Количественная оценка связывающих взаимодействий между Cu(II) и пептидными остатками в присутствии и отсутствии хромофоров

Краткое содержание

Эта статья посвящена использованию электронной абсорбционной спектроскопии и изотермической титрующей калориметрии для исследования и количественной оценки термодинамики связывания Cu(II) с пептидами и белками.

Аннотация

Медь (II) является важным металлом в биологических системах, придавая уникальные химические свойства биомолекулам, с которыми она взаимодействует. Сообщалось, что он напрямую связывается с различными пептидами и играет как необходимую, так и патологическую роль, начиная от опосредующей структуры до свойств переноса электронов и передачи каталитической функции. Количественная оценка сродства связывания и термодинамики этих Cu(II)-пептидных комплексов in vitro дает представление о термодинамической движущей силе связывания, потенциальных конкуренциях между различными ионами металлов для пептида или между различными пептидами для Cu(II) и распространенности Cu(II)-пептидного комплекса in vivo. Тем не менее, количественная оценка термодинамики связывания может быть сложной задачей из-за множества факторов, включая учет всех конкурирующих равновесий в эксперименте по титрованию, особенно в тех случаях, когда отсутствуют дискретные спектроскопические ручки, представляющие пептид, ион металла d-блока и их взаимодействия.

Здесь представлен надежный набор экспериментов для точной количественной оценки Cu(II)-пептидной термодинамики. Данная статья посвящена использованию электронной абсорбционной спектроскопии при наличии и отсутствии хромофорных лигандов для обеспечения необходимой спектроскопической обработки Cu(II) и использованию изотермической титрационной калориметрии без маркировки. В обоих экспериментальных методах описывается процесс, учитывающий все конкурирующие равновесия. Хотя основное внимание в этой статье уделяется Cu(II), описанный набор экспериментов может применяться за пределами Cu(II)-пептидных взаимодействий и обеспечивать основу для точной количественной оценки других металл-пептидных систем в физиологически значимых условиях.

Введение

Биология эволюционировала, чтобы использовать разнообразную химию ионов металлов, необходимых для жизни, чтобы адаптироваться и выжить в окружающей среде. По оценкам, 25-50% белков используют ионы металлов для структуры и функции¹. Особая роль и окислительно-восстановительное состояние иона металла напрямую связаны с составом и геометрией биологических лигандов, которые его координируют. Кроме того, окислительно-восстановительные активные ионы металлов, такие как Cu(II), должны жестко регулироваться, чтобы они не взаимодействовали с окислителями через Фентон-подобную химию с образованием активных форм кислорода (АФК)^2,3,4. Понимание режимов связывания и сродства, которые управляют его биохимией, должно помочь прояснить биологическую роль иона металла.

Многие методы используются для изучения связывающих взаимодействий металлов и пептидов. Это в основном спектроскопические методы, но также включают компьютерное моделирование с использованием молекулярной динамики, как видно через взаимодействия Cu(II) с фрагментом бета-амилоида (Aβ)⁵. Широко используемым спектроскопическим методом, доступным для многих университетов, является ядерный магнитный резонанс (ЯМР). Используя парамагнитную природу Cu(II), Gaggelli et al. смогли показать, где ион металла связывается на петиде через расслабление близлежащих ядер⁶. Электронный парамагнитный резонанс (ЭПР) также может быть использован для исследования местоположения и режима ионного связывания парамагнитного металла⁷. Другие спектроскопические методы, такие как круговой дихроизм (CD), могут описывать координацию относительно Cu(II) в таких системах, как трипептидные системы⁸, а масс-спектрометрия может показать стехиометрию и то, с какими остатками координируется ион металла через схемы фрагментации ^9,10.

Некоторые из этих методов, такие как ЯМР, не имеют меток, но требуют больших концентраций пептидов, что создает проблемы для изучения. Другой распространенный метод, называемый флуоресцентной спектроскопией, был использован для связи положения тирозина или триптофана с закалкой из Cu(II)^11,12. Аналогичным образом, этот метод может показать структурные изменения в результате связывания Cu(II)¹³. Однако проблемы с этими исследованиями связывания металлов с пептидами заключаются в том, что они исследуют хромофорные аминокислоты, такие как тирозин, которые есть не во всех системах, что ион металла связывается в классической модели и что метод может быть неблагоприятным в физиологических условиях. Действительно, появляется несколько пептидов, которые не содержат таких хромофорных аминокислот или связываются по классическим моделям, что исключает использование этих методов ^14,15. В этой статье подробно описываются подходы к оценке связывающих свойств в этих сценариях в физиологически значимых условиях.

