Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Создание органоидов легких человека и проксимальной дифференцировки для генерации зрелых органоидов дыхательных путей

9.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/63684

⸱

23 марта 2022 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Li Ka Shing Faculty of Medicine, The University of Hong Kong, 2Centre for Virology, Vaccinology and Therapeutics, Hong Kong Science and Technology Park, 3State Key Laboratory of Emerging Infectious Diseases, The University of Hong Kong

В этой статье

Краткое содержание

В протоколе представлен метод получения органоидов легких человека из первичных легочных тканей, расширения органоидов легких и индуцирования проксимальной дифференцировки для генерации 3D и 2D органоидов дыхательных путей, которые точно фенокопируют эпителий дыхательных путей человека.

Аннотация

Отсутствие надежной in vitro модели респираторного эпителия человека препятствует пониманию биологии и патологии дыхательной системы. Мы описываем определенный протокол для получения органоидов легких человека из взрослых стволовых клеток в легочной ткани и индуцирования проксимальной дифференцировки для генерации зрелых органоидов дыхательных путей. Затем органоиды легких последовательно расширяются в течение более 1 года с высокой стабильностью, в то время как дифференцированные органоиды дыхательных путей используются для морфологического и функционального моделирования эпителия дыхательных путей человека до почти физиологического уровня. Таким образом, мы устанавливаем надежную органоидную модель эпителия дыхательных путей человека. Долгосрочное расширение легочных органоидов и дифференцированных органоидов дыхательных путей создает стабильный и возобновляемый источник, позволяющий ученым реконструировать и расширять эпителиальные клетки дыхательных путей человека в культуральных чашках. Органоидная система легких человека обеспечивает уникальную и физиологически активную модель in vitro для различных применений, включая изучение взаимодействия вируса и хозяина, тестирование лекарств и моделирование заболеваний.

Введение

Органоиды стали надежным и универсальным инструментом для моделирования in vitro развития органов и изучения биологии и болезней. При культивировании в культуральной среде, определяемой фактором роста, взрослые стволовые клетки (ASC) из различных органов могут быть расширены в 3-мерном (3D) и самособраны в органоподобные клеточные кластеры, состоящие из нескольких типов клеток, называемых органоидами. Лаборатория Клеверса сообщила о происхождении первого органоида, полученного из САС, органоида кишечника человека, в 2009 году 1,2. После этого были установлены органоиды, полученные из САС, для различных органов и тканей человека, включая простату 3,4, печень 5,6, желудок 7,8,9, поджелудочную железу10, молочную железу11 и легкие 12,13 . Эти органоиды, полученные из ASC, сохраняли критические клеточные, структурные и функциональные свойства нативного органа и поддерживали генетическую и фенотипическую стабильность в культуре долгосрочного расширения14,15.

Органоиды также могут быть получены из плюрипотентных стволовых клеток (PSC), включая эмбриональные стволовые (ES) клетки и индуцированную плюрипотентную стволовую (iPS) клетку16. В то время как органоиды, полученные из PSC, используют механизмы развития органов для своего создания, ИСС могут быть принуждены к образованию органоидов путем восстановления условий, которые имитируют нишу стволовых клеток во время физиологического самообновления тканей или восстановления тканей. Органоиды, полученные из PSC, являются благоприятными моделями для изучения развития и органогенеза, хотя и не могут достичь сопоставимого уровня созревания органоидов, полученных из ASC. Фетально-подобный статус созревания органоидов, полученных из PSC, и сложность создания этих органоидов существенно препятствуют их широкому применению для изучения биологии и патологии в зрелых тканях.

Дыхательные пути человека, от носа до терминальных бронхиол, выстланы эпителием дыхательных путей, также называемым псевдостратифицированным реснитчатым эпителием, который состоит из четырех основных типов клеток, то есть реснитчатых клеток, бокаловидных клеток, базальных клеток и клубных клеток. Мы установили органоид легких человека, полученный из ASC, из легочных тканей человека в сотрудничестве с лабораторией Clevers12,13. Эти леговидные органоиды последовательно расширяются в расширительной среде в течение более года; точная продолжительность варьируется между различными органоидными линиями, полученными от разных доноров. Однако, по сравнению с нативным эпителием дыхательных путей, эти долгосрочные расширяемые органоиды легких недостаточно зрелы, поскольку реснитчатые клетки, основная клеточная популяция в дыхательных путях человека, недостаточно представлены в этих легких органоидах. Таким образом, мы разработали протокол проксимальной дифференцировки и сгенерировали 3D и 2D органоиды дыхательных путей, которые морфологически и функционально фенокопируют эпителий дыхательных путей до почти физиологического уровня.

