Использование низкого напряжения кислорода для снижения гемопоэтических клеток в культурах стромальных клеток костного мозга мышей

Краткое содержание

Рутинное культивирование стромальных клеток костного мозга (БМСК) приводит к выделению гетерогенных клеточных популяций, многие из которых имеют гемопоэтическое происхождение. В этой статье мы описываем метод, в котором используется низкое давление кислорода для значительного снижения гемопоэтических загрязнителей в культурах мышей BMSC.

Аннотация

В настоящее время по-прежнему отсутствует общепризнанные маркеры для проспективной изоляции однородной популяции скелетных стволовых клеток (ССК). По этой причине BMSC, которые поддерживают кроветворение и участвуют во всех функциях скелета, продолжают широко использоваться для изучения мультипотентных мезенхимальных предшественников (MMP) и вывода о функции SSC. Более того, учитывая широту трансгенных мышиных моделей, используемых для изучения заболеваний опорно-двигательного аппарата, использование BMSC также служит мощным инструментом для изучения молекулярных механизмов, регулирующих MMP и SSC. Тем не менее, общие процедуры изоляции мышиных BMSC приводят к тому, что более 50% восстановленных клеток имеют гемопоэтическое происхождение, что потенциально затрудняет интерпретацию данных, полученных в ходе этих исследований. Здесь мы описываем метод, использующий низкое напряжение кислорода или гипоксию для селективной элиминации CD45⁺ клеток в культурах BMSC. Важно отметить, что этот метод может быть легко реализован не только для снижения гемопоэтических загрязнителей, но и для увеличения процентного содержания MMP и предполагаемых SSC в культурах BMSC.

Введение

Подобно гемопоэтическим стволовым клеткам (ГСК), ССК размещаются в микроокружении кости; однако, в отличие от ГСК, в настоящее время не хватает общепринятых маркеров клеточной поверхности, которые можно было бы использовать для проспективной идентификации^{SSCs 1,2,3}. Тем не менее, системы культивирования in vitro и анализы восстановления in vivo показывают, что часть BMSC обладает способностью поддерживать кроветворение, а также способностью дифференцироваться во все клетки мезенхимальных^линий. Таким образом, в то время как BMSC представляют собой весьма неоднородную популяцию, часть этих клеток обладает свойствами настоящих стволовых клеток, что определяется их способностью к самообновлению и восстановлению всех клеток их исходной ткани. Более того, в отличие от использования маркеров клеточной поверхности, BMSC могут быть быстро выделены на основе их быстрой адгезии к тканевым культурам пластики ^6,7. По этим причинам BMSC часто используются в качестве суррогата SSC⁵.

В то время как для успешного выделения BMSC из тканей человека было использовано преимущественное прилегание к тканевому культуре (ТС) пластика, мышиные модели представляют дополнительные проблемы для этого метода. В частности, поскольку мышиные гемопоэтические клетки обладают способностью прилипать как к пластику ТС, так и к BMSC, в этой модельной системе происходит высокая контаминация кроветворения, что затрудняет интерпретацию данных, полученных с использованием этого метода изоляции⁶.

Примечательно, что BMSC находятся в микроокружении костей, где напряжение кислорода колеблется от 1% до 4%⁸. Однако в стандартных условиях культивирования тканей инкубаторы для клеточных культур поддерживаются при уровне кислорода в атмосфере 21%, что представляет собой супрафизиологический уровень. Подчеркивая функциональную значимость этих различий, культивирование клеток мезенхимального происхождения при 21% кислорода связано с повышенной гибелью клеток ^9,10. Более того, недавно мы продемонстрировали, что гематологические клетки и мезенхимальные клетки по-разному реагируют на низкое напряжение кислорода. В частности, наблюдается существенное снижение количества CD45⁺ гемопоэтических клеток при поддержании культур BMSCs при низком напряжении кислорода. Действительно, мы отметили снижение CD45⁺ гемопоэтических клеток на 90% при использовании этой методики¹¹.

В этой статье мы делимся протоколом, который может быть легко реализован в лабораториях для значительного снижения гемопоэтического загрязнения и улучшения чистоты мезенхимальных клеток во время рутинного культивирования BMSC.

Протокол

Все описанные методы с использованием мышиных моделей были выполнены в соответствии с утвержденными протоколами Комитета по уходу за животными и их использованию (IACUC) (A187-19-08).