Биологические лиганды могут принимать различные состояния протонирования, которые могут влиять на связывание ионов металлов, таких как имидазольное кольцо на гистидине. Если pH не поддерживается последовательно, результаты могут быть запутанными или противоречивыми. По этой причине буферы являются важным компонентом в изучении взаимодействия металл-белок/пептид. Однако было показано, что многие буферы благоприятно взаимодействуют с ионами металлов^16,17. В дополнение к конкуренции с интересующей биологической молекулой, буфер может иметь аналогичные координирующие атомы, которые может быть трудно отличить от координирующих атомов пептида или белка. В этом исследовании основное внимание уделяется электронной абсорбционной спектроскопии и изотермической титрующей калориметрии (ITC) в качестве двух взаимодополняющих методов изучения Cu(II)-пептидных взаимодействий с особыми соображениями, касающимися выбора буфера.

Электронная абсорбционная спектроскопия является быстрым, широко доступным методом изучения металлосвязывающих взаимодействий. Облучение светом в ультрафиолетовых (УФ) или видимых длинах волн может привести к поглощению металлоцентричных d-d полос, которые предоставляют ценную информацию о классификации лигандов, геометрии металлов и кажущемся сродстве связывания^18,19. Для этих комплексов прямое титрование ионов металлов в белковые или пептидные растворы может количественно определять стехиометрию связывания и кажущееся сродство связывания. В некоторых случаях, таких как d⁵ или d¹⁰ электронных конфигураций, комплекс не поглощает свет (т. е. спектроскопически бесшумен). В этих спектроскопически бесшумных комплексах переходных металлов эти ограничения можно обойти, используя конкурирующий лиганд, который при координации с ионом металла дает обнаруживаемые полосы переноса заряда. В любом случае этот подход ограничен количественной оценкой только стехиометрии и кажущегося сродства связывания, и никакое понимание энтальпии связывания не дается без приближений.

Дополняя информацию, полученную с помощью электронной абсорбционной спектроскопии, ITC является привлекательным методом для прямой и строгой количественной оценки энтальпии^{связывания 20}. ITC непосредственно измеряет тепло, выделяемое или потребляемое во время события связывания, и, поскольку титрование происходит при постоянном давлении, измеренное тепло является энтальпией всех равновесий (ΔH_ITC). Кроме того, количественно определяется стехиометрия события связывания (n) и кажущееся сродство связывания (K_ITC). Из этих параметров определяют свободную энергию (ΔG_ITC) и энтропию (ΔS_ITC), обеспечивая термодинамический снимок события связывания. Поскольку ITC не полагается на поглощение света, он является идеальным методом для спектроскопически бесшумных видов, например, d⁵ или d¹⁰ комплексов ионов металлов. Однако, поскольку калориметрия измеряет теплоту, любые непревзойденные буферные системы и неучтенные равновесия могут отрицательно повлиять на анализ для точного определения термодинамики связывания ионов металлов, и необходимо проявлять большую осторожность для устранения этих факторов²⁰. При выполнении с соответствующей строгостью ITC является надежным методом определения термодинамики металл-белково-пептидных комплексов.

Здесь хромофорически тихий медь-связывающий пептид, С-пептид, используется для демонстрации взаимодополняющего использования двух методов. С-пептид представляет собой продукт расщепления 31 остатка (EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLGSL), образующийся при созревании инсулина; он не имеет хромофорных остатков, но было показано, что он связывает Cu(II) с физиологически значимым сродством^14,15. Сайт связывания Cu(II) состоит из боковых цепей глутамата и аспартата, а также N-конца пептида^14,15. Эти координирующие атомы очень похожи на атомы многих обычно используемых буферных систем. Здесь показано тандемное использование d-d и полос переноса заряда в электронной абсорбционной спектроскопии и ITC в количественной оценке термодинамики связывания Cu(II) с С-пептидом. Подход, основанный на изучении связывания Cu(II) с С-пептидом, может быть применен к другим ионам металлов и белково-пептидным системам.

