Методическая статья

Визуализация подвижности бактерий на основе цветовой реакции

DOI:

10.3791/63706

⸱

15 февраля 2022 г.

 , 
1Department of Microbiology, School of Life Science and Technology, China Pharmaceutical University, 2National Experimental Teaching Demonstration Center of Biopharmaceuticals, China Pharmaceutical University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем протокол для обнаружения бактериальной подвижности, основанный на цветовой реакции. Ключевые преимущества этого метода заключаются в том, что он прост в оценке и более точен, и не требует специализированного оборудования.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Подвижность бактерий имеет решающее значение для патогенности бактерий, образования биопленки и лекарственной устойчивости. Подвижность бактерий имеет решающее значение для инвазии и/или распространения многих патогенных видов. Поэтому важно выявлять бактериальную подвижность. Условия роста бактерий, такие как кислород, рН и температура, могут влиять на рост бактерий и экспрессию бактериальных жгутиков. Это может привести к снижению подвижности или даже потере подвижности, что приводит к неточной оценке подвижности бактерий. Основываясь на цветовой реакции 2,3,5-трифенилтетразолия хлорида (ТТС) внутриклеточными дегидрогеназами живых бактерий, ТТС добавляли к традиционному полутвердому агару для определения подвижности бактерий. Результаты показали, что этот метод обнаружения подвижности бактерий с полутвердым агаром TTC прост, удобен в эксплуатации и не требует больших и дорогостоящих инструментов. Результаты также показали, что наибольшая подвижность наблюдалась в полутвердой среде, приготовленной с 0,3% агара. По сравнению с традиционной полутвердой средой результаты легче оценить и они более точны.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Подвижность бактерий играет решающую роль в патогенности бактерий, образовании биопленки и лекарственной устойчивости1. Бактериальная подвижность тесно связана с патогенностью и необходима для колонизации бактерий во время раннего инфицирования клеток-хозяев2. Образование биопленки тесно связано с подвижностью бактерий, когда бактерии прилипают к поверхности твердой среды за счет подвижности. Долгое время считалось, что подвижность бактерий положительно коррелирует с образованием биопленки. Высокая степень бактериальной лекарственной устойчивости из-за биопленки может привести к персистирующим инфекциям, представляющим угрозу для здоровья человека 3,4,5. Поэтому важно выявлять бактериальную подвижность. Тест на подвижность бактерий в основном используется для изучения подвижности различных форм бактерий в живом состоянии, которые могут косвенно определять наличие или отсутствие жгутиков и, таким образом, играют важную роль в идентификации бактерий.

Различают прямые и непрямые методы выявления бактериальной подвижности6. Поскольку бактерии со жгутиками проявляют подвижность, можно определить, являются ли бактерии подвижными косвенно, обнаружив наличие или отсутствие жгутиков. Например, можно косвенно обнаружить подвижность с помощью электронной микроскопии и окрашивания жгутиков, чтобы указать, что бактерии подвижны. Также возможно обнаружение прямыми методами, такими как капля суспензии и полутвердая пункция.

Метод полутвердой пункции, обычно используемый в микробиологических лабораториях бакалавриата для обнаружения подвижности бактерий, инокулирует бактерии в прокол в полутвердой агаровой среде, содержащей 0,4-0,8% агара, в зависимости от направления роста бактерий. Если бактерии растут вдоль линии прокола, чтобы распространиться вокруг, появляются облачные (кистевидные) следы роста, указывающие на наличие жгутиков и, следовательно, подвижность. Если нет следов роста на линии прокола, бактерия не является ни жгутиковой, ни подвижной.