1. Рассечение костей задних конечностей

1. Усыпить 10-12-недельных самцов или самок мышей C57BL/6 путем удушения_CO-2 со скоростью потока 2-4 л/мин с последующим подтверждением смерти от обезглавливания. В этом анализе могут использоваться как самки, так и самцы мышей без ожидаемых различий в результатах. Сбрызните пух мехом с 70% этанолом.
2. С помощью стерильных хирургических щипцов и ножниц сделайте небольшой разрез на коже под грудиной. Руками разорвите кожу по окружности тела, а затем потяните кожу дистально к задним конечностям, чтобы обнажить подлежащие ткани.
3. С помощью стерилизованных хирургических щипцов и ножниц аккуратно удалите заднюю конечность, отделив головку бедренной кости (шарик) от вертлужной впадины (впадины) таза (бедра). С помощью стерильных щипцов и скальпеля аккуратно соскребите вдоль костей, чтобы удалить как можно больше мягких тканей.
4. Используйте стерильный скальпель, чтобы разделить бедренную и большеберцовую кости с минимальным сопротивлением, чтобы разрезать связки (латеральную и медиальную коллатеральную, переднюю и заднюю крестообразную и сухожилие надколенника), соединяющие две кости. Важно отметить, что после отделения сохраните нетронутыми мыщелки как на дистальном отделе бедренной кости, так и на проксимальном отделе большеберцовой кости.
5. Для дистальных отделов бедренных костей делают надрез между головкой бедренной кости и третьим вертелом и надрез у эпифиза проксимальнее ростовой пластинки, сводя к минимуму повреждение ростовой пластинки.
6. Для проксимальных большеберцовых костей сделайте один разрез проксимальнее латеральной лодыжки и один разрез дистальнее плато большеберцовой кости прямо проксимальнее пластины роста.
7. Поместите бедренные и большеберцовые кости срезанной стороной вниз в отдельные микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл.

2. Выделение БМСК из бедренных и большеберцовых костей

1. Поместите микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл в настольную центрифугу и вращайте при температуре 10 000 x g при 4 °C в течение 1 с.
2. С помощью стерильного пинцета осторожно удалите кости из микроцентрифужных пробирок, оставив на дне микроцентрифужной пробирки красную пробку костного мозга. Если в костном стержне осталось немного костного мозга, перенесите кость в новую трубку, повторите быстрый отжим и соедините гранулы в одной пробирке во время ресуспендирования Шаг 2.3.
3. Используйте пипетку P1000 для мягкой суспендирования гранулы костного мозга в 500 μл питательной среды, MEMa с добавлением 20% эмбриональной бычьей сыворотки и 1000 ЕД/мл пенициллин-стрептомицина. Перенесите стромальные клетки костного мозга в коническую пробирку объемом 15 мл, содержащую 4,5 мл питательной среды.

3. Лизис эритроцитов

1. Понижайте ячейки при 300 x g при 4 °C в течение 5 минут. Аспирируйте питательную среду и аккуратно суспендируйте гранулу в 1,5 мл буфера для лизиса эритроцитов.
2. Выдерживать при комнатной температуре в течение 75-90 с. Немедленно закалить 10 мл питательной среды.
3. Понижайте ячейки при 300 x g при 4 °C в течение 5 минут. Отсадите среду и повторно суспендируйте гранулу в 10 мл питательной среды для подсчета (см. Шаг 4).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Клеточная гранула должна быть уже не красной, а белой, что указывает на успешный лизис эритроцитов. Если гранула все еще красная, можно провести дополнительный раунд буфера для лизиса эритроцитов.

4. Гальванизация BMSC

1. Чтобы подсчитать живые клетки для осаждения, удалите 10 мкл клеточной суспензии и добавьте к 10 мкл раствора Трипана Блю.
2. Поместите 10 μL смеси раствора Cell:Trypan Blue на гемоцитометр и подсчитайте жизнеспособные (не голубые) клетки. Большинство клеток следует исключить трипановый синий.
3. Для анализа колоний поместите клетки с плотностью 60 000 клеток/^см2 в колбы для культуры тканей T-25^см2 . Для культур BMSC высокой плотности тарелки с плотностью 130 000 клеток/^см2 на 100^мм2 чашки для культуры тканей. Используйте общий объем 5 мл для колб Т-25 см² и общий объем 10 мл для 100 см² посуды.
4. Инкубируйте клетки в течение 3 ч при концентрации 1%-2% (гипоксия) или 21% кислорода (нормоксия) и 5%_CO2. Для рутинного культивирования БМСК при низком напряжении кислорода можно использовать либо гипоксический клеточный инкубатор, либо камеру с гипоксией. Настройте каждый прибор в соответствии с инструкциями производителя таким образом, чтобы газовый поток азота и углекислого газа приводил к желаемому диапазону кислорода и_CO2.
5. Через 3 часа тщательно промойте пластины 3x 1x PBS. Чтобы не нарушить работу клеток, которые начали прикрепляться, осторожно промойте, замедлив аспирацию, и нанесите пипетирование на боковую часть чашек для культуры тканей.
6. После заключительного ополаскивания 1x PBS замените PBS 10 мл питательной среды, если вы используете 100 см² чашки, или 5 мл субстрата для роста, если используете^{2 колбы} T-25 см. После промывки большинство плавающих клеток следует удалить.

5. Поддержание БМСК в гипоксических условиях

1. Для гипоксических культур поддерживайте клетки в камере гипоксии или инкубаторе с 1%-2%_O2 и 5%_CO2. Для нормоксических культур поддерживайте клетки на уровне 21%_O2 и 5%_CO2. При использовании гипоксического инкубатора следите за тем, чтобы дверцы были минимально открыты, чтобы предотвратить приток атмосферного кислорода (21%). Меняйте носители каждые 2-3 дня.
2. Для анализа колоний инкубируйте клетки в течение 7-10 дней, после чего либо перечислите колонии, либо начните дифференцировку или другие желаемые анализы. В условиях гипоксии можно ожидать от 50 до 120 колоний, тогда как в нормоксических условиях можно ожидать от 5 до 30 колоний.
3. Для культур BMSC высокой плотности инкубируйте клетки до слияния, примерно 7-10 дней для гипоксических культур и примерно 14-21 день для нормоксических культур. После слияния трипсинизируйте клетки 0,25% трипсина для использования в желаемых анализах.
4. Чтобы визуализировать клетки, поместите чашку для культуры тканей на предметную область, поверните фазовый объектив в оптический путь и убедитесь, что ползунок фазового контраста выбран для соответствующего объектива. Просматривайте ячейки с 100-кратным или 200-кратным увеличением.

Результаты

После 7 дней изоляции клетки культивируются при 21% кислорода, становятся высокогетерогенными. В частности, существует большая вариабельность в размерах, при этом более крупные биполярные клетки перемежаются с более мелкими клетками, содержащими множественные выступы (рис. 1A). Напротив, клетки, выращенные в условиях гипоксии, очень однородны. Клетки внутри колоний относительно схожи по размеру и имеют биполярный вид, напоминая другие клетки мезенхимального происхождения, выращенные на пласт...

Обсуждение

По нашим наблюдениям, БМСК прилипают к пластике тканевых культур раньше, чем макрофаги и другие клетки гемопоэтического происхождения¹¹. По этой причине промывка планшетов через 3 часа после нанесения покрытия является критически важным этапом, так как при этом удаляются плавающие кроветворные клетки, которые могут прикрепиться в более поздние временные точки. Кроме того, эти полоскания следует проводить с осторожностью, в частности, путем пипетирования среды на б...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
100 мм2 чашки для культуры тканей	Corning	353003
1x фосфатный баффированный физиологический раствор (PBS)	Gibco	100010-023
гемоцитометр Bright-Line	Sigma-Aldrich	Z359629
C57BL/6J	The Jackson Laboratory	664
HyClone Фетальная сыворотка бычьего происхождения (США), характеризуемая	GE Healthcare Life Наука	SH30071.03
InvivO2 400	Baker Ruskinn	https://bakerco.com
MEMα, нуклеозиды	Gibco	12571-063
Пенициллин-стрептомицин (10 000 Ед/мл)	Gibco	15140-122
Буфер для лизинга эритроцитов Hybri-Max	Sigma-Aldrich	R7757
Т-25см<суп>2  Колбы для культуры тканей	Corning	430168
Trypan Blue Solution	Sigma-Aldrich	T8154
Trypsin-EDTA (0,25%), фенол красный	Gibco	25200-056