Протокол

1. Электронная абсорбционная спектроскопия: прямое титрование с буферной конкуренцией

1. Пробоподготовка
   1. Готовят буферный раствор 50 мМ 2-[бис(2-гидроксиэтил)амино]-2-(гидроксиметил)пропан-1,3-диол (бисТрис) при рН 7,4 с использованием сверхчистой воды (сопротивление >18 МОм). Удаляют следы ионов металлов путем инкубации с высокоаффинной смолой в течение не менее 2 ч с последующей фильтрацией.
   2. Растворите или разбавьте известное количество пептида в безметалловом буфере.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При мониторинге d-d диапазонов с малыми коэффициентами вымирания²¹ необходимо использовать более высокие концентрации пептида. Здесь конечная концентрация С-пептида в буферном растворе составляла 300 мкМ (объем зависит от размера кюветы). С-пептид был синтезирован твердофазным синтезом пептидов и подробно описан в другом месте в литературе¹⁴.
   3. Растворите известную массу CuCl₂ в сверхчистой воде, чтобы получить раствор при 10-15 мМ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно изначально растворить соль металла в небуферизованной воде, чтобы предотвратить осаждение. Другие соли Cu(II) могут быть использованы, но необходимо позаботиться о том, чтобы анион слабо координировался.
2. Запуск эксперимента
   1. Включите электронный абсорбционный спектрофотометр и дайте ему прогреться в течение ~ 15-20 минут перед использованием. Запустите программное обеспечение спектрофотометра и настройте такие параметры, как диапазон сканирования (200-900 нм), скорость сканирования (200 нм / с) и двойной луч с коррекцией базовой линии (дополнительные параметры перечислены в дополнительном файле).
   2. Соберите базовую линию без кювет или образцов на путях луча.
   3. Используя две совпадающие кюветы в двухлучевом спектрофотометре, загрузите одну кювету 115 мкл сверхчистой воды, а другую кювету 115 мкл пептидного образца. Убедитесь, что в кюветах нет пузырьков воздуха, так как они будут мешать сигналу.
   4. Поместите кювету со сверхчистой водой в опорный пучок и кювету с пептидом в пучок образца.
   5. Соберите спектр поглощения безметаллового (апо) пептида.
   6. Добавьте субстехиометрическое количество (0,5 эквивалента, 150 мкМ) раствора Cu(II) в кювету с образцом пептида. Убедитесь, что объем добавленного Cu(II) составляет менее 3 мкл, и запишите объем для анализа позже.
   7. Осторожно пипетку вверх и вниз, чтобы перемешать раствор, избегая образования пузырьков воздуха. Дайте раствору вступить в реакцию и уравновеситься в течение 5 мин и зафиксируйте спектр поглощения.
   8. Повторите добавление аликвот Cu(II), как на стадии 1.2.6, в пептидный раствор для следующих эквивалентов: 1,0, 1,5, 2,0, 3,0 и 5,0 (или в общей сложности 300, 450, 600, 900 и 1 500 мкМ). Обязательно запишите общий объем добавленного Cu(II) и общий объем кюветы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если требуется большее разрешение, уменьшите интервал между эквивалентами.
   9. Извлеките образец кюветы и тщательно очистите в соответствии с указаниями производителя.
   10. Добавьте буферизованный раствор без пептида и запишите спектр абсорбции. Повторите добавление аликвот Cu(II), как показано на этапах 1.2.5-1.2.8, регистрируя спектр поглощения для каждого эквивалента Cu(II).
   11. Экспортируйте все спектры в виде csv-файлов для обработки. Тщательно очистите кюветы в соответствии с инструкциями производителя и выключите спектрофотометр.
3. Обработка данных
   1. Загрузите все спектры в программу для работы с электронными таблицами.
   2. Вычтите только буферный (0 мкМ Cu(II)) спектр из любого другого спектра, чтобы удалить любые особенности поглощения из самого буфера.
   3. Нормализовать каждый спектр с учетом разбавления в результате добавления раствора Cu(II) (этап 1.2.6). См. Дополнительный файл, Eq (1)¹⁴ для примера нормализации, где v_initial - объем (115 мкл) пептида, добавленного в кювету, v_Cu(II) - объем раствора Cu(II), добавленный на шаге 1.2.6, а_{abs buffer вычитаемый спектр} - данные, полученные на шаге 1.2.7.
   4. График всех спектров вместе, чтобы определить области изменения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Типичные d-d диапазоны от комплексов Cu(II) варьируются от 500 до 750 нм. Это спектрофотометрическое титрование может быть сложным из-за малого коэффициента вымирания от d-d диапазонов, которые являются запрещенными Переходами Лапорта в октаэдрической геометрии²¹. Если абсорбция слишком слабая, альтернативным подходом является использование хромофорных лигандов, которые приводят к полосам переноса заряда при связывании с Cu(II) (см. раздел 2).

