Method Article

Изготовление микроструктурированного чипа с контролируемой толщиной для высокопроизводительной криогенной электронной микроскопии

DOI:

10.3791/63739

⸱

April 21st, 2022

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical-Chemical Engineering, The Catholic University of Korea, 2Department of Biotechnology, The Catholic University of Korea, 3School of Chemical and Biological Engineering, and Institute of Chemical Processes, Seoul National University, 4Center for Nanoparticle Research, Institute of Basic Science (IBS), 5Institute of Engineering Research, College of Engineering, Seoul National University, 6Advanced Institutes of Convergence Technology, Seoul National University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Недавно разработанный микроструктурированный чип с окнами оксида графена изготовлен с применением методов микроэлектромеханической системы, что позволяет эффективно и высокопроизводительно криогенную электронную микроскопию визуализировать различные биомолекулы и наноматериалы.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Основным ограничением для эффективного и высокопроизводительного структурного анализа биомолекул с использованием криогенной электронной микроскопии (крио-ЭМ) является сложность подготовки крио-ЭМ образцов с контролируемой толщиной льда на наноуровне. Микросхема на основе кремния (Si), которая имеет регулярный массив микроотверстей с окном оксида графена (GO), узорчатым на пленке нитрида кремния с контролируемой толщиной (SixNy), была разработана с применением методов микроэлектромеханической системы (MEMS). УФ-фотолитография, химическое осаждение из паровой фазы, мокрое и сухое травление тонкой пленки, капельное литье 2D нанолистовых материалов использовались для массового производства микроструктурированных чипов с окнами GO. Глубина микроотверстей регулируется для контроля толщины льда по требованию, в зависимости от размера образца для крио-ЭМ-анализа. Благоприятное сродство GO к биомолекулам концентрирует биомолекулы, представляющие интерес, в микро-отверстии во время крио-ЭМ пробоподготовки. Микроструктурированный чип с окнами GO обеспечивает высокопроизводительную крио-ЭМ визуализацию различных биологических молекул, а также неорганических наноматериалов.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Криогенная электронная микроскопия (крио-ЭМ) была разработана для разрешения трехмерной (3D) структуры белков в их родном состоянии 1,2,3,4. Метод включает фиксацию белков в тонком слое (10-100 нм) стекловидного льда и получение проекционных изображений случайно ориентированных белков с помощью просвечивающего электронного микроскопа (ТЭМ), при этом образец поддерживается при температуре жидкого азота. Тысячи и миллионы проекционных изображений получены и использованы для реконструкции 3D-структуры белка с помощью вычислительных алгоритмов 5,6. Для успешного анализа с помощью крио-ЭМ криоподготовка образцов была автоматизирована путем погружной заморозки оборудования, которое контролирует условия блоттинга, влажность и температуру. Образец раствора загружают на сетку ТЭМ с дырявой углеродной мембраной, последовательно промокают для удаления избытка раствора, а затем погружают-замораживают жидким этаном для получения тонкого стекловидного льда 1,5,6. С достижениями в области крио-ЭМ и автоматизации пробоподготовки7 крио-ЭМ все чаще используется для решения структуры белков, включая белки оболочки для вирусов и белки ионных каналов в клеточной мембране 8,9,10. Структура белков оболочки патогенных вирусных частиц важна для понимания патологии вирусной инфекции, а также разработки системы диагностики и вакцин, например, SARS-CoV-211, вызвавшего пандемию COVID-19. Кроме того, крио-ЭМ методы недавно были применены в материаловедении, например, для визуализации чувствительных к пучку материалов, используемых в батареях 12,13,14 и каталитических системах 14,15, и анализа структуры неорганических материалов в состоянии раствора16.

Несмотря на заметные изменения в крио-ЭМ и соответствующих методах, существуют ограничения в крио-пробоподготовке, препятствующие высокопроизводительному 3D-анализу структуры. Получение стекловидной ледяной пленки с оптимальной толщиной особенно важно для получения 3D-структуры биологических материалов с атомным разрешением. Лед должен быть достаточно тонким, чтобы минимизировать фоновый шум от электронов, рассеянных льдом, и запретить перекрытие биомолекул вдоль траектории электронного пучка 1,17. Однако, если лед слишком тонкий, это может привести к тому, что белковые молекулы выровняются в предпочтительных ориентациях или денатурируют 18,19,20. Поэтому толщина стекловидного льда должна быть оптимизирована в зависимости от размера интересующего материала. Кроме того, обычно требуются значительные усилия для подготовки образцов и ручного скрининга целостности льда и белка на подготовленных сетках ТЕА. Этот процесс чрезвычайно трудоемкий, что снижает его эффективность для высокопроизводительного анализа 3D-структур. Таким образом, повышение надежности и воспроизводимости крио-ЭМ пробоподготовки улучшит использование крио-ЭМ в структурной биологии и коммерческом открытии лекарств, а также в материаловедении.

