Количественная оценка связывающих взаимодействий между Cu(II) и пептидными остатками в присутствии и отсутствии хромофоров

Краткое содержание

Эта статья посвящена использованию электронной абсорбционной спектроскопии и изотермической титрующей калориметрии для исследования и количественной оценки термодинамики связывания Cu(II) с пептидами и белками.

Аннотация

Медь (II) является важным металлом в биологических системах, придавая уникальные химические свойства биомолекулам, с которыми она взаимодействует. Сообщалось, что он напрямую связывается с различными пептидами и играет как необходимую, так и патологическую роль, начиная от опосредующей структуры до свойств переноса электронов и передачи каталитической функции. Количественная оценка сродства связывания и термодинамики этих Cu(II)-пептидных комплексов in vitro дает представление о термодинамической движущей силе связывания, потенциальных конкуренциях между различными ионами металлов для пептида или между различными пептидами для Cu(II) и распространенности Cu(II)-пептидного комплекса in vivo. Тем не менее, количественная оценка термодинамики связывания может быть сложной задачей из-за множества факторов, включая учет всех конкурирующих равновесий в эксперименте по титрованию, особенно в тех случаях, когда отсутствуют дискретные спектроскопические ручки, представляющие пептид, ион металла d-блока и их взаимодействия.

Здесь представлен надежный набор экспериментов для точной количественной оценки Cu(II)-пептидной термодинамики. Данная статья посвящена использованию электронной абсорбционной спектроскопии при наличии и отсутствии хромофорных лигандов для обеспечения необходимой спектроскопической обработки Cu(II) и использованию изотермической титрационной калориметрии без маркировки. В обоих экспериментальных методах описывается процесс, учитывающий все конкурирующие равновесия. Хотя основное внимание в этой статье уделяется Cu(II), описанный набор экспериментов может применяться за пределами Cu(II)-пептидных взаимодействий и обеспечивать основу для точной количественной оценки других металл-пептидных систем в физиологически значимых условиях.

Введение

Биология эволюционировала, чтобы использовать разнообразную химию ионов металлов, необходимых для жизни, чтобы адаптироваться и выжить в окружающей среде. По оценкам, 25-50% белков используют ионы металлов для структуры и функции¹. Особая роль и окислительно-восстановительное состояние иона металла напрямую связаны с составом и геометрией биологических лигандов, которые его координируют. Кроме того, окислительно-восстановительные активные ионы металлов, такие как Cu(II), должны жестко регулироваться, чтобы они не взаимодействовали с окислителями через Фентон-подобную химию с образованием активных форм кислорода (АФК)^<....

Протокол

1. Электронная абсорбционная спектроскопия: прямое титрование с буферной конкуренцией

1. Пробоподготовка
   1. Готовят буферный раствор 50 мМ 2-[бис(2-гидроксиэтил)амино]-2-(гидроксиметил)пропан-1,3-диол (бисТрис) при рН 7,4 с использованием сверхчистой воды (сопротивление >18 МОм). Удаляют следы ионов металлов путем инкубации с высокоаффинной смолой в течение не менее 2 ч с последующей фильтрацией.
   2. Растворите или разбавьте известное количество пептида в безметалловом буфере.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При мониторинге d-d диапазонов с малыми коэффициентами вымирания²¹ необходимо использовать более высокие концентрации п....

Результаты

Цель состояла в том, чтобы количественно оценить и подтвердить термодинамику связывания Cu(II) с С-пептидом с использованием дополнительных методов электронной абсорбционной спектроскопии и ITC. Из-за надежного характера электронной абсорбционной спектроскопии было выполнено прямое титрование Cu(II) в 300 мкМ C-пептид (рисунок 1). Добавление 150 мкМ Cu(II) вызвало немедленное увеличение диапазона на 600 нм, приписываемое d-d диапазону Cu(II), и продолжало увеличиваться до тех пор, пока не бы.......

Обсуждение

В этой статье представлен надежный метод количественной оценки сродства и термодинамики связывания Cu(II) с пептидами. Комплексы с Cu(II) идеально подходят для мониторинга полосы поглощения d-d на металлическом участке из-за его электронной конфигурации d⁹ . Хотя коэффициент вымирания невелик, что требует больших концентраций комплекса для получения надежного сигнала, титрование Cu(II) в пептид может быстро дать представление о стехиометрии связывания и приблизительном сродстве связывания. Тем не менее, может .......

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
1,10-фенантролин	Sigma Aldrich	131377-25G
bis-Tris буфер	Fisher	BP301-100
Bottle-top 0,45 мкм мембрана	Nalgene	296-4545	Приемлема любая система фильтрации, которая удаляет смолу без внесения загрязняющих веществ
Хлорид меди(II)	Alfa Aesar	12458
EDTA	Sigma Aldrich	EDS-500G
Электронный абсорбционный спектрофотометр	Varian	Cary 5000	Другой подходящий чувствительный спектрофотометр приемлемый
высокоаффинный смола	Sigma Aldrich	C7901-25G
Изотермический титрованный калориметр (ITC)	TA Instruments	Nano ITC Малообъемный
ITC анализ программного обеспечения	TA Instruments	NanoAnalyze	SEDPHAT (Methods. 2015, 76: 137– 148) также может быть использовано
программное обеспечение ITC	TA Instruments	ITCRun
легкий тонкий дворник	Kimwipe	34155
загрузочный шприц	Hamilton	Syr 500 uL, 1750 TLL-SAL
согласованные кюветы	Starna Cells, Inc	16.100-Q-10/Z20	Убедитесь, что окно для кюветы малого объема совпадает с высотой луча спектрофотометра
MOPS буфер	Alfa Aesar A12914
спектрофотометр программное обеспечение	Cary	WinUV Scan
программа для работы электронных таблиц	Microsoft	Excel	Любая подходящая программа для работы с электронными таблицами будет работать
шприц для титрования	TA Instruments	5346
сверхчистая вода	Millipore Sigma	Milli-Q	Любая вода в порядке, пока >18 MΩ сопротивление