Здесь мы предоставляем видеопротокол для получения органоидов легких человека из первичных легочных тканей, расширения органоидов легких и индуцирования проксимальной дифференцировки для генерации 3D и 2D органоидов дыхательных путей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты с использованием тканей человека, описанные в настоящем документе, были одобрены Институциональным наблюдательным советом Университета Гонконга / Управлением больниц Гонконга Западного кластера (UW13-364 и UW21-695). Информированное согласие было получено от пациентов до сбора тканей.

1. Происхождение органоида легких человека

  1. Подготовка экспериментальных материалов
    1. Готовят базальную среду, добавляя усовершенствованную среду DMEM/F12 2 мМ глутамина, 10 мМ HEPES, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина.
    2. Приготовьте среду расширения органоидов легких человека, добавив базальную среду 10% кондиционированной средой R-спондина 1, 10% кондиционированной средой Ноггина, 1x добавкой B27, 1,25 мМ N-ацетилцистеина, 10 мМ никотинамида, 5 мкМ Y-27632, 500 нМ A-83-01, 1 мкМ SB202190, 5 нг/мл фактора роста фиброблста (FGF)-7, 20 нг/мл FGF-10 и 100 мкг/мл примоцина (см. Таблицу материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Кондиционированная среда R-спондина 1 и Ноггина может быть заменена коммерческим рекомбинантным R-спондином 1 (500 нг/мл) и Ноггином (100 нг/мл).
    3. Предваренная 24-луночная суспензионная культуральная пластина в инкубаторе клеточной культуры. Используйте стандартный инкубатор клеточных культур с 5% CO2 и увлажненной атмосферой при 37 °C. Матрица размораживания подвала в холодильнике с температурой 4 °C. Держите подвальную матрицу и культуральную среду на льду во время экспериментов.
  2. Выделение клеток из легочных тканей человека для 3D органоидной культуры
    1. Закупайте свежерезированные легочные ткани человека размером около 0,5 см у пациентов, которые подвергаются хирургической резекции из-за различных заболеваний. Транспортировать легочные ткани в 30 мл базальной среды при комнатной температуре и как можно быстрее обрабатывать внутри вытяжки биобезопасности.
    2. Измельчите легочные ткани небольшими кусочками (0,5-1 мм) стерильным скальпелем в чашке для культивирования клеток 10 см. Промыть кусочки ткани 10 мл холодной базальной среды в центрифужной трубке объемом 15 мл с последующим центрифугированием при 400 х г в течение 5 мин при 4 °C.
    3. Откажитесь от супернатанта и повторно суспендируйте гранулу в 8 мл базальной среды, дополненной коллагеназой в конечной концентрации 2 мг/мл. Переваривайте кусочки ткани, встряхивая трубку со скоростью 120 об/мин в течение 30-40 мин при 37 °C.
    4. Пипетка вверх и вниз в течение 20 раз, чтобы срезать переваренные кусочки ткани с помощью серологической пипетки объемом 10 мл. Сложите сетчатый фильтр 100 мкм на центрифужную трубку объемом 50 мл и отфильтруйте суспензию.
    5. Извлеките кусочки ткани на ситечке с базальной средой и перенесите их в центрифужную трубку объемом 15 мл с последующим вторым раундом сдвига и фильтрации. Дополнительная сдвиг-фильтрация может быть выполнена 1x-2x для выделения большего количества клеток, особенно когда закупается небольшой кусочек ткани (например, <0,5 см).
    6. Добавьте FBS к проточному потоку с конечной концентрацией 2% для прекращения пищеварения с последующим центрифугированием при 400 х г в течение 5 мин при 4 °C.
    7. Повторно суспендируют ячейку гранулы в 10 мл базальной среды с последующим центрифугированием при 400 х г в течение 5 мин при 4 °С. Выбросьте супернатант.
    8. (Необязательно) Если в грануле видно много эритроцитов (оценивается по цвету гранулы), повторно суспендируют клеточную гранулу в 2 мл буфера лизиса эритроцитов и инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин. Затем добавляют в пробирку 10 мл базальной среды с последующим центрифугированием при 400 х г в течение 5 мин при 4 °C. Выбросьте супернатант.
    9. Повторно суспендировать гранулы в холодной подвальной матрице и держать на льду. Добавьте 80-160 мкл фундаментного матрикса для клеток, извлеченных из легочной ткани размером около 0,5 см; количество достаточно для посева 2-4 капель.
    10. Дозируйте по 40 мкл суспензии в каждую лунку предварительно нагретой 24-луночной суспензионной культуральной пластины. Инкубируют культуральную пластину при 37 °C в течение 10-15 мин. Дайте фундаментной матрице затвердеть, чтобы образовалась капля.
    11. Добавьте в каждую лунку 500 мкл среды расширения органоидов легких человека, дополненной 5 нМ бета-1 герегулина, и инкубируйте пластинку в инкубаторе клеточной культуры.
    12. Обновляйте среду каждые 3 дня. Удалите старую среду, сохраняя каплю неповрежденной, и добавьте свежую среду с осторожностью. Прохождение органоидов после инкубации в течение 10-14 дней. Используйте Херегулин бета-1 только в исходной культуре перед первым прохождением.
    13. Понаблюдайте за органоидами под микроскопом, чтобы убедиться, что органоиды не встроены с очень высокой плотностью клеток. Если капля распадается из-за чрезмерно высокой плотности клеток, восстановите и повторно встройте органоиды и клетки с большим объемом фундаментного матрикса, чтобы сделать больше капель с более низкой и желательной плотностью клеток.