Однако у этого метода есть свои недостатки: бактерии бесцветны и прозрачны, на жгутиковую активность влияют физиологические особенности живых бактерий и другие факторы, а также концентрация агара и малый диаметр пробирки. Более того, аэробные бактерии пригодны только для роста на поверхности агара, влияя на наблюдение за подвижностью бактерий. Следовательно, для улучшения этого эксперимента в среду был добавлен 2,3,5-трифенилтетразолий хлорид (TTC) (бесцветный), чтобы установить более надежный и интуитивно понятный метод определения подвижности бактерий, чем текущий метод прямой пункции с использованием внутриклеточных дегидрогеназ для катализа образования красного продукта TTC 7,8,9,10.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Приготовление полутвердой среды

  1. Традиционный полутвердый агар
    1. Приготовьте традиционный полутвердый агар в соответствии с рецептурой среды для тестирования на подвижность бактерий, используя основные ингредиенты11. Растворите 10 г триптозы, 15 г NaCl, 4 г агара в достаточном количестве дистиллированной воды, отрегулируйте рН до 7,2 ± 0,2 и доведите конечный объем до 1000 мл.
    2. Автоклавируйте агар при 121 ° C в течение 20 минут и распределите его в пробирки по 10 мл в виде полутвердой среды высотой 3 см.
  2. Традиционный полутвердый агар с ТТС
    1. После автоклавирования обычной полутвердой среды охладите ее до 50 °C, добавьте 5 мл стерильного 1% раствора TTC к 100 мл среды, перемешайте и распределите ее в пробирки по 10 мл с образованием полутвердой среды высотой 3 см.

2. Бактериальные штаммы

ПРИМЕЧАНИЕ: Восемьдесят штаммов были выделены из водной среды и идентифицированы с помощью автоматизированного инструмента идентификации бактерий (см. Таблицу материалов), включая Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella spp., Vibrio spp., Klebsiella pneumoniae и Aeromonas hydrophila (таблица 1). Золотистый стафилококк (см. Таблицу материалов) использовался в качестве отрицательного неподвижного контроля; В качестве положительных контрольных штаммов использовали Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa и Salmonella typhimurium (см. Таблицу материалов).

  1. Определите тестовые штаммы бактерий, которые будут использоваться для анализа подвижности.
  2. Включите отрицательные неподвижные контрольные и подвижные положительные контрольные штаммы.

3. Наблюдение за подвижностью бактерий с усилением TTC

  1. Отбирают отдельные колонии исследуемых бактерий из агаровых пластин и инокулируют их в две вышеуказанные полутвердые среды (этапы 1.1.2 и 1.2.1) путем прокола с помощью инокуляционных игл.
  2. Культивируют пробирки при 37 °C в инкубаторе в течение 24-48 ч, чтобы наблюдать за результатами.
  3. Наблюдайте за состоянием роста: характеризуйте бактерии как неподвижные (-), если только линия прокола красная. Охарактеризуйте бактерии как подвижные (+), если красный цвет слегка распространяется наружу вдоль линиипрокола 12.

4. Влияние различных концентраций агара на подвижность бактерий

  1. Готовят полутвердые среды, содержащие 0,3%, 0,5% и 0,8% агара, и инокулируют их путем пункции, как описано выше. Наблюдайте за результатами через 24-48 ч инкубации.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Как стандартные, так и изолированные штаммы сравнивали для определения подвижности, и результаты приведены в таблице 1. Из-за отсутствия жгутиков Staphylococcus aureus и Klebsiella pneumoniae росли только вдоль инокулированной линии как на традиционных, так и на полутвердых средах TTC. Напротив, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli и Salmonella typhimurium показали рост во всех направлениях вокруг инокулированной линии после культивирования в течение 24 ч ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

На выявление подвижности бактерий методом полутвердой среды влияет множество факторов13,14. Условия роста бактерий, такие как кислород (аэробный на поверхности агара, неаэробный на дне пробирки с полутвердой средой), рН и температура, могут влиять на жизнеспособность бактериальных жгутиков, что может привести к снижению подвижности или даже потере подвижности15. Кроме того, на некоторые бактерии слизистого типа по мере их подвижности может...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликтов интересов, которые необходимо раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано Приоритетной академической программой развития высших учебных заведений провинции Цзянсу (PAPD) и Исследовательским проектом по реформе преподавания Китайского фармацевтического университета (2019XJYB18).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Bacto AgarDifco
Escherichia coliATCCATCC25922Положительный контроль
Pseudomonas aeruginosaATCCATCC27853положительный контроль
Salmonella typhimuriumATCCATCC14028положительный контроль
Staphylococcus aureusATCCATCC25923Отрицательный неподвижный контроль
Триптоза  OXOID
TTCSigma298-96-4
VITEK 2 автоматизированная система идентификации микроорганизмовBio Mé Рьё

