Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Внутренняя чувствительность митохондриальной мембраны к Na+ раскрывает частично сегментированные функциональные пулы CoQ

1.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/63729

⸱

20 июля 2022 г.

 , 
1Fundación Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III CNIC, 2Centro de Investigaciones Biomédica en Red de Fragilidad y Envejecimiento, Saludable-CIBERFES

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает сравнительный анализ с использованием митохондриальных комплексных активностей CI+CIII и CII+CIII при наличии или отсутствии Na+, для изучения существования частично сегментированных функциональных пулов CoQ.

Аннотация

Пулы убихинона (CoQ) во внутренней митохондриальной мембране (IMM) частично сегментированы либо сложными I, либо FAD-зависимыми ферментами. Такое деление может быть легко оценено сравнительным анализом с использованием NADH или сукцината в качестве доноров электронов в замороженных-размороженных митохондриях, в которых измеряется снижение цитохрома c (cyt c). Анализ опирается на влияние Na+ на ИММ, уменьшая его текучесть. Здесь мы представляем протокол для измерения активности NADH-цит c оксидоредуктазы и сукцинат-цит c оксидоредуктазы в присутствии NaCl или KCl. Реакции, которые полагаются на смесь реагентов в кювете ступенчатым образом, измеряют спектрофотометрически в течение 4 мин в присутствии Na+ или K+. Ту же смесь выполняют параллельно в присутствии специфических ингибиторов фермента с целью вычитания неспецифического изменения абсорбции. Активность NADH-cyt c оксидоредуктазы не снижается в присутствии ни одного из этих катионов. Однако сукцинат-цистая активность c оксидоредуктазы снижается в присутствии NaCl. Этот простой эксперимент подчеркивает: 1) влияние Na+ на снижение текучести ИММ и перенос CoQ; 2) что суперкомплекс I+III2 защищает перенос убихинона (CoQ) от воздействия снижения текучести ИММ; 3) что передача CoQ между CI и CIII функционально отличается от передачи CoQ между CII и CIII. Эти факты подтверждают существование функционально дифференцированных пулов CoQ в IMM и показывают, что они могут регулироваться изменяющейся средой Na+ митохондрий.

Введение

Митохондриальная система окислительного фосфорилирования (OXPHOS) является основным путем, стимулирующим синтез аденозинтрифосфата (АТФ), производство активных форм кислорода (АФК) и потребление митохондриями восстановительных эквивалентов, таких как никотинамидадениндинуклеотид (NADH) или сукцинат. Система OXPHOS состоит из пяти белковых комплексов: комплекс I (CI) окисляет NADH и восстанавливает CoQ в убихинол (CoQH2). Комплекс II (CII) окисляет сукцинат в фумарат и восстанавливает CoQ до CoQH2. Комплекс III (CIII) окисляет CoQH2 обратно в CoQ, уменьшая цитохром c (cyt c). Наконец, комплекс IV (CIV) окисляет цист c и уменьшает содержание кислорода в воде. Эта цепь оксидоредукции, так называемая цепь переноса электронов (mETC), связана с перекачкой H+ через ИММ, что создает электрохимический градиент, используемый комплексом V (CV) для фосфорилирования аденозиндифосфата (АДФ) в АТФ.

Комплексы mETC могут быть либо одиночными в IMM, либо собираться в четвертичные структуры, называемые суперкомплексами. CIV может собираться с CIII, образуя III2+IV или Q-респирасому (так как она способна вдыхаться в присутствии CoQH2)1,2,3 или образуя гомодимеры или гомолигомеры 4. CIII может взаимодействовать с CI, образуя суперкомплекс I+III25. Наконец, CI также способен взаимодействовать с Q-респирасомой, создавая I+III2+IV или N-респирасому (так как она может вдыхаться, потребляя NADH)1,6,7,8,9,10.

CoQ и cyt c являются подвижными носителями электронов, отвечающими за перенос электронов из CI/CII в CIII и из CIII в CIV, соответственно. Вопрос о том, налагают ли суперкомплексы функциональное локальное ограничение для этих носителей, был предметом интенсивных дебатов в течение последних двух десятилетий 2,7,11,12,13,14,15,16,17. Тем не менее, несколько независимых групп продемонстрировали, что CoQ и cyt c могут быть функционально сегментированы в пулы в IMM. В отношении CoQ он может быть функционально сегментирован в определенный пул CoQ для CI (CoQNAD) и другой пул, предназначенный для FAD-зависимых ферментов (CoQFAD)1,7,12,18,19. Однако для того, чтобы дифференцировать существование частично сегментированных функциональных пулов CoQ, потребовалась сверхэкспрессия альтернативной оксидазы (AOX) и генерация специфических мутантов мтДНК, которые могут собирать CI в отсутствие CIII, 1,19,20.