2. Расширение легочных органоидов человека

  1. Подготовьте пипетку Пастера, сжигая наконечник пипетки Пастера на пламя, такое как горелка Бунзена, чтобы сузить отверстие от 1,5 мм до примерно 1,0 мм в диаметре. Охладите пипетки с последующим автоклавированием для стерилизации. Смочите пипетки базальной средой, чтобы избежать прикрепления и потери клеток во время механической резки.
  2. Прохождение органоидов легких с механической сдвигом
    1. Используйте наконечник 1 мл и пипетку вверх и вниз, чтобы разбить капли, полученные выше. Затем перенесите органоиды вместе со средой в центрифужную трубку объемом 15 мл и отрегулируйте объем до 10 мл с холодной базальной средой. Выбрасывайте супернатант после центрифугирования при 300 х г в течение 5 мин при 4 °C
    2. Еще раз промыть органоиды 10 мл холодной базальной среды. Повторное суспендирование органоидов в 2 мл холодной базальной среды. Пипетка вверх и вниз, чтобы разрезать органоиды на мелкие кусочки пипеткой Пастера.
    3. Дополнить базальной средой общим объемом 10 мл с последующим центрифугированием при 300 х г в течение 5 мин при 4 °C. Повторное суспендирование фрагментов органоидов с матрицей холодного фундамента, достаточной для обеспечения расширения от 1:3 до 1:5. Держитесь на льду.
    4. Поместите 40 мкл органоидной суспензии в каждую лунку предварительно нагретой 24-луночной пластины. Инкубируют культуральную пластину при 37 °C в течение 10-15 мин. Дайте матрице подвала затвердеть.
    5. Добавьте 500 мкл легочной органоидной расширительной среды в каждую лунку и инкубируйте в инкубаторе клеточной культуры. Обновляйте среду каждые 3 дня. Прохождение органоидов каждые 2 недели с соотношением 1:3 к 1:5.
  3. Прохождение органоидов легких с трипсинизацией
    ПРИМЕЧАНИЕ: Трипсинизация предпочтительна, когда трудно разрезать органоид легких на мелкие кусочки с помощью пипетки Пастера, или размер органоидов сильно варьируется, или последующие эксперименты требуют органоидов более однородного размера.
    1. Извлечение органоидов легких, как показано на этапе 2.2.1. Повторно суспендируют органоид в 1 мл фермента диссоциации и инкубируют на водяной бане 37 °C в течение 3-5 мин.
    2. Добавьте в пробирку 1 мл базальной среды. Срезайте органоиды механически, пипетируя органоиды вверх и вниз на мелкие кусочки с помощью пипетки Пастера. Проверьте размер органоидных фигур под микроскопом при 4-кратном увеличении. Затем добавьте 40 мкл FBS, чтобы прекратить пищеварение.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Определить размер органоидных фрагментов под микроскопом в соответствии с экспериментальной компоновкой. Если для эксперимента требуется больше органоидов или органоидов более однородного размера, разрежьте органоиды на более мелкие кусочки или даже отдельные клетки. Затем требуется больше времени, вероятно, 3 недели, прежде чем органоиды будут готовы к экспериментам.
    3. Долить базальной средой до конечного объема 10 мл с последующим центрифугированием при 300 х г в течение 5 мин при 4 °С. Повторно суспендируют органоидные куски в холодную подвальную матрицу с объемом, достаточным для прохождения с соотношением 1:5-1:10. Держитесь на льду.
    4. Поместите 40 мкл органоидной суспензии в каждую лунку предварительно нагретой 24-луночной пластины. Инкубируют культуральную пластину при 37 °C в течение 10-15 мин. Дайте матрице подвала затвердеть.
    5. Дополнить 500 мкл легочной органоидной расширительной среды на лунку и инкубировать в инкубаторе клеточной культуры. Обновляйте носитель расширения каждые 3 дня. Прохождение органоидов через 2-3 недели.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Около 100 органоидов установлены в капельке 40 мкл фундаментной матрицы. Леговидные органоиды обычно растут лучше при относительно высокой плотности клеток. Повторно встраивайте органоиды с более низкой плотностью клеток, если капли распадаются или растущие органоиды соединяются вместе из-за чрезмерно высокой плотности клеток.

3. Проксимальная дифференцировка для генерации зрелых органоидов дыхательных путей