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jordan, E. O., Caldwell, M. E., Reiter, D. Bacterial motility. Journal of Bacteriology. 27 (2), 165(1934).
  2. Lai, S. L., Hou, H., Jiang, W. Bacterial motility and its role during initial stage of pathogenesis. Journal of Microbiology. 26 (5), in Chinese 68-70 (2006).
  3. Ding, S. S., Wang, Y. Relationship between flagella-dependent motility and biofilm in bacteria - A review. Acta Microbiologica Sinica. 49 (4), in Chinese 417-422 (2009).
  4. Zeng, J., Wang, D. Recent advances in the mechanism of bacterial resistance and tolerance. Chinese Journal of Antibiotics. 45 (2), 113-121 (2020).
  5. Xu, M., Zhou, M. X., Zhu, G. Q. Progress in the mechanism of bacterial flagellum motility, adhesion and immune escape. Chinese Journal of Veterinary Science. 37 (2), 369-375 (2017).
  6. Leboffe, M. J., Pierce, B. E. Microbiology: laboratory theory and application. Third edition. , Morton Publishing Company. Colorado. (2015).
  7. Ball, R. J., Sellers, W. Improved motility medium. Applied Microbiology. 14, 670-673 (1966).
  8. An, S., Wu, J., Zhang, L. H. Modulation of Pseudomonas aeruginosa biofilm dispersal by a cyclic-di-GMP phosphodiesterase with a putative hypoxia-sensing domain. Applied and Environmental Microbiology. 76 (24), 8160-8173 (2010).
  9. Chouhan, O. P., et al. Effect of site-directed mutagenesis at the GGEEF domain of the biofilm forming GGEEF protein from Vibrio cholerae. AMB Express. 6 (1), 2(2016).
  10. McLaughlin, M. R. Simple colorimetric microplate test of phage lysis in Salmonella enterica. Journal of Microbiological Methods. 69 (2), 394-398 (2007).
  11. Difco Laboratories. Difco manual: Dehydrated culture media and reagents for microbiology. Difco Laboratories. , Detroit. (1984).
  12. Tittsler, R. P., Sandholzer, L. A. The use of semi-solid agar for the detection of bacterial motility. Journal of Bacteriology. 31 (6), 575(1936).
  13. Qian, Y., Tian, X. Y., Zhang, S. Y., Wang, J. Explore the influencing factors of bacterial motility. Health Care Today. 6, 50-51 (2018).
  14. Wang, J., et al. Filamentous Phytophthora pathogens deploy effectors to interfere with bacterial growth and motility. Frontiers in Microbiology. 11, 581511(2020).
  15. Kühn, M. J., et al. Spatial arrangement of several flagellins within bacterial flagella improves motility in different environments. Nature Communication. 9 (1), 5369(2018).
  16. Mitchell, A. J., Wimpenny, J. W. T. The effects of agar concentration on the growth and morphology of submerged colonies of motile and non-motile bacteria. Journal of Applied Microbiology. 83 (1), 76-84 (2010).
  17. Xu, A., Zhang, M., Du, W., Wang, D., Ma, L. Z. A molecular mechanism for how sigma factor AlgT and transcriptional regulator AmrZ inhibit twitching motility in Pseudomonas aeruginosa. Environmental Microbiology. 23 (2), 572-587 (2021).
  18. Bartley, S. N., et al. Attachment and invasion of Neisseria meningitidis to host cells is related to surface hydrophobicity, bacterial cell size and capsule. PLoS One. 8, 55798(2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи