженных от их выпуклых поверхностей. Методы преобразования Фурье имели решающее значение в анализе изображений, как для обнаружения отдельных граней, так и для анализа фасетных паттернов.
Документ структурирован следующим образом. Сначала мы представляем экспериментальную установку и феномен псевдопупила — оптический маркер, используемый для идентификации зрительных осей фоторецепторов в живых глазах 19,20,21. Далее излагаются алгоритмы, используемые в процедуре сканирования и анализе изображений.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Протокол соответствует руководящим принципам Университета по уходу за насекомыми.
1. Приготовление комнатной мухи, Musca domestica
- Соберите муху из лабораторно выращенной популяции. Поместите муху в латунный держатель (рисунок 1).
- Отрежьте 6 мм от верхней части удерживающей трубки (см. Таблицу материалов). Новая верхняя часть трубы имеет внешний диаметр 4 мм и внутренний диаметр 2,5 мм (рисунок 1А). Поместите живую муху внутрь трубки, запечатайте трубку хлопком, чтобы предотвратить повреждение мухи, и толкните муху так, чтобы голова выступала из трубки, а ее тело удерживалось (рисунок 1B). Обездвижьте голову пчелиным воском так, чтобы глаза оставались непокрытыми (рисунок 1С-Е).
- Снова отрежьте трубку так, чтобы длина трубки составляла 10 мм (рисунок 1С). Поместите пластиковую трубку с мухой в латунный держатель таким образом, чтобы один глаз мухи указывал вверх, когда держатель опирается на столешницу (рисунок 1D, E).
- Отрегулируйте ориентацию трубки таким образом, чтобы при возвышении гониометра на 0° (т.е. азимутальная ступень находится в горизонтальном положении) вертикальный пучок освещения микроскопа был перпендикулярен поверхности глаза в центральной области, между вентральным и дорсальным, а также между передним и задним краями глаза, чтобы весь глаз можно было сканировать в пределах диапазона азимута и высоты, разрешенных установкой.
2. Выравнивание оси вращения азимута гониометра с оптической осью микроскопа
- Установите штифт выравнивания на азимутальной ступени вращения таким образом, чтобы положение x-y наконечника можно было отрегулировать в соответствии с осью азимута на моторизованной ступени. Во время просмотра с помощью микроскопа, оснащенного 5-кратным объективом, сосредоточьтесь на наконечнике с помощью джойстика оси Z (рисунок 2).
- Совместите регулировку x-y оси азимута с оптической осью микроскопа и убедитесь, что оси возвышения и азимута вращающегося оси предварительно выровнены с центрированным штифтом с помощью джойстиков осей x и y.
- Манипулируйте джойстиками азимута и высоты, чтобы проверить, центрирован ли штифт относительно обеих степеней свободы. При хорошем центрировании кончик штифта остается примерно в том же положении во время вращения по азимуту и высоте.
3. Выравнивание глаз мухи с моторизованными ступенями
- При подъеме ступени на 0° установите муху и ее держатель на азимутальную ступень. Понаблюдайте за глазом мухи с помощью микроскопа.
- Когда светодиод подсветки включен, отрегулируйте горизонтальное положение мухи так, чтобы центр псевдопупила был выровнен с микроскопом. Отрегулируйте вертикальное положение мухи с помощью вращающегося винта держателя (рисунок 1D), так, чтобы глубокий псевдопупил (DPP; Рисунок 3) 19,20,21 выводится в фокус на уровне оси возвышения.
- Выровняйте DPP по отношению к осям азимута и высоты, центрировав его в поле зрения (см. рисунок 2). Используйте магниты, приклеенные к нижней части держателя мухи, чтобы прочно прикрепить его к железной пластине, установленной на азимутальной ступени, позволяя при этом ручную регулировку скольжения.
- Переключите вид на цифровую камеру, установленную на микроскопе. Запустите программную инициализацию системы GRACE, которая включает в себя инициализацию контроллеров двигателя и контроллера Arduino LED (рисунок 4). Поэтому откройте MATLAB R2020a или более позднюю версию. Запустите сценарий MATLAB Initialize_All_Systems (дополнительный файл 1).
- Проверьте, находится ли псевдопупил мухи (рисунок 3B, C) в центре проецируемого изображения на экране компьютера.
4. Автофокусировка и автоцентрирование
- Довести фокус до уровня псевдопупила роговицы (CPP; Рисунок 3B) 19,20,21 вручную с помощью джойстика оси Z.
- Запустите алгоритм автофокусировки (дополнительный файл 1, автофокусировка скрипта), чтобы получить четкое изображение на уровне роговицы. Проверьте, вернув фокус на уровень DPP, отрегулировав моторизованный каскад оси Z. Сохраняйте расстояние между DPP и CPP (в шагах двигателя).
- Тонкая настройка центрирования псевдопупила путем запуска алгоритма автоцентрирования (дополнительный файл 1, сценарий AC). Верните фокус на уровень CPP.
- Повторно запустите алгоритм автофокусировки. Обнулите моторизованные ступени в их текущих положениях (X,Y,Z,E,A) = (0,0,0,0,0), где E - высота, а A - азимут.
- Запустите алгоритм сканирования (дополнительный файл 1, скрипт Scan_Begin), который сэмплирует изображения глаз по траекториям с шагом 5°, выполняя алгоритмы автоцентрирования и автофокусировки.
- По завершении отбора проб выключите светодиодный контроллер и контроллеры двигателя.
- Обработайте изображения, применив алгоритмы обработки изображений (Дополнительный файл 1, скрипт ImProcFacets).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Животные и оптическая стимуляция
Эксперименты проводятся на комнатных мухах (Musca domestica), полученных из культуры, поддерживаемой департаментом эволюционной генетики в Университете Гронингена. Перед измерениями муху обездвиживают, склеивая ее воском с низкой температурой плавления в хорошо подогнанную трубку. Муха впоследствии монтируется на ступень моторизованного гониометра. Центр двух поворотных ступеней совпадает с фокусом микроскопической установки24. Луч свет...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Пространственное распределение зрительных осей глаз комнатной мухи может быть построено с использованием псевдопупильского феномена сложных глаз и изменений отражения, вызванных светозависимым механизмом зрачка. Поэтому исследуемая муха устанавливается в гониометрическую систему, которая позволяет проверять локальный фасетный рисунок с помощью микроскопа, оснащенного цифровой камерой, все под компьютерным управлением. Анализ изображений дает карты глаз. Существенная трудность заключается в том, что без тщательного позици...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют конфликта интересов, о которых можно было бы сообщить.
Благодарности
Это исследование было финансово поддержано Управлением научных исследований ВВС / Европейским управлением аэрокосмических исследований и разработок AFOSR / EOARD (грант FA9550-15-1-0068, D.G.S.). Мы благодарим д-ра Приможа Пириха за многочисленные полезные обсуждения, а также Кехана Сату, Хейна Леертувера и Оскара Ринкона Карденьо за помощь.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Цифровая камера | PointGrey | BFLY-U3-23S6C-C | Получение усиленных изображений и цифровая связь с ПК |
| Звезда высокой мощности LED | Velleman | LH3WW | Источник света для наблюдения и визуализации сложного глаза |
| Держатель для исследуемой мухи | Университет Гронингена | Различные конструкции были изготовлены университетской мастерской | |
| Линейный двигатель | ELERO | ELERO Junior 1, версия C | Приводит в действие верхний микроскоп вверх и вниз. (Нагрузка 300 Н, скорость хода 15 мм/с, номинальный ток 1,2 А) |
| Низкотемпературный плавильный воск | различный | Низкотемпературный воск для определения температуры плавления служит для обездвиживания мухи и фиксации ее на держателе | |
| Микроскоп | Zeiss | Подойдет любая альтернативная марка микроскопа; предпочтительной целью является 5-кратный | |
| контроллер двигателя и светодиода | Университет Гронингена | Z-o1 | Разработан и построен Университетом Гронингена и основан на технологиях Arduino и Adafruit. |
| Моторизованная сцена | Standa (Вильнюс, Литва) | 8MT175-50XYZ-8MR191-28 | 6-осевая моторизованная сцена, модифицированная для 5 степеней свободы. |
| Оптические компоненты | LINUS | Несколько диаграмм и линз, образующих систему эпиподсветки (см. Ставенга, Журнал экспериментальной биологии 205, 1077-1085, 2002) | |
| ПК под управлением MATLAB | Университет Гронингена | ПК способен обрабатывать изображения с камеры PointGrey, управлять интенсивностью светодиодов и отправлять управляющие сигналы на моторные контроллеры системы | |
| Power Supply (36 В, 3.34A) | Standa (Вильнюс, Литва) | PUP120-17 | Специализированный источник питания для контроллеров двигателей STANDA |
| Паяльник | различный | Используется для плавления воска | |
| Шаговый и постоянный контроллер двигателя | Standa (Вильнюс, Литва) | 8SMC4-USB-B9-B9 | Специализированные контроллеры для моторизованной сцены STANDA с возможностью связи с MATLAB |
| Finntip-61 | Finnpipette Ky, Хельсинки | FINNTIP-61, 200-1000μ L | НАКОНЕЧНИКИ ДЛЯ ПИПЕТОК FINNPIPETTES, 400/КОРОБКА. Он используется для удержания инструмента |
| придания формы ручке для резьбы / выжигания нити | Max Wax | Наконечник ручки для резьбы предназначен для переноса воска на головку мухи | |
| MATLAB | Mathworks, Натик, Массачусетс, США | основная программа, а также наборы инструментов для получения изображений, анализа изображений и управления инструментами. | Язык программирования, используемый для реализации алгоритмов |
Ссылки
- Land, M. F., Nilsson, D. Animal Eyes. , Oxford University Press. (2012).
- Cronin, T. W., Johnsen, S., Marshall, N. J., Warrant, E. J. Visual Ecology. , Princeton University Press. (2014).
- Horridge, G. A. The separation of visual axes in apposition compound eyes. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B. 285 (1003), 1-59 (1978).
- Land, M. F., Eckert, H. Maps of the acute zones of fly eyes. Journal of Comparative Physiology. A. 156, 525-538 (1985).
- Warrant, E. J. The design of compound eyes and the illumination of natural habitats. Ecology of Sensing. Barth, F. G., Schmid, A. , Springer. Berlin. 187-213 (2001).
- Warrant, E. J., Kelber, A., Kristensen, N. P. Eyes and vision. In. Handbook of Zoology, Vol. IV, Part 36, Lepidoptera, Moths and Butterflies, Vol 2: Morphology, Physiology and Development. Kristensen, N. P. , Walter de Gruyter. Berlin New York. 325-359 (2003).
- Petrowitz, R., Dahmen, H., Egelhaaf, M., Krapp, H. G. Arrangement of optical axes and spatial resolution in the compound eye of the female blowfly Calliphora. Journal of Comparative Physiology. A. 186 (7-8), 737-746 (2000).
- Smolka, J., Hemmi, J. M. Topography of vision and behaviour. The Journal of Experimental Biology. 212, Pt 21 3522-3532 (2009).
- Krapp, H. G., Gabbiani, F. Spatial distribution of inputs and local receptive field properties of a wide-field, looming sensitive neuron. Journal of Neurophysiology. 93 (4), 2240-2253 (2005).
- Strausfeld, N. J. Arthropod Brains: Evolution, Functional Elegance, and Historical Significance. , Belknap Press of Harvard University Press. (2012).
- Jeong, K. H., Kim, J., Lee, L. P. Biologically inspired artificial compound eyes. Science. 312 (5773), 557-561 (2006).
- Davis, J., Barrett, S., Wright, C., Wilcox, M. A bio-inspired apposition compound eye machine vision sensor system. Bioinspiration & Biomimetics. 4 (4), 046002(2009).
- Lee, G. J., Choi, C., Kim, D., Song, Y. M. Bioinspired artificial eyes: Optic components, digital cameras, and visual prostheses. Advanced Functional Materials. 28 (24), 1870168(2018).
- Zhang, K., et al. Origami silicon optoelectronics for hemispherical electronic eye systems. Nature Communications. 8, 1782(2017).
- Wang, M., et al. Subtle control on hierarchic reflow for the simple and massive fabrication of biomimetic compound eye arrays in polymers for imaging at a large field of view. Journal of Materials Chemistry. C. 4, 108-112 (2016).
- Floreano, D., et al. Miniature curved artificial compound eyes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 9267-9272 (2013).
- Song, Y. M., et al. Digital cameras with designs inspired by the arthropod eye. Nature. 497 (7447), 95-99 (2013).
- Douglass, J. K., Wehling, M. F. Rapid mapping of compound eye visual sampling parameters with FACETS, a highly automated wide-field goniometer. Journal of Comparative Physiology A. 202 (12), 839-851 (2016).
- Franceschini, N. Sampling of the visual environment by the compound eye of the fly: fundamentals and applications. Photoreceptor Optics. Snyder, A. W., Menzel, R. , Springer. Berlin, Heidelberg, New York. 98-125 (1975).
- Franceschini, N., Kirschfeld, K. The automatic control of the light flux in the compound eye of Diptera. Spectral, statistical, and dynamical properties of the mechanism. Biological Cybernetics. 21, 181-203 (1976).
- Stavenga, D. G. Pseudopupils of compound eyes. Handbook of Sensory Physiology, Vol VII/6A. Autrum, H. , Springer. Berlin-Heidelberg-New York. 357-439 (1979).
- Stavenga, D. G., Kruizinga, R., Leertouwer, H. L. Dioptrics of the facet lenses of male blowflies Calliphora and Chrysomia. Journal of Comparative Physiology A. 166, 365-371 (1990).
- Straw, A. D., Warrant, E. J., O'Carroll, D. C. A "bright zone" in male hoverfly (Eristalis tenax) eyes and associated faster motion detection and increased contrast sensitivity. The Journal of Experimental Biology. 209, 4339-4354 (2006).
- Stavenga, D. G. Reflections on colourful ommatidia of butterfly eyes. The Journal of Experimental Biology. 205, 1077-1085 (2002).
- Beersma, D. G. M., Stavenga, D. G., Kuiper, J. W. Organization of visual axes in the compound eye of the fly Musca domestica L. and behavioural consequences. Journal of Comparative Physiology. 102, 305-320 (1975).
- Taylor, G. J., et al. Bumblebee visual allometry results in locally improved resolution and globally improved sensitivity. eLife. 8, 40613(2019).
- Rigosi, E., Warrant, E. J., O'Carroll, D. C. A new, fluorescence-based method for visualizing the pseudopupil and assessing optical acuity in the dark compound eyes of honeybees and other insects. Scientific Reports. 11, 21267(2021).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