  1. Получение проксимальной дифференцировочной среды (PD среды) путем дополнения базальной среды раздела воздушной жидкости 1x добавкой интерфейса воздушной жидкости, 1 добавкой для поддержания интерфейса воздушной жидкости, 4 мкг/мл гепарина, 1 мкМ гидрокортизона, 10 мкМ Y-27632 и 10 мкМ DAPT (см. Таблицу материалов).
  2. Органоиды 3D дыхательных путей
    1. Инкубируют органоиды легких в расширительной среде в течение 7-10 дней после прохождения методом механической резки. Замените расширительную среду средой PD. Инкубируют органоиды в среде PD в течение 14 дней в инкубаторе клеточной культуры.
    2. Выбросьте ПД-среду в каждой скважине. Добавьте буфер лизата клеток для извлечения дифференцированного органоида дыхательных путей для экстракции РНК и обнаружения экспрессии клеточных генов с помощью анализа RT-qPCR.
    3. Альтернативно, инкубируют органоиды при 37 °C в течение 60 мин после добавления 10 мМ ЭДТА для диссоциации органоидов в отдельные клетки с последующим анализом проточной цитометрии для изучения клеточных популяций. Органоиды готовы к различным экспериментальным манипуляциям.
  3. Органоид 2D дыхательных путей
    1. Подготовьте достаточное количество 3D-органоидов легких для 2D-дифференцировки культуры. В общей сложности 1,3 х 105 и 4,5 х 105 ячеек требуются для 24-луночной проницаемой опорной вставки и 12-луночной проницаемой опорной вставки, соответственно.
    2. После того, как 3D-органоиды легких растут в расширительной среде в течение 2 недель, переваривайте органоиды в отдельные клетки и семяйте в 24-луночные и 12-луночные вставки для генерации 2D-органоидов дыхательных путей.
    3. Предварительно инкубируют вставки с базальной средой на ночь в инкубаторе клеточной культуры. Добавьте 250 мкл и 500 мкл базальной среды в верхнюю и нижнюю камеру 24-луночной пластины соответственно. Для 12-луночной пластины добавьте 500 мкл и 1000 мкл базальной среды в верхнюю и нижнюю камеры соответственно.
    4. Извлечение 3D-органоидов легких, как описано в шаге 2.2.1. Повторно суспендируют органоиды 1 мл фермента диссоциации и инкубируют на водяной бане 37 °C в течение 3-5 мин.
    5. Добавьте в пробирку 1 мл базальной среды. Пипетка вверх и вниз, чтобы разрезать органоиды на отдельные клетки с помощью пипетки Пастера и проверить клетки под микроскопом. Затем добавьте 40 мкл FBS, чтобы прекратить пищеварение.
    6. Отфильтруйте ячейки через сетчатый фильтр 40 мкм в центрифужную трубку объемом 50 мл. Переложите отфильтрованную клеточную суспензию в трубку объемом 15 мл. Долить базальной средой общим объемом 10 мл с последующим центрифугированием при 300 х г в течение 5 мин при 4 °С.