2. Электронная абсорбционная спектроскопия: пептидная конкуренция с хромофорным лигандом

1. Пробоподготовка
   1. Растворите 1,10-фенантролин (фен) в сверхчистой воде для получения конечной концентрации ~1 мМ.
   2. В дополнение к пробоподготовке, описанной в разделе 1.1 для пептида (стадия 1.1.2) и Cu(II) (стадия 1.1.3), готовят раствор фена 10 мкМ Cu(II) и 40 мкМ фена в буфере ([Cu(фен)₃]²⁺). Убедитесь, что объем заполняет кювету.
2. Запуск эксперимента
   1. Запустите электронный абсорбционный спектрофотометр, как в шагах 1.2.1 и 1.2.2, но установите диапазон сканирования на 200-400 нм.
   2. В двух подобранных кюветах загрузите одну кювету 115 мкл сверхчистой воды, а другую кювету 115 мкл раствора [Cu(phen)₃]²⁺ . Поместите кювету с водой в опорный пучок, а кювету с раствором [Cu(phen)₃]²⁺ в пучок образца.
   3. Соберите спектр поглощения металло-лигандного комплекса.
   4. Добавьте стехиометрическое количество (эквивалент ≈1, ≈10 мкМ) пептида в раствор [Cu(phen)₃]²⁺ . Осторожно пипетку вверх и вниз, чтобы тщательно перемешать, но будьте осторожны, чтобы не вводить пузырьки воздуха. Запишите объем добавленного пептида для будущего анализа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используя кюветы, которые содержат 115 мкл, добавление 3,83 мкл пептида 300 мкМ дает конечную концентрацию пептида 9,7 мкМ.
   5. Инкубировать раствор в течение 5 мин до достижения равновесия. Запишите спектр поглощения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если сродство связывания металл-пептид и металл-лиганд схоже, концентрация добавленного пептида должна быть в большом избытке. Обязательно учитывайте общий объем пептида, добавленного для нормализации.
   6. Повторите добавление пептидных аликвот в раствор [Cu(phen)₃]²⁺ для следующих приблизительных эквивалентов: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 22 и 26. Запишите объем добавленного пептида, чтобы можно было определить разбавленную концентрацию.
   7. Извлеките образец и тщательно очистите кювету в соответствии с инструкциями производителя. Соберите спектр буфера. Соберите спектр пептида 50 мкМ в буфере.
   8. Экспортируйте все данные в виде csv-файлов для обработки и очистки кювет в соответствии с инструкциями производителя.
3. Обработка данных
   1. Загрузите спектры в программу для работы с электронными таблицами и вычтите буферный спектр из других спектров.
   2. Нормализуйте спектры в соответствии с Дополнительным файлом, Eq (2)¹⁴.
   3. Используя коэффициент вымирания для [Cu(phen)₃]²⁺ при 265 нм (ε_max = 90 000 ^{M-1 см-1})²², определяют концентрацию [Cu(фен)₃]²⁺ при каждом добавлении пептида.
   4. Для каждого добавления пептида определяют концентрацию Cu(II)-пептидного комплекса путем вычитания оставшейся концентрации [Cu(фен)₃]²⁺, как определено на этапе 2.3.2, из начальной концентрации [Cu(фен)₃]²⁺ (при 0 мкМ пептида).
   5. Рассчитайте концентрацию свободного фен-лиганда по уравнению в дополнительном файле, Eq (3)¹⁴.
   6. Рассчитайте концентрацию свободного пептида с помощью дополнительного файла, Eq (4)¹⁴, где [пептид]_запас представляет собой неразбавленный пептид, титрованный в кювету, V₁ представляет объем добавленного исходного пептида, V₂ - общий объем кюветы, а [Cu²⁺-пептид] определяется на этапе 2.3.4.
   7. Вычислите экспериментальное сродство связывания (K_ex), используя Eq (5) в дополнительном файле²³.
   8. Соотнесите константу диссоциации Cu(II)-пептида с K_ex по Eq (6)²³ в дополнительном файле, где K_{d,Cu(II)-фен} = 1,0 × 10-9 (см. ²²). Определите среднее и стандартное отклонение от всех определяемых констант диссоциации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При соотношении 4:1 фен:Cu(II), [Cu(фен)₃]²⁺, [Cu(фен)₂]²⁺ и [Cu(фен)]²⁺ существуют в растворе, и пептид будет хелатировать Cu(II) от вида ([Cu(phen)]²⁺) с самым слабым связыванием²².

3. Изотермическая титрующая калориметрия

1. Пробоподготовка
   1. Готовят буферный раствор 15 мМ 3-морфолинопропан-1-сульфоновой кислоты (МОПС) при рН 7,4 с использованием сверхчистой воды (сопротивление >18 МОм). Удаляют следовые ионы металлов путем инкубации с высокоаффинной смолой в течение не менее 2 ч с последующей вакуумной фильтрацией через мембрану с крышкой бутылки 0,45 мкм.
   2. Растворить известную массу_CuCl2 в сверхчистой воде для приготовления раствора ≈50-100 мМ. Разбавьте этот раствор Cu(II) в буфер для получения раствора 1,0 мл с конечной концентрацией 1,4 мМ Cu(II). Запишите точный объем используемого раствора CuCl₂ .
   3. Растворите или разбавьте раствор пептида в буфере, чтобы получить 450 мкл 154 мкМ пептидного раствора. Убедитесь, что в пептидный раствор добавлена та же пропорция дополнительной сверхчистой воды из стадии 3.1.2, что уменьшит теплоту разбавления и увеличит сигнал-шум.
   4. После подготовки образцов убедитесь, что растворы имеют одинаковый рН и, при необходимости, соответствующим образом отрегулируйте.
   5. Дополнительный шаг: Дегазируйте решения для минимизации микропузырьков, загружаемых в ITC.
2. Запуск эксперимента
   1. Включите ITC. Запустите программное обеспечение ITC для запуска инструмента. Дождитесь первой инициализации, которая попросит вернуть бурет; затем следуйте инструкциям на экране.
   2. Снимите крышку со ссылочной ячейки. Удалите любую воду из эталонной ячейки и трижды промойте 450 мкл дегазированной сверхчистой воды.
   3. Медленно вытягивайте сверхчистую воду до отметки 450 мкл загрузочного шприца, следя за тем, чтобы в шприц не вносились пузырьки воздуха. Вставьте нагрузочный шприц в эталонную ячейку до тех пор, пока он не ≈1 мм от дна, и медленно впрыскивайте часть раствора до тех пор, пока в загрузочном шприце не останется 150 мкл. Быстро перемещайте плунжер загрузочного шприца вверх и вниз на ≈25 мкл несколько раз, чтобы выбить любые пузырьки на поверхности ячейки. Медленно впрыскивайте до тех пор, пока плунжер не достигнет отметки 100 мкл на загрузочном шприце, тем самым дозируя в общей сложности 350 мкл сверхчистой воды в эталонную ячейку, и замените крышку эталонного элемента.
   4. Удалите любой остаточный раствор из ячейки образца и нагрузите 450 мкл этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) 10 мМ с помощью загрузочного шприца. Замочите в течение 10 минут, чтобы убедиться, что следы металлов удаляются, потому что ЭДТА будет связывать следовые металлы.
   5. Удалите раствор ЭДТА (со связанными следовыми ионами металлов) и тщательно промойте загрузочный шприц обильным количеством сверхчистой воды.
   6. Очистите ITC в соответствии с указаниями производителя, промыв ячейку образца сверхчистой водой.
   7. Обусловите образец ячейки путем промывки 450 мкл буфера по меньшей мере три раза.
   8. Удалите буфер, который обусловливает ячейку образца. Загрузите пептидный раствор в пробную ячейку с помощью загрузочного шприца (выполните шаг 3.2.3).
   9. Промыть шприц титрования 200 мкл буферного раствора. Для этого снимите поршень и используйте микропипетку, чтобы пипетку буфера через отверстие в верхней части стеклянного титрационного шприца, через шприц и наружу иглу внизу.
   10. Полностью вставьте плунжер в шприц титрования.
   11. Опустите наконечник иглы шприца титрования в металлический раствор и медленно потяните плунжер вверх, в результате чего металлический раствор заполнит шприц и приведет к образованию пустотного объема в верхней части стеклянной части титрующего шприца. Удалите большую часть объема пустоты, повернув шприц титрования параллельно полу, снимите поршень и слегка наклоните стеклянную часть к полу. Мягко встряхните шприц титрования, чтобы раствор переместился к концу стеклянной части шприца титрования и заполнил большую часть объема пустоты, но убедитесь, что осталось 2-3 мкл пустого объема. Удерживая шприц параллельно полу, снова вставьте плунжер.
   12. Держите шприц титрования в вертикальном положении, окуните кончик иглы обратно в металлический раствор и толкайте плунжер вниз, пока воздух не перестанет выходить из иглы. Загрузите шприц титрования, медленно подтягивая плунжер чуть выше отметки 50 мкл, сохраняя кончик иглы в растворе.
