Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Создание органоидов из человеческих зубов в качестве мощного инструмента для механистических исследований и регенеративной терапии

4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/63671

⸱

13 апреля 2022 г.

 ,  ,  , 
1Laboratory of Tissue Plasticity in Health and Disease, Cluster of Stem Cell and Developmental Biology, Department of Development and Regeneration, Leuven Stem Cell Institute, KU Leuven (University of Leuven), 2Biomedical Research Institute (BIOMED), UHasselt, Hasselt University

В этой статье

Краткое содержание

Представлен протокол развития эпителиальных органоидных культур, начиная с зубов человека. Органоиды надежно расширяются и рекапитулируют эпителиальные стволовые клетки зуба, включая их способность дифференцировать амелобласты. Уникальная органоидная модель предоставляет многообещающий инструмент для изучения биологии зубов человека (стволовых клеток) с перспективами для зубо-регенеративных подходов.

Аннотация

Зубы имеют ключевое значение в жизни не только для жевания пищи и речи, но и для психологического благополучия. Знаний о развитии зубов человека и биологии мало. В частности, мало что известно об эпителиальных стволовых клетках зуба и их функции. Нам удалось разработать новую органоидную модель, начиная с ткани человеческого зуба (то есть зубного фолликула, выделенного из удаленных зубов мудрости). Органоиды надежно и в долгосрочной перспективе расширяются и повторяют предложенный компартмент эпителиальных стволовых клеток человеческого зуба с точки зрения экспрессии маркеров, а также функциональной активности. В частности, органоиды способны разворачивать процесс дифференцировки амелобласта, происходящий in vivo во время амелогенеза. Эта уникальная органоидная модель предоставит мощный инструмент для изучения не только развития зубов человека, но и стоматологической патологии, и может проложить путь к регенеративной терапии зубов. Замена потерянных зубов биологическим зубом, основанным на этой новой органоидной модели, может стать привлекательной альтернативой нынешней стандартной имплантации синтетических материалов.

Введение

Зубы играют важную роль в жевании пищи, речи и психологическом благополучии (самооценке). Зуб человека состоит из высокоминерализованных тканей различной плотности и твердости1. Зубная эмаль, основной компонент коронки зуба, является самой высокой минерализованной тканью в организме человека. Во время образования эмали (амелогенеза), когда развиваются зубы, зубные эпителиальные стволовые клетки (DESC) дифференцируются в эмалообразующие клетки (амелобласты). После образования эмаль редко восстанавливается или обновляется из-за апоптотической потери амелобластов в начале прорезывания зуба1. Восстановление поврежденной ткани эмали, вызванной травмой или бактериальным заболеванием, в настоящее время осуществляется с использованием синтетических материалов; тем не менее, они обеспокоены важными недостатками, такими как микроразрыв, нижняя остеоинтеграция и крепление, конечная продолжительность жизни и отсутствие полностью функционального ремонта2. Следовательно, прочная и надежная культура человеческих DESC, обладающих способностью генерировать амелобласты и потенциалом для производства минерализованной ткани, станет важным шагом вперед в области регенеративной области зубов.

Знания о фенотипе DESC человека и биологической функции скудны 3,4,5. Интересно, что DESC человеческих зубов были предложены для существования в остатках эпителиальных клеток Малассеза (ERM), клеточных кластерах, присутствующих в зубном фолликуле (DF), который окружает неразъединенные зубы и остается присутствующим в периодонтальной связке вокруг корня после прорезывания зуба1. Было обнаружено, что клетки ERM, культивируемые совместно с пульпой зуба, дифференцируются в амелобластоподобные клетки и генерируют эмалеобразную ткань6. Однако глубокие исследования специфической роли ERM-клеток в генерации эмали (re-) были ограничены из-за отсутствия надежных моделей исследования7. Современные системы культивирования ERM in vitro затруднены ограниченной продолжительностью жизни и быстрой потерей фенотипа в 2D-условиях, стандартно используемых 8,9,10,11,12. Следовательно, крайне необходима разрешимая система in vitro для добросовестного расширения, изучения и дифференциации человеческих DESC.

В течение последнего десятилетия мощная техника выращивания эпителиальных стволовых клеток in vitro была успешно применена к нескольким типам (человеческих) эпителиальных тканей для изучения их биологии, а также заболеваний 13,14,15,16. Эта технология позволяет тканевым эпителиальным стволовым клеткам самостоятельно развиваться в 3D-клеточные конструкции (то есть органоиды) при посеве во внеклеточный матрикс (ECM), имитирующий каркас (обычно Matrigel), и культивируемый в определенной среде, реплицирующей нишу стволовых клеток ткани, сигнализирующую и / или эмбриогенез. Типичные факторы роста, необходимые для развития органоидов, включают эпидермальный фактор роста (EGF) и активаторы сайта интеграции MMTV бескрылого типа (WNT) 14,15,16. Полученные органоиды характеризуются длительной точностью в имитации оригинальных эпителиальных стволовых клеток ткани, а также высокой расширяемостью при сохранении их фенотипа и функциональных свойств, тем самым преодолевая часто ограниченную первичную доступность тканей человека, приобретенную в клинике. Для установления органоидов выделение эпителиальных стволовых клеток из гетерогенной ткани (т.е. содержащей другие типы клеток, таких как мезенхимальные клетки) до культивирования не требуется, поскольку мезенхимальные клетки не прикрепляются или не процветают в ECM, что в конечном итоге приводит к чисто эпителиальным органоидам 13,16,17,18,19 . Эта многообещающая и универсальная технология привела к разработке многообразных органоидных моделей из различных эпителиальных тканей человека. Однако органоиды человеческого происхождения, ценные для глубокого изучения развития, регенерации и заболеваний зубов, еще не были установлены20,21. Недавно нам удалось разработать такую новую органоидную модель, начиная с DF-ткани из третьих моляров (зубов мудрости), удаленных у пациентов подросткового возраста19.

Здесь мы описываем протокол развития эпителиальных органоидных культур из взрослого человеческого зуба (т.е. из DF третьих моляров) (рисунок 1A). Результирующие органоиды экспрессируют ERM-ассоциированные маркеры стволовости, будучи при этом долгосрочными расширяемыми. Интересно, что в отличие от большинства других органоидных моделей, обычно необходимый EGF является избыточным для устойчивого развития и роста органоидов. Интересно, что органоиды ствола проявляют свойства дифференцировки амелобласта, тем самым имитируя особенности и процессы ERM/DESC, происходящие in vivo. Новая и уникальная органоидная модель, описанная здесь, позволяет исследовать биологию, пластичность и дифференциацию DESC и открывает двери для первых шагов к зубо-регенеративным подходам.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все методы, описанные здесь, были одобрены Комитетом по этике исследований UZ/KU Leuven (13/0104U). Удаленные третьи моляры (зубы мудрости) были получены после информированного согласия пациентов.

1. Препараты

  1. Предварительно прогреть 48-луночную культуральную пластину в течение 15-20 ч в 1,9% CO2 инкубаторе при 37 °C.
  2. Сжижение аликвоты Матригеля (снижение фактора роста; фенол не содержит красного цвета; далее называется базальной мембранной матрицей; BMM) на льду (4°C) в течение как минимум 2 ч до этапа 2.1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте циклов замораживания/оттаивания BMM. Разжижают БММ в течение 15-20 ч на льду и аликвоте по 1 мл в микроцентрифужных пробирках и хранят при -20 °C.
  3. Охладите центрифугу до 4 °C.
  4. Подготовьте среду и процедите раствор через фильтр 0,22 мкм. Следующие тома основаны на коллекции DF из всех четырех третьих моляров, обычно извлекаемых одновременно.
    1. Готовят 20 мл коллекционной среды DF (таблица 1): минимально необходимую среднюю орлиную (αMEM), содержащую 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 0,5% амфотерицина B и 1% пенициллина-стрептомицина. Переложите 4 мл среды сбора DF в трубку объемом 15 мл и переложите трубки на лед.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Одной пробирки объемом 15 мл на одного пациента достаточно для отбора проб (т.е. для четырех третей моляров).
    2. Сделать 20 мл зубной органоидной среды (далее именуемой ТОМ; Таблица 2) с использованием безымянной определенной среды (SFDM; Таблица 3). Храните TOM при температуре 4 °C в течение максимум 2 недель.
    3. Готовят 8 мл диссоциационной среды (таблица 4), т.е. фосфат-буферного физиологического раствора (PBS), содержащего коллагеназу VI (3 мг/мл) и диспазу II (4 мг/мл). Предварительно согрейте диссоциационную среду на водяной бане с температурой 37 °C в течение не менее 10 минут перед использованием и перенесите ее в две трубки по 15 мл (4 мл на трубку) для диссоциации четырех тканей DF.
    4. Подготовьте промывочную плиту (12 скважин), содержащую: три скважины с 70% EtOH, три скважины с PBS и три скважины со средой сбора DF.
    5. Сделать 15 мл среды А на образец (т.е. 5 мл на два ФД на пациента; Таблица 5).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие действия следует выполнять в стерильных условиях.

2. Диссоциация зубных фолликулов

  1. После того, как третьи коренные зубы с ассоциированными ДФ собраны в среде сбора (на льду), перенесите содержимое трубок в чашку Петри.
  2. Удерживайте зуб пинцетом и тщательно изолируйте ДФ с помощью хирургического лезвия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг требует практики; будьте осторожны с лезвием.
  3. Чтобы смыть оставшуюся кровь с DF, поместите DF-ткани ненадолго в первую лунку 70% EtOH (моющая пластина) на 20 с, а затем перенесите в следующую скважину EtOH на 20 с, а далее в третью лунку EtOH (максимум 1 мин в 70% EtOH в общей сложности; более длительное время инкубации приведет к снижению жизнеспособности клеток).
  4. Затем продолжайте промывку в трех скважинах PBS (максимум 2 мин в общей сложности).
  5. Промывайте ДФ в трех оставшихся скважинах для сбора DF (максимум до 20 мин в общей сложности).
  6. Переложите промытые TF на новую чашку Петри.
  7. Вырежьте небольшой кусочек одного из DF (~5 мм2) для фиксации параформальдегида (PFA) (см. раздел 7) и храните его на льду (максимум 6 ч) в микроцентрифужной трубке, содержащей 500 мкл среды сбора DF до фиксации PFA.
  8. Измельчите остальные TF небольшими кусочками (~1 мм2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется немедленно обрабатывать свежеизолированные ткани DF для оптимального органоидного образования и эффективности роста, а не начинать с криоконсервированной ткани, что приводит к снижению эффективности. Тем не менее, на этом этапе можно криоконсервировать первичную ткань DF (см. криоконсервационную среду и протокол в разделе 5).
  9. Переложить измельченные ДФ в пробирку объемом 15 мл, содержащую 4 мл предварительной диссоциационной среды, и высиживать на водяной бане 37 °C в течение 2 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте два ДФ на 4 мл предварительной диссоциационной среды (одна трубка) для обеспечения оптимальной диссоциации.
  10. Каждые 15 минут пипетируйте DF-диссоциационную среду, смешивая вверх и вниз, используя стеклянную пипетку Пастера, чтобы ускорить распад тканей. Когда куски DF больше не наблюдаются (обычно через 1 ч), продолжайте диссоциацию DF с использованием суженной огнеполированной пипетки Пастера.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для оптимальной диссоциации DF переключитесь на пипетку Пастера, суженную огнеупорной полировкой, не позднее 1 ч изоляции DF.
    1. Тем временем готовят 10 мл среды А, содержащей 50 мкл ДНКазы (0,2 мг/мл; Таблица 5).
  11. Добавляют 5 мл среды А (содержащей ДНКазу) в каждую пробирку с диссоциированным ДФ и инкубируют в течение 1 мин при комнатной температуре (RT).
  12. Фильтруйте клеточную суспензию (содержащую одиночные клетки и мелкоклеточные сгустки) через клеточный сетчатый фильтр 40 мкм, чтобы удалить оставшиеся крупные фрагменты и (большую часть) фиброзную ткань.
    1. Объедините несколько трубок с диссоциированным DF у одного пациента на этом этапе.
  13. Промыть фильтр 1 мл среды А. Центрифугировать фильтрованную клеточную суспензию при 200 х г в течение 10 мин при 4 °С.
  14. Удалите супернатант, повторно суспендируйте гранулу в 1 мл SFDM (таблица 3) и перенесите клеточную суспензию в микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл.
  15. Рассчитайте концентрацию ячеек с помощью автоматического счетчика ячеек. Пренебрегайте клеточными сгустками, которые остаются.
  16. Центрифуга при 200 х г в течение 5 мин при 4 °C.