    7. Повторно суспендируют гранулу, собранную из 24 капель (40 мкл), в 1-2,5 мл легочной органоидной расширительной среды в зависимости от плотности клеток в каплях. Подсчитайте количество клеток с помощью счетчика клеток под микроскопом. Отрегулируйте концентрацию в ячейке до 1,3 x 106/мл (для 24-луночных вкладышей) или 9 x 105/мл (для 12-луночных вкладышей).
    8. Удалите базальную среду из верхней и нижней камер. Добавьте 500 мкл и 1000 мкл расширительной среды в нижнюю камеру 24-луночной вставки и 12-луночной вставки соответственно. Семена 100 мкл и 500 мкл клеточной суспензии, приготовленной на стадии 3.3.7, попадают в апикальную камеру 24-луночной вставки и 12-луночной вставки соответственно.
    9. Инкубируют в инкубаторе клеточной культуры в течение 2 дней. Замените расширительную среду средой PD как в апикальной, так и в нижней камере пластин. Инкубируйте органоиды в инкубаторе клеточных культур в течение 14 дней и обновляйте среду PD каждые 3 дня.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подвижные реснички различимы в 3D и 2D органоидах под микроскопом с 7-го дня после инкубации в среде PD. После 14 дней дифференцировки культуры в среде БП органоиды дыхательных путей созревают для различных экспериментальных манипуляций.
    10. Измеряйте трансэпителиальное электрическое сопротивление (TEER) через день с помощью системы измерения электрического сопротивления в соответствии со стандартным протоколом, описанным в17.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Этот протокол позволяет получать органоиды легких человека с высоким уровнем успеха. Свежая легочная ткань человека измельчается на мелкие кусочки, а затем разлагается коллагеназой. Полученные одиночные клетки внедряются в фундаментную матрицу и инкубируются в среде расширения органоидов легких, дополненной коктейлем нишевых факторов для роста эпителиальных стволовых клеток (этап 1.1.2). На рисунке 1 показан микрофотограф свежеизолированных клеток легких, встроенных в матрицу базальной мембр...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Дыхательные пути человека выстланы эпителием дыхательных путей, также известным как псевдостратифицированный реснитчатый эпителий. Основными типами клеток эпителия верхних дыхательных путей являются реснитчатые клетки, которые обеспечивают скоординированное движение их апикальных ресничек для изгнания слизи и вдыхаемых частиц из дыхательных путей, бокаловидные клетки, которые производят и секретируют слизь, и базальные клетки, которые выстилают базальную мембрану и участвуют в регенерации. В небольших дыхательных путях, ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

J. Z., C.L. и M.C.C. перечислены как изобретатели в патенте на органоиды дыхательных путей (публикация No: US-2021-0207081-A1). Другие авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Благодарности