   13. Осторожно вставьте стеклянную часть шприца титрования в бурет и завинтите до укутания пальца. Когда небольшое количество раствора выйдет из титрующего шприца из-за сжатия плунжера, используйте легкий тонкий стеклоочиститель, чтобы тщательно впитать раствор, не касаясь кончика иглы.
   14. Вставьте бурет со шприцем титрования в ячейку образца и надежно закрепите его.
   15. Настройте параметры в программном обеспечении ITC. Начиная с приборного управления, установите скорость перемешивания (типичная скорость перемешивания колеблется от 150 до 350 об/мин) и температуру , при которой будет проводиться эксперимент (обычно 25 °C). Введите концентрации шприца и клеток в миллимолярных единицах в разделе Подробности эксперимента.
   16. В разделе Метод эксперимента выберите Добавочное титрование. Нажмите «Настройка» и укажите 20 инъекций по 2,5 мкл. Если для наблюдения за событием связывания требуется большее разрешение, увеличьте количество инъекций и уменьшите объем за инъекцию. Введите временной интервал между каждой инъекцией, чтобы он был достаточно длинным, чтобы сигнал уравновешивался и возвращался к базовому уровню, обычно 300 с.
   17. Нажмите кнопку выполнить , чтобы начать эксперимент и указать, где хранятся данные.
   18. По завершении эксперимента очистите образец ячейки и шприц титрования.
   19. Выполняйте все эксперименты как минимум в трех экземплярах, чтобы обеспечить точный сбор данных.
   20. Проведите контрольный эксперимент, в котором металлический раствор титруется в буферный раствор (в отсутствие пептида), чтобы теплота разбавления от иона металла была небольшой и чтобы не было неучтенных равновесий. Если теплота разбавления велика, рассмотрите другую буферную систему, если это возможно.
3. Обработка данных
   1. Запустите программное обеспечение для анализа ITC и загрузите файл данных для анализа.
   2. Перейдите на вкладку Базовые показатели и проверьте термограмму. Обратите внимание на любое экзогенное тепло, выделенное или поглощенное пузырьками воздуха или другими артефактами в термограмме. Ищите шипы, которые не связаны с впрыском металлического раствора.
   3. Убедитесь, что базовый уровень, сгенерированный аналитическим программным обеспечением, следует за частью данных после внедрения и уравновешивания. Если он отклоняется, используйте базовые опорные точки для корректировки базового уровня. Убедитесь, что области интеграции включают пик, полученный в результате впрыска металла, но закрывают любые пузырьки воздуха или артефакты в термограмме, обнаруженные на этапе 2. Вычтите базовую линию из термограммы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот тип манипуляции рекомендуется только после сбора нескольких термограмм, чтобы экспериментатор знал, что является реальными данными, а что артефактом, поскольку корректировка базового уровня и областей интеграции может резко повлиять на данные.
   4. Перейдите в окно Моделирование , чтобы начать подгонку данных, где программное обеспечение для анализа будет отображать интегрированные и нормализованные данные концентрации для каждой инъекции.
   5. Щелкните левой кнопкой мыши на данные первой инъекции, чтобы удалить ее из алгоритма подгонки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это распространено, поскольку будет незначительное смешивание между титрантом и раствором образца клеток, что приведет к неточному молярному дозированию первой инъекции.
   6. В разделе Модели выберите Пустой (постоянный) в раскрывающемся меню Стиль, которое основано на конечной энтальпии инъекции и будет вычитаться из каждой точки данных с учетом теплоты разбавления. Кроме того, выберите Независимая (или лучшая модель для системы) во втором раскрывающемся меню Стиль , чтобы соответствовать данным.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для стандартных взаимодействий связывания 1:1 наиболее распространенной моделью является независимая.
   7. Подберите данные с помощью двух моделей, нажав зеленую кнопку воспроизведения с Σ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Другим программным обеспечением для обработки данных ЦМТ является SEDPHAT²⁴.
   8. Учитывайте все конкурирующие равновесия в пост-специальном анализе, о котором ранее сообщали Grossoehme et al. ^20.