Механизм производства активных форм кислорода (АФК) во время гипоксии был неизвестен до недавнего времени. При острой гипоксии ДИ претерпевает активный/деактивный (A/D) переход, который включает в себя снижение его H+ , перекачивающей NADH-CoQ оксидоредуктазы. Такое снижение накачки H+ подкисляет митохондриальный матрикс и частично растворяет кальциево-фосфатные осадки в митохондриальном матриксе, высвобождая растворимый Ca2+. Это увеличение растворимого Ca2+ активирует теплообменник Na+/Ca2+ (NCLX), который выдавливает Ca2+ в обмен на Na+. Митохондриальное увеличение Na+ взаимодействует с фосфолипидами во внутренней части ИММ, уменьшая его текучесть и перенос CoQ между CII и CIII, в конечном итоге производя супероксидный анион, окислительно-восстановительный сигнал21. Интересно, что перенос CoQ был уменьшен только между CII и CIII, но не между CI и CIII, подчеркивая, что 1) Na+ смог модулировать только один из существующих пулов CoQ в митохондриях; 2) в IMM существуют функционально дифференцированные пулы CoQ. Таким образом, широко используемый протокол для изучения активности митохондриальных ферментов может быть использован для оценки существования упомянутых пулов CoQ.

Текущий протокол основан на измерении восстановления окисленной циты c, субстрата CIII, путем поглощения в присутствии сукцината (т.е. субстрата CII) или NADH (т.е. субстрата CI). Один и тот же образец делится на два, один из которых будет обработан KCl, а другой с одинаковой концентрацией NaCl. Таким образом, учитывая, что Na+ уменьшает текучесть ИММ, если бы CoQ существовал в уникальном пуле в IMM, как CI+CIII, так и CII+CIII уменьшались бы в присутствии Na+. Однако, если бы CoQ существовал в частично сегментированных функциональных пулах CoQ, влияние Na+ было бы в основном (или только) очевидно на активность CII+CIII, но не на CI+CIII. Как недавно опубликовано21, Na+ влияет только на перенос CoQ между CII и CIII (рисунок 1C,D), но не между CI и CIII (рисунок 1A,B).

Этот протокол вместе с целым рядом методов был использован для подтверждения существования частично сегментированных функциональных пулов CoQ в IMM, один из которых посвящен CI (т.е. CoQNAD), а другой - ферментам, связанным с FAD (т.е. CoQFAD)1,3,7; замечание, которое, хотя оно и продолжает обсуждаться22, было независимо подтверждено несколькими группами 7,19. Таким образом, суперсборка CI в суперкомплексы влияет на локальную мобильность CoQ, облегчая его использование CIII в рамках суперкомплекса 1,7,13,14,23,24,25.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с Руководством по уходу за лабораторными животными и их использованию и были одобрены институциональным комитетом по этике Национального центра исследований сердечно-сосудистых заболеваний Карлоса III (CNIC), Испания, в соответствии с Директивой Европейского союза от 22 сентября 2010 года (2010/63/UE) и Испанским королевским указом от 1 февраля 2013 года (53/2013). Были предприняты все усилия, чтобы свести к минимуму количество используемых животных и их страдания.

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот сравнительный анализ для изучения сегментации митохондриальных пулов CoQ описывается следующим образом:

1. Количественная оценка белка

  1. Заморозьте и разморозьте изолированные митохондрии26 из печени мыши дикого типа три раза (т.е. митохондриальные мембраны) перед экспериментами, чтобы сделать органеллы проницаемыми для реакционных субстратов.
  2. Количественно оценить количество белка в изолированном образце митохондрий методами Брэдфорда или Бицинхониновой кислоты (BCA). В случае Брэдфорда добавьте 2 мкл образца в 1 мл 1x реагента Брэдфорда.
  3. Разделите образец на четыре подвыборки по 20 мкг каждая (а именно: A, B, C, D; Рисунок 2А).