Мы благодарим Центр Панорамных Наук и Подразделение Электронного Микроскопа, Медицинский факультет Ли Ка Шинг Университета Гонконга, за помощь в конфокальной визуализации и проточной цитометрии. Эта работа была частично поддержана финансированием из Фонда медицинских исследований в области здравоохранения (HMRF, 17161272 и 19180392) Бюро продовольствия и здравоохранения; Общий исследовательский фонд (GRF, 17105420) Совета по исследовательским грантам; и Health@InnoHK, Комиссия по инновациям и технологиям, правительство Специального административного района Гонконг.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Реагенты для культуры органоидов легких
Advanced DMEM/F12Invitrogen
12634010-A8301Tocris2939500nM
B27 добавкаInvitrogen17504-0441x
Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix, тип 2 (BME 2)Trevigen3533-010-070-80%
FGF-10Peprotech100-2620 нг/мл
FGF-7Peprotech100-195 нг/мл
GlutaMAX (глутамин)Invitrogen350500611x
HEPES 1MInvitrogen15630-05610 мМ
Герегулин β-1Peprotech100-035 нМ
N-ацетилцистеинSigma-AldrichA91651,25 мМ
никотинамидSigma-AldrichN063610 мМ
Ноггин (условная среда)домашнегопроизводства-10x
Пенициллин-стрептомицин (10 000 Ед/мл)Invitrogen15140-1221x
PrimocinInvivogenant-pm-1100 &; г/мл
Рспондин1 (условный средний)домашнегопроизводства-10x
SB202190Sigma-AldrichS70671 &микро; M
Y-27632Tocris12545 & микро; M
<сильная>проксимальная дифференцировка средняя
DAPTTocris263410 &микро; M
Heparin SolutionStemCell Technology79804 & г/мл
Стоковый раствор гидрокортизонаТехнология стволовых клеток79251 & микро; M
PneumaCult-ALI 10X Supplementвоздушная жидкая добавка для интерфейса
PneumaCult-ALI Basal MediumStemCell Technology05001воздушная жидкая среда
PneumaCult-ALI Maintenance Supplementвоздушная жидкость для обслуживания
Y-27632Tocris125410 &; M
Equipment
Шкаф биологической безопасностиBaker1-800-992-2537
Carl Zeiss LSM 780 или 800Конфокальный микроскопZeiss
CO2 ИнкубаторCO2 Thermo Fisher Scientific42093483
стереомикроскопOlympus CorporationCKX31SF
ЦентрифугаEppendorf5418BG040397
Серологический дозаторEppendorf
МикропипеткаEppendorf
ZEN черный или ZEN синий программное обеспечениеанализаZeiss
<сильное>Расходные материалы
12мм Технологиятранс-луночных стволовых клеток#38023
12-луночный планшет для клеточных культурCellstar665970
15- и 50 мл конические пробиркиThermo Fisher ScientificL6BF5Z8118
24-луночный планшет для клеточных культурCellstar662160
6,5 мм Trans-wellStemCell Technology#38024
Медицинский шприц фильтрует, 0,22 &; mSigma-AldrichSLGPR33RB
пробирки Microfuge НаконечникиEppendorf
Thermo Fisher ScientificTFLR140-200-Q21190531
Стекло для пипетокПастера Thermo Fisher Scientific22-378893
Серологические пипетки (5мл, 10мл, 25мл)Thermo Fisher ScientificBA08003, 08004, 08005
<сильные>антитела
козьи антимышиные Alexa Fluor 594InvitrogenA11005
Goat Anti-Mouse, Alexa Fluor 488InvitrogenA11001
Goat Anti-rabbit Alexa Fluor 488InvitrogenA11034
Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 594InvitrogenA11037
Козий анти-крыс Alexa Fluor 594InvitrogenA11007
Мышиный анти-цитокератин 5Abcamab128190
Мышиный анти-FOX J1Invitrogen14-9965-82
Мышиный анти-муцин 5ACAbcamab3649
Мышиный анти-&бета;-тубулин 4SigmaT7941
Кролик анти-p63Abcamab124762
Крысиный антиутероглобин/CC-10R& D SystemsMAB4218-SP
сильный>Другой реагент
TrypLE Select Enzyme (10X)Thermo Fisher ScientificA1217701фермент диссоциации
для для микропипеток <