Результаты

Цель состояла в том, чтобы количественно оценить и подтвердить термодинамику связывания Cu(II) с С-пептидом с использованием дополнительных методов электронной абсорбционной спектроскопии и ITC. Из-за надежного характера электронной абсорбционной спектроскопии было выполнено прямое титрование Cu(II) в 300 мкМ C-пептид (рисунок 1). Добавление 150 мкМ Cu(II) вызвало немедленное увеличение диапазона на 600 нм, приписываемое d-d диапазону Cu(II), и продолжало увеличиваться до тех пор, пока не бы...

Обсуждение

В этой статье представлен надежный метод количественной оценки сродства и термодинамики связывания Cu(II) с пептидами. Комплексы с Cu(II) идеально подходят для мониторинга полосы поглощения d-d на металлическом участке из-за его электронной конфигурации d⁹ . Хотя коэффициент вымирания невелик, что требует больших концентраций комплекса для получения надежного сигнала, титрование Cu(II) в пептид может быстро дать представление о стехиометрии связывания и приблизительном сродстве связывания. Тем не менее, может ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
1,10-фенантролин	Sigma Aldrich	131377-25G
bis-Tris буфер	Fisher	BP301-100
Bottle-top 0,45 мкм мембрана	Nalgene	296-4545	Приемлема любая система фильтрации, которая удаляет смолу без внесения загрязняющих веществ
Хлорид меди(II)	Alfa Aesar	12458
EDTA	Sigma Aldrich	EDS-500G
Электронный абсорбционный спектрофотометр	Varian	Cary 5000	Другой подходящий чувствительный спектрофотометр приемлемый
высокоаффинный смола	Sigma Aldrich	C7901-25G
Изотермический титрованный калориметр (ITC)	TA Instruments	Nano ITC Малообъемный
ITC анализ программного обеспечения	TA Instruments	NanoAnalyze	SEDPHAT (Methods. 2015, 76: 137– 148) также может быть использовано
программное обеспечение ITC	TA Instruments	ITCRun
легкий тонкий дворник	Kimwipe	34155
загрузочный шприц	Hamilton	Syr 500 uL, 1750 TLL-SAL
согласованные кюветы	Starna Cells, Inc	16.100-Q-10/Z20	Убедитесь, что окно для кюветы малого объема совпадает с высотой луча спектрофотометра
MOPS буфер	Alfa Aesar A12914
спектрофотометр программное обеспечение	Cary	WinUV Scan
программа для работы электронных таблиц	Microsoft	Excel	Любая подходящая программа для работы с электронными таблицами будет работать
шприц для титрования	TA Instruments	5346
сверхчистая вода	Millipore Sigma	Milli-Q	Любая вода в порядке, пока >18 MΩ сопротивление