3. Создание органоидной культуры зубов (рисунок 1А и рисунок 2А)

  1. Исходя из полученного номера ячейки, рассчитайте количество лунок, которые можно засеять. Одна капля 20 мкл должна содержать 20 000 клеток. Конечная смесь состоит из клеточной суспензии и BMM в соотношении 30:70.
  2. Удалите соответствующее количество супернатанта и повторно суспендируйте в ледяном BMM для получения соотношения 70:30 BMM: клеточная суспензия для покрытия. Например, при получении 200 000 клеток пластинчатая 10 капель по 20 мкл. Таким образом, удаляют супернатант до тех пор, пока не останется 60 мкл клеточной суспензии, добавляют 140 мкл ледяного BMM и повторно суспендируют.
    1. Медленно восстанавливайте, чтобы избежать образования пузырьков воздуха. После повторного суспендирования в BMM держите трубку микроцентрифуги на льду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сохранение трубки микроцентрифуги на льду имеет решающее значение для предотвращения затвердевания BMM.
  3. Пипетка капель БММ объемом 20 мкл в центре скважин предварительно нагретой 48-луночной культуральной пластины.
  4. Переверните пластину вверх дном, поместите ее в инкубатор с 1,9% CO2 (% CO2 в соответствии с буфером SFDM) и дайте ей затвердеть в течение не менее 20 минут при 37 °C.
  5. Добавьте ингибитор ROCK (RI; 10 мкМ) и амфотерицин B (0,1%) к TOM и предварительно разогрейте среду на водяной бане с температурой 37 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Амфотерицин B является светочувствительным.
  6. Возьмите 48-луночную пластину из инкубатора, поместите вертикально и добавьте 250 мкл подготовленной предварительно подготовленной среды в каждую лунку с каплями / клетками BMM и верните пластину в инкубатор 1,9% CO2 .
  7. Чтобы освежить среду (предпочтительно каждые 2-3 дня), наклоните 48-луночную пластину под углом 45°, осторожно удалите предыдущую среду, избегая прикосновения к капле BMM, и добавьте 250 мкл новой предварительно выровненной среды TOM.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется обновлять не реже трех раз в неделю, чтобы избежать истощения ключевых питательных веществ и факторов роста. RI необходимо добавлять к TOM только при первоначальном посеве и в первые дни каждого пассирования (см. раздел 4), чтобы предотвратить гибель клеток аноикисом и усилить рост органоидов. Амфотерицин B добавляют в среду только во время прохождения 0 (P0), чтобы блокировать возможное грибковое загрязнение.

4. Амплификация и прохождение органоидной культуры зубов (рисунок 1B и рисунок 2B)

  1. Прохождение органоидов между 10 и 14 днями культивирования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте культивирования в течение более длительного периода, так как длительная культура может ограничить отрастание и проходимость органоидов. Только при начальном развитии (Р0) органоиды можно культивировать до 20 суток в зависимости от скорости их роста (до достижения максимального ±200 мкм в диаметре).
  2. Удалите среду из колодцев с органоидами, которые необходимо пройти. В пределах одного условия культивирования объединяют до четырех сливающихся скважин (см. рис. 2С).
  3. Чтобы собрать органоиды, добавьте 400 мкл ледяного SFDM на лунку непосредственно на каплю BMM и многократно пипетируйте среду вверх и вниз, пока вся капля BMM не будет смещена.
    1. В случае, если скважины объединяются, перенесите 400 мкл из первой скважины в следующую (и так далее), чтобы вытеснить органоидсодержащие капли BMM всех скважин, которые необходимо объединить.
  4. Переместите смещенный BMM-органоидный узел в микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл и повторите шаг 4,3 еще раз, пока все органоидные структуры не будут собраны из скважин.
  5. Центрифуга при 200 х г в течение 5 мин при 4 °C.
  6. Предваренная аликвота TrypLE Express (дополненная RI при 5 мкМ) на водяной бане 37 °C. На микроцентрифужную трубку органоидов необходим объем 400 мкл TrypLE Express.
  7. После центрифугирования удаляют супернатант и повторно суспендируют гранулу в 400 мкл TrypLE. Инкубировать суспензию на водяной бане при температуре 37 °C в течение 12 мин.
  8. Добавьте 400 мкл ледяного SFDM для инактивации фермента и центрифуги при 200 х г в течение 5 мин при 4 °C. Удалите супернатант.
  9. Предварительно покройте наконечник (объем см. ниже) ледяным SFDM и повторно суспендируйте органоидную гранулу.
    1. Чтобы избежать потери органоидов, повторно используйте один и тот же (предварительно покрытый) наконечник как можно больше, не ставя под угрозу стерильность.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Объем SFDM, необходимый для повторного использования гранулы, зависит от количества полученных органоидных структур и текущего проходного числа.
    2. Как правило, для проходов от P0 до P2-3 (обычно все еще растет низкое количество органоидов) используется объем 200 мкл SFDM. Из проходов P3-4 или выше (обычно дающих большее количество органоидов) используют объем 700 мкл SFDM.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обе процедуры называются соответственно методами "низкого прохода" и "более высокого прохода" (см. шаги 4.10 и 4.11). Правильное применение различных методов имеет решающее значение для эффективного прохождения органоидов. При методе более высокого прохода органоиды легче теряются и не должны применяться к низкому количеству органоидов (т. Е. От P0 до P2-3). Тем не менее, метод более высокого прохода необходим для эффективной диссоциации большего количества органоидов.
  10. Метод с низким проходом: Повторное суспендирование гранулы в 200 мкл ледяного SFDM. Прижмите полностью опорожненный наконечник пипетки к нижней части трубки микроцентрифуги, чтобы уменьшить ее диаметр. Проверьте, достаточно ли мал диаметр (медленная аспирация, поток перекошен, но не заблокирован). Пипетка вверх и вниз в течение 5 мин, чтобы механически нарушить работу органоидов.
  11. Метод более высокого прохода: Повторное суспендирование гранулы в 700 мкл ледяного SFDM с наконечником P1000. Добавьте наконечник P200 (без фильтра) поверх этого наконечника P1000 и предварительно покройте ледяным SFDM. Предотвратите образование пузырьков воздуха, регулируя настройку объема пипетки, чтобы достичь не менее 90% объема среды (с органоидами). Пипетка вверх и вниз в течение 5 мин, чтобы механически нарушить работу органоидов.
  12. Проверьте под световым микроскопом (при 4-кратном увеличении), если в основном получаются одиночные клетки с (только) несколькими недисперсированными структурами.
  13. Добавьте 500 мкл ледяного SFDM в микроцентрифужную трубку и осторожно смешайте диссоциированную клеточную смесь со свежим SFDM путем пипетки.
  14. Дайте крупным недисперсированным структурам оседать в течение 10 мин, вертикально поместив трубку микроцентрифуги на лед.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо удалить недисперсные структуры, поскольку они негативно влияют на органоидную проходимость. Для инициации органоидов (P0) эта стадия осаждения не нужна.
  15. Соберите супернатант (~500-1000 мкл в зависимости от метода пассирования), содержащий одиночные ячейки и небольшие кластеры клеток; перевести в новую микроцентрифужную трубку и центрифугу при 190 х г в течение 10 мин при 4 °C.
  16. Рассчитайте концентрацию ячеек с помощью автоматического счетчика ячеек. Пренебрегайте клеточными сгустками, которые остаются.
  17. Подсчитайте, сколько скважин может быть засеяно, и рассчитайте соответствующее соотношение клеточной суспензии/BMM, как описано выше (раздел 3).
  18. Добавьте 70% BMM в гранулу ячейки и поддерживайте трубку микроцентрифуги на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Крайне важно держать трубку микроцентрифуги на льду, чтобы избежать затвердевания BMM.
  19. Перейдите к шагам с 3.3 по 3.7 и снова пройдите между 10-м и 14-м днем культуры.

5. Криоконсервация органоидов зубов

  1. Соберите и диссоциируйте органоиды, как упоминалось выше для пассажа (шаг 4). Центрифугируют клеточную суспензию при 200 х г в течение 5 мин при 4 °С.
  2. Откажитесь от супернатанта и повторно суспендируйте гранулу в 1 мл криоконсервационной среды, содержащей SFDM (70%), FBS (20%) и DMSO (10%).
  3. Переведите суспензию в криовиальную и положите ее на лед. Поместите криовиалы в криобокс и перенесите на -80 °C (не менее 4 ч).
  4. В течение 1 месяца переведите замороженные образцы в жидкий азот для длительного (>12 месяцев) хранения.

6. Оттаивание криоконсервированных зубных органоидов

  1. Перед началом процедуры оттаивания поместите одну трубку объемом 15 мл на криовиал на лед, содержащий 10 мл SFDM с 20% FBS.
  2. Извлеките криовиал из жидкого азота и положите его на лед.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните следующие шаги как можно быстрее и избегайте слишком длительного времени оттаивания (>5 мин), а также слишком длинных интервалов между шагами (>5 мин), так как такое продление снизит выживаемость клеток.
  3. Поместите криовиаль на ванну с теплой водой (37 °C) до размораживания (~1-2 мин).
  4. Немедленно перенесите содержимое криовиала в ледяную трубку объемом 15 мл и центрифугу при 200 х г в течение 5 мин при 4 °С.
  5. Удалить 9 мл супернатанта и центрифугировать оставшийся 1 мл при 200 х г в течение 5 мин при 4 °C. Удалите супернатант и промойте гранулу 1 мл ледяного SFDM.
  6. Перенесите суспензию ячейки в микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл и подсчитайте ячейки с помощью автоматизированного счетчика клеток.
  7. Подсчитайте, сколько скважин может быть засеяно, и рассчитайте соответствующее соотношение клеточной суспензии/BMM, как описано выше (раздел 3).
  8. Центрифуга при 200 х г в течение 5 мин при 4 °C. Повторно суспендировать гранулу в соотношении 70:30 BMM:TOM и держать на льду.
  9. Переходите к шагам с 3.3 по 3.7 и переходу между 10-м и 14-м днем культуры.

7. Фиксация и парафин-встраивание зубных органоидов

ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура (включая разделы 8 и 9) также может быть применена к первичной ткани DF.

  1. Фиксация органоидов зубов в PFA
    1. Удалите среду из каждой скважины, как на шаге 4.2.
    2. Соберите органоиды, вытеснив каплю BMM (шаг 4.3). Перенесите смесь BMM-органоидов в микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл.
    3. Центрифуга при 200 х г в течение 5 мин при 4 °C.
    4. Удалите супернатант и добавьте 500 мкл 4% PFA и инкубируйте в течение минимум 30 мин (максимум 1 ч) при RT с мягким перемешиванием на орбитальном шейкере.
      ВНИМАНИЕ: Используйте химическую вытяжку при работе с PFA.
    5. Центрифуга при 200 х г в течение 5 мин при 4 °C. Удалите супернатант и промойте органоидную гранулу PBS в течение 10 мин при RT с легким встряхиванием.
    6. Промыть органоидную гранулу (этап 7.1.5) дополнительно два раза. Раскрутите фиксированные органоиды вниз при 200 х г в течение 5 мин при 4 °C.
    7. Повторно суспендировать гранулы в 500 мкл 70% EtOH (в деионизированной воде). Хранить органоиды до 1 месяца в 70% EtOH при 4 °C.
  2. Агаро- и парафин-встраивание зубных органоидов
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для эффективного встраивания органоидов в парафин необходим дополнительный этап встраивания в агарозу.
    1. Центрифугировать PFA-фиксированные органоиды в 70% EtOH при 200 х г в течение 5 мин при 4 °C. Удалите супернатант.
    2. Приготовьте 2% раствор агарозы в 30 мл ПБС в стеклянном флаконе. Разогрейте смесь агароза-PBS в микроволновой печи до тех пор, пока не будет наблюдаться гелеобразная структура (примерно 2,5 мин при 600 Вт).
    3. Параллельно добавьте 30 мл PBS в другую стеклянную бутылку и разогрейте в микроволновой печи (примерно 2,5 мин при 600 Вт). Дайте раствору агарозы остыть в течение 1 мин.
    4. Вырежьте конец наконечника P200, чтобы обеспечить точную работу с раствором агарозы и избежать пузырьков воздуха.
    5. Предварите наконечник P200 в теплом PBS, несколько раз пипеткой вверх и вниз.
    6. Добавьте 150 мкл предварительно приготовленного раствора агарозы к органоидной грануле и осторожно пипетируйте органоидно-агарозную смесь (с минимальным повторным суспензией), избегая пузырьков воздуха.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Минимальное повторное суспендирование позволит лучше расположить органоиды в агарозном геле при сечении микротомов, поскольку органоиды тогда находятся ближе друг к другу.
    7. Немедленно перенесите органоидно-агарозную смесь в тот же колпачок микроцентрифуги, поместите трубку горизонтально и дайте агарозе затвердеть (~20 мин при RT). А пока маркируйте кассеты.
    8. После затвердевания удалите агарозный гель из колпачка микроцентрифуги с помощью пинцета и перенесите его на маркированную кассету.
    9. Переложите агарозсодержащую кассету в стакан, содержащий 50% EtOH в деионизированной воде. Накройте стакан парапленкой, чтобы избежать испарения EtOH.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Объем стакана зависит от количества кассет.
    10. Обработайте образцы в тканевом процессоре в течение ночи.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку парафин затвердевает при RT, следующие шаги должны быть выполнены быстро.
    11. Предварительно прогрейте нагревательный блок во встраиваемой рабочей станции в течение 15 мин.
    12. Извлеките органоид-содержащий агарозный гель, заключенный в кассету, и поместите его в предварительно расплавленный нагревательный блок. Снимите колпачок с кассеты и отложите его в сторону для последующего использования.
    13. Заполните оставшийся нагревательный блок парафином.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте пинцетом, находится ли органоидный агарозный гель в нижней части нагревательного блока. Из-за его легкого веса он может начать плавать, что приведет к потере образца.
    14. Поместите колпачок кассеты поверх нагревательного блока. Дайте ему затвердеть в течение 30 минут на холодной тарелке. Снимите нагревательный блок и храните парафиновые блоки при температуре 4 °C.

8. Микротомовое сечение и окрашивание органоидов зубов (Рисунок 2В и Рисунок 3А-С)