Ссылки

  1. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  2. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  3. Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
  4. Chua, C. W., et al. Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture. Nature Cell Biology. 16 (10), 951-954 (2014).
  5. Hu, H., et al. Long-term expansion of functional mouse and human hepatocytes as 3D organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
  6. Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).
  7. Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
  8. Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
  9. Wroblewski, L. E., et al. Helicobacter pylori targets cancer-associated apical-junctional constituents in gastroids and gastric epithelial cells. Gut. 64 (5), 720-730 (2015).
  10. Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. The EMBO Journal. 32 (20), 2708-2721 (2013).
  11. Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
  12. Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300(2019).
  13. Zhou, J., et al. Differentiated human airway organoids to assess infectivity of emerging influenza virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (26), 6822-6827 (2018).
  14. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  15. Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
  16. Lancaster, M. A., Huch, M. Disease modelling in human organoids. Disease Model Mechanisms. 12 (7), (2019).
  17. Millicell ERS-2 User Guide. , Available from: https://www.merckmillipore.com/HK/en/life-science-research/cell-culture-systems/cell-analysis/millicell-ers-2-voltohmmeter/FiSb.qB.LDgAAAFBdMhb3.r5,nav?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F (2021).
  18. Dye, B. R., et al. In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids. eLife. 4, 05098(2015).
  19. Dye, B. R., Miller, A. J., Spence, J. R. How to grow a lung: Applying principles of developmental biology to generate lung lineages from human pluripotent stem cells. Current Pathobiology Reports. 4, 47-57 (2016).
  20. Glinka, A., et al. LGR4 and LGR5 are R-spondin receptors mediating Wnt/beta-catenin and Wnt/PCP signalling. EMBO Reports. 12 (10), 1055-1061 (2011).
  21. Groppe, J., et al. Structural basis of BMP signalling inhibition by the cystine knot protein Noggin. Nature. 420 (6916), 636-642 (2002).
  22. Tadokoro, T., Gao, X., Hong, C. C., Hotten, D., Hogan, B. L. BMP signaling and cellular dynamics during regeneration of airway epithelium from basal progenitors. Development. 143 (5), 764-773 (2016).
  23. Mou, H., et al. Dual SMAD signaling inhibition enables long-term expansion of diverse epithelial basal cells. Cell Stem Cell. 19 (2), 217-231 (2016).
  24. Balasooriya, G. I., Goschorska, M., Piddini, E., Rawlins, E. L. FGFR2 is required for airway basal cell self-renewal and terminal differentiation. Development. 144 (9), 1600-1606 (2017).
  25. Bar-Ephraim, Y. E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Organoids in immunological research. Nature Reviews. Immunology. 20 (5), 279-293 (2019).
  26. Drost, J., Clevers, H. Translational applications of adult stem cell-derived organoids. Development. 144 (6), 968-975 (2017).
  27. Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
  28. Zhou, J., et al. Infection of bat and human intestinal organoids by SARS-CoV-2. Nature Medicine. 26 (7), 1077-1083 (2020).
  29. Salahudeen, A. A., et al. Progenitor identification and SARS-CoV-2 infection in human distal lung organoids. Nature. 588 (7839), 670-675 (2020).
  30. Han, Y., et al. Identification of SARS-CoV-2 inhibitors using lung and colonic organoids. Nature. 589 (7841), 270-275 (2020).
  31. Mykytyn, A. Z., et al. SARS-CoV-2 entry into human airway organoids is serine protease-mediated and facilitated by the multibasic cleavage site. eLife. 10, 64508(2021).
  32. Jacob, F., et al. Human pluripotent stem cell-derived neural cells and brain organoids reveal SARS-CoV-2 neurotropism predominates in choroid plexus epithelium. Cell Stem Cell. 27 (6), 937-950 (2020).
  33. Lamers, M. M., et al. SARS-CoV-2 productively infects human gut enterocytes. Science. 369 (6499), 50-54 (2020).
  34. Mallapaty, S. The mini lungs and other organoids helping to beat COVID. Nature. 593 (7860), 492-494 (2021).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

RT qPCR
Создание органоидов легких человека и проксимальной дифференцировки для генерации зрелых органоидов дыхательных путей
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.