2. Измерение активности CI+CIII

ПРИМЕЧАНИЕ: В этой части протокола используются образцы A и B для измерения активности CI+CIII (рисунок 2B).

  1. Разделите образцы A и B на две подвыборки по 10 мкг каждая (а именно A1, A2, B1 и B2). Смешайте каждый из подвыборок в кювете объемом 1 мл с 30 мкл цит с (10 мг/мл), 10 мкл 100 мМ малоната и добавьте предварительно нагретый буфер C1/C2 (таблица 1) при 37 °C до 980 мкл (979 мкл для кювет A2 и B2).
    ВНИМАНИЕ: Этот этап включает в себя использование токсичных реагентов малоната и цианида калия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: цит c (10 мг/мл) должен быть приготовлен свежим путем смешивания 10 мг cyt c в 1 мл 10 мМ K2HPO4 раствора, рН скорректирован до 7,2, и его необходимо поддерживать во льду на протяжении всего эксперимента.
  2. Добавьте 10 мкл 1 M KCl в кюветах A1 и A2 и добавьте 10 мкл 1 M NaCl в кюветах B1 и B2.
  3. Добавьте 1 мкл ротенона 1 мМ в кювету, содержащую подвыборки A2 и B2.
    ВНИМАНИЕ: Этот этап включает в себя использование токсичного реагента ротенона.
  4. Непосредственно перед измерением добавьте 10 мкл NADH (10 мМ) во все кюветы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 10 мкл предпочтительно добавляют на стадии кюветы, поэтому реакция начинается при перемешивании.
  5. Перемешайте кювету, аккуратно перевернув ее три раза. Поместите его в абсорбционный считыватель кюветы (спектрофотометр UV/VISJASCO).
  6. Нажмите « Измерить > параметры» > «Общие» и установите параметры измерения на длина волны: 550 нм и время: 4 минуты чтения; Нажмите кнопки Принять и Пуск , чтобы начать эксперимент.
  7. В конце измерения сохраните наклон, включающий линейное увеличение поглощения, щелкнув Файл и Сохранить как. Уклон также можно собрать вручную.

3. Измерение активности CII+CIII

ПРИМЕЧАНИЕ: Эта часть протокола использует образцы C и D для измерения активности CII+CIII (рисунок 2C).

  1. Разделите образцы C и D на две подвыборки по 10 мкг каждая (а именно C1, C2, D1 и D2). Смешайте каждый из подобразцов в кювете объемом 1 мл с 30 мкл цит с (10 мг/мл), 1 мкл ротенона 1 мМ и добавьте предварительно нагретый буфер C1/C2 при 37 °C до 980 мкл (970 мкл для кювет C2 и D2).
    ВНИМАНИЕ: Этот этап включает в себя использование токсичных реагентов цианистого калия и ротенона.
    ПРИМЕЧАНИЕ: цит c (10 мг/мл) должен быть приготовлен свежим путем смешивания 10 мг cyt c в 1 мл 10 мМ K2HPO4 раствора, рН скорректирован до 7,2, и его необходимо поддерживать во льду на протяжении всего эксперимента.
  2. Добавьте 10 мкл 1 M KCl в кюветах C1 и C2 и добавьте 10 мкл 1 M NaCl в кюветах D1 и D2.
  3. Добавьте 1 мкл 1 мМ антимицина А в кювету, содержащую подвыборки C2 и D2.
    ВНИМАНИЕ: Этот этап включает в себя использование токсичного реагента антимицина А.
  4. Непосредственно перед измерением добавьте 10 мкл сукцината (1 М) во все кюветы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 10 мкл предпочтительно добавляют на стадии кюветы, поэтому реакция начинается при перемешивании.
  5. Тщательно перемешайте кювету, перевернув ее три раза. Поместите его в абсорбционный считыватель кюветы (УФ/ВИС спектрофотометр).
  6. Нажмите « Измерить > параметры» > «Общие» и установите параметры измерения на длина волны: 550 нм и время: 4 минуты чтения; Нажмите кнопки Принять и Пуск , чтобы начать эксперимент.
  7. В конце измерения сохраните наклон, включающий линейное увеличение поглощения, щелкнув Файл и Сохранить как. Уклон также можно собрать вручную.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Типичные результаты этого протокола представлены ниже (рисунок 3). Поскольку пониженная абсорбция цит c находится на уровне 550 нм, все раскованные субвыборки должны показывать увеличение абсорбции на 550 нм. Ингибированные подвыборки в идеале показывают плоский или слегка увеличивающийся уклон (рисунок 3). Склоны из ингибированных подвыборок должны быть вычтены из раскованных субпроблей.