  1. Микротомовое сечение органоидсодержащих парафиновых блоков
    1. Срежьте 5 мкм участков органоидов зуба в парафиновых блоках с помощью микротома.
    2. Поместите ломтики парафина поверх стеклянного предметного стекла микроскопа. Поместите стеклянный слайд микроскопа на теплую пластину при 37 °C и накройте ее деионизированной водой с помощью пипетки Пастера.
    3. Дайте стеклу микроскопа высохнуть в течение ночи.
  2. Окрашивание органоидных участков зуба
    1. Депарафинизируйте органоидные участки (на стеклянном предметном стекле микроскопа) в духовке в течение 1 ч при 58 °C.
    2. Регидратируйте органоидные участки (на стеклянном предметном стекле микроскопа) в уменьшающемся ряду EtOH внутри химического капота в следующем порядке:
      Ксилол 2x по 3 мин каждый
      100% EtOH 2x по 3 мин каждый
      95% EtOH 2x в течение 3 мин каждый
      90% EtOH 2x по 3 мин каждый
      70% EtOH 3x по 3 мин каждый
      ВНИМАНИЕ: Используйте химическую вытяжку при работе с ксилолом.
    3. Промойте стеклянный предмет микроскопа в водопроводной воде в течение 5 минут при RT. Затем промойте его в PBS в течение 5 минут на RT.
    4. Выполните извлечение антигена, поместив органоидные участки (на стеклянном предметном стекле микроскопа) в предварительно расплавленный цитратный буфер (10 мМ лимонной кислоты в деионизированной воде с рН 6; в пластиковый контейнер; предварительно расплавленный в течение 10 мин на водяной бане 95 °C) в течение 30 мин на водяной бане 95 °C.
    5. Дайте стеклу микроскопа остыть в течение 20 мин при RT. Промойте стеклянный слайд микроскопа в PBS в течение 5 минут при RT, а затем в PBS, содержащем 0,1% Triton-X (PBT) в течение 5 минут при RT.
    6. Используйте маркировочную ручку, чтобы создать гидрофобный барьер на границах каждого слайда.
    7. Блокировать в течение минимум 1 ч при РТ в блокирующем буфере (содержащем 1,5 мг/мл глицина, 2 мг/мл альбумина в бычьей сыворотке (БСА), растворенной в ПБТ) плюс 10% ослиной сыворотки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, на стеклянный предмет микроскопа требуется 300 мкл блокирующего буфера плюс 10% ослиной сыворотки.
    8. Поместите стеклянный предмет микроскопа во влажную камеру. Используйте герметичный ящик, где все слайды помещаются, и смочите несколько бумажных салфеток водой, чтобы поместить их на дно коробки. Это предотвратит высыхание горок во время последующих этапов окрашивания.
    9. Удалите блокирующий буфер, добавьте первичное антитело (таблица 6), приготовленное в блокирующем буфере плюс 1% ослиную сыворотку, и инкубируйте слайд, покрытый раствором антител, на ночь во влажной камере при 4 °C. При необходимости повторите маркировку границы пера.
    10. Промыть стеклянный предмет микроскоп три раза в ПБТ при RT в течение 10 мин с мягким перемешиванием на орбитальном шейкере (75-150 об/мин).
    11. Добавляют вторичное антитело (табл. 6), приготовленное в блокирующем буфере плюс 1% ослиной сыворотке, и инкубируют в течение 1 ч во влажной камере при РТ.
    12. Снимите блокирующий буфер и трижды промойте стеклянный слайд микроскопа в PBT at RT в течение 10 минут с мягким перемешиванием на орбитальном шейкере.
    13. Добавьте антизатухающую монтажную среду с DAPI (от 1 до 3 капель) на стеклянную крышку и установите ее поверх органоидных секций (на стеклянном предметном стекле микроскопа). Приступайте к визуализации; хранить слайды не более 1 недели при температуре 4 °C.

9. Экстракция РНК и RT-qPCR зубных органоидов (рисунок 2B и рисунок 3D)

  1. Удаление РНК органоидов зуба
    1. Извлеките среду из каждой лунки (шаг 4.2).
    2. Соберите органоиды, вытеснив каплю BMM (стадия 4.3), перенесите смесь BMM-органоидов в микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл и центрифугу при 200 х г в течение 5 мин при 4 °C.
    3. Удалить надосадочный материал, энергично повторно суспендировать в 350 мкл 1% β-меркаптоэтанола, растворенного в буфере лизиса (Таблица материалов), и положить на лед.
      ВНИМАНИЕ: Выполните все шаги с β-меркаптоэтанолом в химической вытяжке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы могут храниться на этом этапе до 1 месяца при -80 °C. Разморозьте образцы на льду, прежде чем приступить к этапу 9.1.4.
    4. Вращайте образцы до тех пор, пока органоидные структуры больше не будут наблюдаться.
    5. Приступайте к экстракции РНК с помощью набора для экстракции РНК (Таблица материалов) в соответствии с инструкциями производителя.
  2. RT-qPCR зубных органоидов (таблица 7)
    1. Реверс-транскрибировать (RT) РНК19 с помощью набора обратной транскрипции (Таблица материалов) в соответствии с инструкциями производителя.
    2. Анализ полученных образцов кДНК с помощью количественной ПЦР (qPCR)19 на основе SYBR Green с использованием системы ПЦР в реальном времени (Таблица материалов).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Развитие органоидов зуба
Мы предоставляем подробный протокол для установления органоидных культур из DF-ткани человека, приобретенной после удаления зуба мудрости (рисунок 1A). Изолированный ДФ ферментативно и механически диссоциирован. Полученные клетки культивируют в пределах БММ в средах, которые были эмпирически определены для оптимального развития и роста органоидов (зубная органоидная среда; ТОМ)19.

Органоиды обычн...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Этот протокол описывает эффективную и воспроизводимую генерацию органоидов, начиная с человеческого зуба. Насколько нам известно, это первая методология создания современно-концептуальных (эпителиальных) органоидов, начиная с зубной ткани человека. Органоиды являются долгосрочными расширяемыми и демонстрируют фенотип эпителиальной стволовости зуба, дублируя DESC, о которых ранее сообщалось в отсеке ERM DF7. Кроме того, органоиды воспроизводят функциональные характеристики DESC/ERM, включая разверт...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Соответствующий автор гарантирует, что все авторы раскрыли любые и все конфликты интересов.

Благодарности

Мы благодарны всем сотрудникам Челюстно-лицевой хирургии (MKA) UZ Leuven, а также пациентам, за их неоценимую помощь в сборе свежеизвлеченных третьих моляров. Мы также хотели бы поблагодарить д-ра Рейнхильду Джейкобс и д-ра Элизабет Тийскенс за их помощь в сборе образцов. Эта работа была поддержана грантами KU Leuven (BOF) и FWO-Flanders (G061819N). Л.Х. является доктором философии FWO (1S84718N).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1,5 мл Микроцентрифужная пробиркаEppendorf30120.086
15 мл Центрифужная пробиркаCorning430052
2-меркаптоэтанолSigma-AldrichM-6250
48-луночные планшеты с плоским дномCorning3548
50 мл Центрифужная пробиркаCorning430290
A83-01Sigma-Aldrich
AgaroseLonza50004
Альбумин крупного рогатого скота (класс клеточной культуры)Serva47330.03
AMELX антителоSanta Cruzsc-365284
Амфотерицин BGibco15200018
B27 (без витамина А)Gibco12587-010
CassetteVWR
Каталаза из печени крупного рогатого скотаSigma-AldrichC100
CD44 антителоAbcamab34485
Клеточный фильтр, 40 & микро; mFalcon352340
Токсин холерыSigma-AldrichC8052
Лимонная кислотаSigma-AldrichC0759
CK14 антителоThermo Fisher ScientificMA5-11599
Коллагеназа IVGibco17104-019
Cover glassVWR6310146
CryoboxThermo Scientific5100-0001
КриовиальныйThermo Fisher Scientific375353
Диметилсульфоксид (ДМСО)Sigma-AldrichD2650
Диспаза IISigma-AldrichD4693
DMEM 1:1 F12 без FeInvitrogen074-90715A
DMEM порошок с высоким содержанием глюкозыGibco52100039
DnaseSigma-AldrichD5025-15KU
Сыворотка ослаSigma-AldrichD9663 - 10 мл
Встраиваемая рабочая станция, от 220 до 240 В переменного токаThermo Fisher Scientific12587976
абсолют этанола, ≥ 99,8% (EtOH)Fisher ChemicalE/0650DF/15
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Sigma-AldrichF7524
FGF10Peprotech100-26
FGF2 (= базовый FGF)R& D Systems234-FSE-025
FGF8PeprotechAF-100-25
GenElute Mammaliam Total RNA Miniprep KitSigma-AldrichRTN350-1KTВключает 1% &бета;-меркаптоэтанол, растворенный в буфере лизиса
Стекло Пастер пипеткаNiko Mechanisms170-40050
ГлицинVWR101194M
HEPESSigma-AldrichH4034
IGF-1PeproTech100-11
InSolution Y-27632 (ингибитор ROCK, RI)Sigma-Aldrich688001
Инсулин из поджелудочной железы крупного рогатого скотаSigma-AldrichI6634
ITGA6 антителоSigma-AldrichHPA012696
L-глутаминGibco25030024
Матригель (с пониженным фактором роста; фенол не содержит красных)микроскопа Corning
Thermo Fisher ScientificJ1800AMNZ
Millex-GV Шприцевой фильтрующий блок, 0,22  μ mMilliporeSLGV033R
Минимальная необходимая средняя орла (α MEM)Sigma-AldrichM4526
мышиный IgG (Alexa 555) вторичное антителоThermo Fisher ScientificA-31570
N2Gibco17502-048
N-ацетил L-цистеинSigma-AldrichA7250
никотинамидSigma-AldrichN0636
NogginPeproTech120-10C
P63 антителоAbcamab124762
Пап-ручкаSigma-AldrichZ377821-1EAМаркировочная ручка
Параформальдегид (PFA), 16%Merck8.18715
Пенициллин G натриевая сольSigma-AldrichP3032
Пенициллин-стрептомицин (Pen/Strep)Gibco15140-122
ЧашкаПетриПипетка Corning353002
фосфатно-солевой буфер (PBS)Пипетка Gibco10010-015
(P20, P200, P1000)Eppendorf или другие2231300006
Пластиковая трансферная пипетка (3,5  mL)Sarstedt86.1171.001
Rabbit IgG (Alexa 488) вторичное антителоThermo Fisher ScientificA21206
RSPO1PeproTech120-38
SB202190 (p38i)Biotechne (Tocris)1264
Скальпель (хирургическое лезвие)Swann-Morton207
SHHR& D Systems464-SH-200
Силиконовые формы (Нагревательный блок)VWR720-1918
Хлорид натрия (NaCl)BDH102415K
Гидрокарбонат натрия (NaHCO3)Merck106329
пируват натрия (C3H3NaO3)Sigma-AldrichP-5280
SOX2 антителоAbcamab92494
StepOnePlusThermo Fisher ScientificReal-Time PCR
System Stericup-GP, 0.22 &; mMilliporeSCGPU02RE
Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 0,22 шт.; mMilliporeSCGP00525
Sterile 1000 μ L наконечники для пипеток с фильтромGreiner740288
Sterile 20 μ L наконечники для пипеток с фильтромGreiner774288
Sterile 200 μ L наконечники для дозатора с фильтром и без негоGreiner739288
Sterile H2OFreseniusB230531
соль сульфата стрептомицинаSigma-AldrichS6501
Superscript III Супермикс для синтеза первой нитиInvitrogen11752-050Набор для обратной транскрипции
Тканевый процессорThermo Scientific
TransferrinServa36760.01
Triton X-100SigmaT8787-50ML
TrypLE expressGibco12605-010
Монтажная среда Vectashield+DAPILabconsult NVH-1200Защитная крепежная среда с DAPI
WNT3aBiotechne (Tocris)5036-WN-500
Ксилолы, 99%, для биохимии и гистологииVWR2,89,75,325
SML07887202191Предметное стекло для 15505739 12505356

Ссылки

  1. Yu, T., Klein, O. D. Molecular and cellular mechanisms of tooth development, homeostasis and repair. Development (Cambridge). 147 (2), (2020).
  2. Arrow, P. Dental enamel defects, caries experience and oral health-related quality of life: a cohort study. Australian Dental Journal. 62 (2), 165-172 (2017).
  3. Mitsiadis, T. A., Orsini, G., Jimenez-Rojo, L. Dental Stem Cells for Tooth Regeneration. Dental Stem Cells: Regenerative Potential. Stem Cell Biology and Regenerative Potential. Stem Cell Biology and Regenerative Medicine. Zavan, B., Bressan, E. , Humana Press. Cham. (2016).
  4. Mitsiadis, T. A., Orsini, G. Editorial: a new era in dentistry: stem cell-based approaches for tooth and periodontal tissue regeneration. Frontiers in Physiology. 7, 357(2016).
  5. Miran, S., Mitsiadis, T. A., Pagella, P. Innovative dental stem cell-based research approaches: the future of dentistry. Stem Cells International. 2016, 7231038(2016).
  6. Shinmura, Y., Tsuchiya, S., Hata, K. I., Honda, M. J. Quiescent epithelial cell rests of malassez can differentiate into ameloblast-like cells. Journal of Cellular Physiology. 217 (3), 728-738 (2008).
  7. Davis, E. M. A review of the epithelial cell rests of Malassez on the bicentennial of their description. Journal of Veterinary Dentistry. 35 (4), 290-298 (2018).
  8. Athanassiou-Papaefthymiou, M., Papagerakis, P., Papagerakis, S. Isolation and characterization of human adult epithelial stem cells from the periodontal ligament. Journal of Dental Research. 94 (11), 1591-1600 (2015).
  9. Kim, G. -H., et al. Differentiation and establishment of dental epithelial-like stem cells derived from human ESCs and iPSCs. International Journal of Molecular Sciences. 21 (12), 1-16 (2020).
  10. Nam, H., et al. Establishment of Hertwig's epithelial root sheath/ epithelial rests of malassez cell line from human periodontium. Molecules and Cells. 37 (7), 562-567 (2014).
  11. Nam, H., et al. Expression profile of the stem cell markers in human hertwig's epithelial root sheath/Epithelial rests of Malassez cells. Molecules and Cells. 31 (4), 355-360 (2011).
  12. Tsunematsu, T., et al. Human odontogenic epithelial cells derived from epithelial rests of Malassez possess stem cell properties. Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 96 (10), 1063-1075 (2016).
  13. Artegiani, B., Clevers, H. Use and application of 3D-organoid technology. Human Molecular Genetics. 27 (2), 99-107 (2018).
  14. Boretto, M., et al. Patient-derived organoids from endometrial disease capture clinical heterogeneity and are amenable to drug screening. Nature Cell Biology. 21 (8), 1041-1051 (2019).
  15. Cox, B., et al. Organoids from pituitary as a novel research model toward pituitary stem cell exploration. Journal of Endocrinology. 240 (2), 287-308 (2019).
  16. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  17. Boretto, M., et al. Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability. Development (Cambridge). 144 (10), 1775-1786 (2017).
  18. Schutgens, F., Clevers, H. Human organoids: tools for understanding biology and treating diseases). Annual Review of Pathology. 15, 211-234 (2020).
  19. Hemeryck, L., et al. Organoids from human tooth showing epithelial stemness phenotype and differentiation potential. Cellular and Molecular Life Sciences. 79 (3), 153(2022).
  20. Gao, X., Wu, Y., Liao, L., Tian, W. Oral organoids: progress and challenges. Journal of Dental Research. 100 (5), 454-463 (2021).
  21. Binder, M., et al. Novel strategies for expansion of tooth epithelial stem cells and ameloblast generation. Scientific Reports. 10 (1), 4963(2020).
  22. Xiong, J., Mrozik, K., Gronthos, S., Bartold, P. M. Epithelial cell rests of malassez contain unique stem cell populations capable of undergoing epithelial-mesenchymal transition. Stem Cells and Development. 21 (11), 2012-2025 (2012).
  23. Luan, X., Ito, Y., Diekwisch, T. G. H. Evolution and development of Hertwig's epithelial root sheath. Developmental Dynamics. 235 (5), 1167-1180 (2006).
  24. Fukumoto, S., et al. New insights into the functions of enamel matrices in calcified tissues. Japanese Dental Science Review. 50 (2), 47-54 (2014).
  25. Consolaro, A., Consolaro, M. F. M. O. ERM functions, EGF and orthodontic movement or Why doesn't orthodontic movement cause alveolodental ankylosis. Dental Press Journal of Orthodontics. 15 (2), 24-32 (2010).
  26. Guajardo, G., et al. Immunohistochemical localization of epidermal growth factor in cat paradental tissues during tooth movement. American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics. 118 (2), 210-219 (2000).
  27. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
  28. Gonçalves, J., Sasso-Cerri, E., Cerri, P. Cell death and quantitative reduction of rests of Malassez according to age. Journal of Periodontal Research. 43 (4), 478-481 (2008).
  29. Kim, J., Koo, B. -K., Knoblich, J. A. Human organoids: Model systems for human biology and medicine. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).
  30. Razmi, M. T., Narang, T., Handa, S. ADULT (acro-dermato-ungual-lacrimal-tooth) syndrome: a case report from India. Indian Dermatology Online Journal. 9 (3), 194(2018).
  31. Future Health Biobank. , Available from: https://futurehealthbiobank.com/ch-en/ (2022).
  32. Schreurs, R. R. C. E., Baumdick, M. E., Drewniak, A., Bunders, M. J. In vitro co-culture of human intestinal organoids and lamina propria-derived CD4+ T cells. STAR Protocols. 2 (2), 100519(2021).
  33. Fiorini, E., Veghini, L., Corbo, V. Modeling cell communication in cancer with organoids: Making the complex simple. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 166(2020).
  34. Gjorevski, N., et al. Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture. Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).
  35. Zhang, Y., et al. Polyisocyanide hydrogels as a tunable platform for mammary gland organoid formation. Advanced Science. 7 (18), 2001797(2020).
  36. Mollaki, V. Ethical challenges in organoid use. BioTech. 10 (3), 12(2021).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Создание органоидов из человеческих зубов в качестве мощного инструмента для механистических исследований и регенеративной терапии
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.