Образцы A и B, скорректированные их соответств...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Хотя этот протокол представляет собой очень простую процедуру для идентификации существования частично сегментированных пулов CoQ, есть несколько критических шагов, которые необходимо учитывать. Субстраты (т.е. NADH или сукцинат) предпочтительно добавляют последними, поскольку может происходить автоокисление этих соединений. Переворачивание кюветы должно быть осторожным, чтобы избежать образования пузырьков, которые могут помешать чтению.

Кроме того, настоящая методика представляет собой неско...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Мы благодарим д-ра Р. Мартинеса-де-Мену, М.М. Муньоса-Эрнандеса А., д-ра К. Хименеса и Э.Р. Мартинеса-Хименеса за техническую помощь. Это исследование было поддержано MICIN: RTI2018-099357-B-I00 и HFSP (RGP0016/2018). CNIC поддерживается Институтом спасения Карлоса III (ISCIII), Министром науки, Инноваций и Университетов (MCNU) и Фондом Pro CNIC и является Центром передового опыта Северо Очоа (SEV-2015-0505). Рисунок 2 создан с помощью BioRender.com.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Антимицин АСигма-ОлдричA8674
Бычий сывороточный альбумин (БСА)Сигма-Олдрич10775835001
анализ белка БрэдфордаBio-Rad5000001
Цитохром с из сердца лошадиSigma-AldrichC7752
K2HPO4Sigma-AldrichP3786
KClSigma-AldrichP3911
Малоновая кислотаSigma-AldrichM1296
MgCl2Sigma-AldrichM8266
NaClSigma-AldrichS9888
NADHRoche10107735001
цианистый калийSigma-Aldrich207810
RotenoneSigma-AldrichR8875
Spectra Manager программное обеспечениеJASCOверсия 2
СпектрофотометрUV/VISJASCO
SuccinateSigma-Aldrich398055

Ссылки

  1. Calvo, E., et al. Functional role of respiratory supercomplexes in mice: SCAF1 relevance and segmentation of the Qpool. Science Advances. 6 (26), (2020).
  2. Garcia-Poyatos, C., et al. Scaf1 promotes respiratory supercomplexes and metabolic efficiency in zebrafish. EMBO Reports. 21 (7), 50287(2020).
  3. Lapuente-Brun, E., et al. Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain. Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).
  4. Cogliati, S., et al. Mechanism of super-assembly of respiratory complexes III and IV. Nature. 539 (7630), 579-582 (2016).
  5. Letts, J. A., Fiedorczuk, K., Degliesposti, G., Skehel, M., Sazanov, L. A. Structures of respiratory Supercomplex I+III2 reveal functional and conformational crosstalk. Molecular Cell. 75 (6), 1131-1146 (2019).
  6. Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. Respiratory active mitochondrial supercomplexes. Molecular Cell. 32 (4), 529-539 (2008).
  7. Jeon, T. J., et al. A dynamic substrate pool revealed by cryo-EM of a lipid-preserved respiratory supercomplex. Antioxidants and Redox Signaling. , (2021).
  8. Gu, J., et al. The architecture of the mammalian respirasome. Nature. 537 (7622), 639-643 (2016).
  9. Letts, J. A., Fiedorczuk, K., Sazanov, L. A. The architecture of respiratory supercomplexes. Nature. 537 (7622), 644-648 (2016).
  10. Sousa, J. S., Mills, D. J., Vonck, J., Kuhlbrandt, W. Functional asymmetry and electron flow in the bovine respirasome. Elife. 5, 21290(2016).
  11. Andreasson, C., Ott, M., Buttner, S. Mitochondria orchestrate proteostatic and metabolic stress responses. EMBO Reports. 20 (10), 47865(2019).
  12. Berndtsson, J., et al. Respiratory supercomplexes enhance electron transport by decreasing cytochrome c diffusion distance. EMBO Reports. 21 (12), 51015(2020).
  13. Bianchi, C., Genova, M. L., Parenti Castelli, G., Lenaz, G. The mitochondrial respiratory chain is partially organized in a supercomplex assembly: kinetic evidence using flux control analysis. Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 36562-36569 (2004).
  14. Enriquez, J. A. Supramolecular organization of respiratory complexes. Annual Review of Physiology. 78, 533-561 (2016).
  15. Genova, M. L., Lenaz, G. A critical appraisal of the role of respiratory supercomplexes in mitochondria. Biological Chemistry. 394 (5), 631-639 (2013).
  16. Letts, J. A., Sazanov, L. A. Clarifying the supercomplex: the higher-order organization of the mitochondrial electron transport chain. Nature Structural and Molecular Biology. 24 (10), 800-808 (2017).
  17. Milenkovic, D., Blaza, J. N., Larsson, N. G., Hirst, J. The enigma of the respiratory chain supercomplex. Cell Metabolism. 25 (4), 765-776 (2017).
  18. Moe, A., Di Trani, J., Rubinstein, J. L., Brzezinski, P. Cryo-EM structure and kinetics reveal electron transfer by 2D diffusion of cytochrome c in the yeast III-IV respiratory supercomplex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (11), 2021157118(2021).
  19. Szibor, M., et al. Bioenergetic consequences from xenotopic expression of a tunicate AOX in mouse mitochondria: Switch from RET and ROS to FET. Biochimica et Biophysica Acta. Bioenergetics. 1861 (2), 148137(2020).
  20. Guaras, A., et al. The CoQH2/CoQ ratio serves as a sensor of respiratory chain efficiency. Cell Reports. 15 (1), 197-209 (2016).
  21. Hernansanz-Agustin, P., et al. Na(+) controls hypoxic signalling by the mitochondrial respiratory chain. Nature. 586 (7828), 287-291 (2020).
  22. Vercellino, I., Sazanov, L. A. The assembly, regulation and function of the mitochondrial respiratory chain. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 23 (2), 141-161 (2022).
  23. Acin-Perez, R., Enriquez, J. A. The function of the respiratory supercomplexes: the plasticity model. Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (4), 444-450 (2014).
  24. Enriquez, J. A., Lenaz, G. Coenzyme q and the respiratory chain: coenzyme q pool and mitochondrial supercomplexes. Molecular Syndromology. 5 (3-4), 119-140 (2014).
  25. Hernansanz-Agustin, P., Enriquez, J. A. Functional segmentation of CoQ and cyt c pools by respiratory complex superassembly. Free Radical Biology and Medicine. 167, 232-242 (2021).
  26. Fernandez-Vizarra, E., et al. Isolation of mitochondria for biogenetical studies: An update. Mitochondrion. 10 (3), 253-262 (2010).
  27. Cogliati, S., Cabrera-Alarcon, J. L., Enriquez, J. A. Regulation and functional role of the electron transport chain supercomplexes. Biochemical Society Transactions. 49 (6), 2655-2668 (2021).
  28. den Brave, F., Becker, T. Supercomplex formation boosts respiration. EMBO Reports. 21 (12), 51830(2020).
  29. Perez-Mejias, G., Guerra-Castellano, A., Diaz-Quintana, A., Dela Rosa, M. A., Diaz-Moreno, I. Cytochrome c: Surfing off of the mitochondrial membrane on the tops of Complexes III and IV. Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 654-660 (2019).
  30. Stepanova, A., Valls, A., Galkin, A. Effect of monovalent cations on the kinetics of hypoxic conformational change of mitochondrial complex I. Biochimica et Biophysica Acta. 1847 (10), 1085-1092 (2015).
  31. Acin-Perez, R., et al. A novel approach to measure mitochondrial respiration in frozen biological samples. The EMBO Journal. 39 (13), 104073(2020).
  32. Böckmann, R. A., Hac, A., Heimburg, T., Grubmüller, H. Effect of sodium chloride on a lipid bilayer. Biophysical Journal. 85 (3), 1647-1655 (2003).
  33. Cordomí, A., Edholm, O., Perez, J. J. Effect of ions on a dipalmitoyl phosphatidylcholine bilayer. a molecular dynamics simulation study. The Journal of Physical Chemistry B. 112 (5), 1397-1408 (2008).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

cIII
Внутренняя чувствительность митохондриальной мембраны к Na+ раскрывает частично сегментированные функциональные пулы CoQ
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.