Здесь мы вводим процессы микрофабрикации для изготовления микроструктурированного чипа с окнами оксида графена (GO), предназначенного для высокопроизводительной крио-ЭМ с контролируемой толщиной льда21. Микроструктурный чип был изготовлен с использованием методов микроэлектромеханической системы (MEMS), которые могут манипулировать структурой и размерами чипа в зависимости от целей визуализации. Микроструктурированный чип с окнами GO имеет структуру микролунки, которая может быть заполнена раствором образца, а глубина микролунки может регулироваться для контроля толщины стекловидного льда. Сильное сродство GO к биомолекулам повышает концентрацию биомолекул для визуализации, повышая эффективность структурного анализа. Кроме того, микроструктурированный чип состоит из Si-кадра, который обеспечивает высокую механическую стабильность сетки19, что делает его идеальным для обработки чипа во время процедур подготовки образцов и крио-ЭМ визуализации. Таким образом, микроструктурированный чип с окнами GO, изготовленными по методам MEMS, обеспечивает надежность и воспроизводимость крио-ЭМ пробоподготовки, что может обеспечить эффективный и высокопроизводительный анализ структуры на основе крио-ЭМ.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Изготовление микроструктурированного чипа с окнами GO (рисунок 1)

  1. Нанесите нитрид кремния.
    1. Нанесите низконапряженный нитрид кремния (SixNy) на обе стороны кремниевой пластины (диаметр 4 дюйма и толщина 100 мкм) с использованием химического осаждения из паровой фазы низкого давления (LPCVD) при 830 °C и давлении 150 мТорр, под потоком 170 sccm дихлорсилана (SiH2Cl2, DCS) и 38 sccm аммиака (NH3).
    2. Используя скорость осаждения ~30 Å/мин, контролируйте толщину SixNy в пределах 25-100 нм, изменяя время осаждения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При обращении с кремниевой пластиной следует проявлять крайнюю осторожность, потому что пластина очень тонкая и хрупкая. Следите за тем, чтобы не согнуть пластину во время ее обработки или загрузки в оборудование.
  2. Рисунок фоторезиста.
    1. Нанесите раствор гексаметилдисилазана (HMDS) на sixNy-осажденную кремниевую пластину с достаточным объемом, чтобы покрыть всю поверхность пластины, отжимное покрытие со спин-коатером при 3000 об/мин в течение 30 с и выпекать при 95°C в течение 30 с на горячей плите, чтобы сделать поверхность пластины гидрофобной и, таким образом, обеспечить хорошую производительность покрытия с фоторезистом (PR).
    2. Нанесите положительный PR (Таблица материалов) с достаточным объемом, чтобы покрыть всю поверхность пластины, открутите покрытие со скоростью 3000 об/мин в течение 30 с и выпекайте при 100 °C в течение 90 с на конфорке. Спин-покрытие PR имеет толщину 500 нм.
    3. Экспонируйте пластину с PR-покрытием ультрафиолетовым светом (длина волны 365 нм и интенсивность 20 мВт/см2) в течение 5 с через хромовую маску (рисунок 2A-D) с помощью элайнера.
    4. Разработайте PR на 1 мин с помощью разработчика (Таблица материалов) и промойте пластину, погрузив ее в деионизированную (DI) воду 2x. Полностью высушите пластину с PR-узором, выдувая газ N2 на поверхность пластины.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следует проявлять крайнюю осторожность при надавливании газаN2 на пластину Si, потому что пластина очень тонкая и хрупкая. Не выдувайте газN2 с высоким давлением в направлении, перпендикулярном пластине, так как это может привести к разрушению пластины.
  3. Шаблон SixNy.
    1. Травите экспонированный SixNy по схеме PR с помощью лабораторного реакционноспособного ионного травильного устройства (RIE) с газом гексафторида серы (SF6) 3 sccm при радиочастотной (RF) мощности 50 Вт. Скорость травления с этими настройками составляет ~6 Å/s. Установите время травления в зависимости от толщины нанесенного слоя SixNy .
      ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость травления может варьироваться и нуждаться в лабораторной оптимизации в зависимости от спецификаций используемого оборудования RIE.
    2. Устраните PR, погрузив пластину с узором SixNy в ацетон комнатной температуры на 30 минут с последующим ополаскиванием пластины, погружая ее в воду DI 2x. Полностью высушите пластину, выдув газ N2 на поверхность пластины.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следует проявлять крайнюю осторожность при погружении или извлечении пластины из растворов, поскольку пластина может быть разрушена поверхностным натяжением раствора. Не погружайте и не вынимайте пластину параллельно поверхности раствора. Используйте прецизионные пинцеты для обработки пластин с наконечниками из углеродного волокна. Не сильно хватайте пластину пинцетом; поднимите одну сторону пластины до тех пор, пока пластина не наклонится под углом, где ее можно вынуть из раствора. Пластина может сломаться, когда она сгибается из-за твердого захвата во время подъема.
  4. Выгравируйте Si.
    1. Приготовьте 1,5 М раствора гидроксида калия (KOH), растворив порошок KOH в воде DI при 80 °C.
    2. Погрузите пластину с узором SixNy в раствор KOH для травления открытого Si. Оставьте пластину в растворе с перемешиванием до тех пор, пока отдельно стоящие окна SixNy не будут наблюдаться на противоположной стороне узорчатого SixNy.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время влажного травления может отличаться в зависимости от толщины Si; для пластины толщиной 100 мкм влажное травление обычно занимает несколько часов. Не устанавливайте слишком высокую скорость перемешивания во время травления Si, потому что отдельно стоящие окна SixNy очень тонкие и могут быть разрушены потоком жидкости. В этом эксперименте скорость перемешивания была установлена на 250 об/мин.
    3. Очистите травленую пластину, окунув ее несколько раз в водяную баню DI, чтобы устранить остатки травления. Высушите пластину на воздухе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следует проявлять крайнюю осторожность при погружении или извлечении кремниевой узорчатой пластины из растворов, поскольку отдельно стоящие окна SixNy очень тонкие и хрупкие и могут быть разрушены поверхностным натяжением раствора. Пластину следует погружать или вынимать под углом, чтобы край пластины входил и выходил из раствора первым.
  5. Удалите остатки травления KOH.
    1. Слегка нажмите на границы массива микросхем пинцетом, чтобы получить массив чипов, которые будут микроструктурированными (рисунок 1B).
    2. Приготовьте 1,5 М КОН раствора при 80 °C с перемешиванием.
    3. Погрузите массив микросхем в раствор KOH на 30 с и промойте его, окунув в воду DI 2x. Полностью высушите стружку путем выдувания газа N2 .
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следует проявлять крайнюю осторожность при погружении стружки в растворы и сушке их феном с помощью газа N2, потому что отдельно стоящие окна SixNy очень тонкие и хрупкие. Пока чип погружен в раствор KOH, перемешивание следует прекратить. Стружку следует опускать своими краями сначала в направлении, перпендикулярном раствору, и продувать газомN2 в параллельном направлении.
    4. Полностью высушите массив микросхем в воздухе в течение не менее 1 ч.
  6. Шаблон PR.
    1. Подготовьте пустую пластину Si 525 мкм в качестве твердой подложки. Spin покройте Кремниевую пластину шлемами и положительным PR, как описано выше, но прикрепите массив чипов (с отдельно стоящей стороной окна SixNy вверх) на пластину Si перед выпечкой PR. PR действует как клей между пластиной и массивом чипов. Выпекайте Кремниевую пластину, прикрепленную к массиву микросхем, при 100 °C в течение 90 с на конфорке.
    2. Спин-покрытие чипсета HMDS и положительным PR, как описано выше.
    3. Экспонируйте чипсет ультрафиолетовым светом (длина волны 365 нм; интенсивность 20 мВт/см2) в течение 5 с через хромовую маску (рисунок 2E,F) с помощью элайнера.
    4. Разработайте PR с использованием разработчика в течение 15 с, промойте чипсет, окунув его в воду DI 2x, и полностью высушите чипсет с шаблоном PR, выдувая газ N2 .
  7. Подготовьте микроструктурированный SixNy.
    1. Травление SixNy по шаблону PR с использованием лабораторного RIE, с 3 sccm SF6 газа при мощности RF 50 Вт. Контролируйте время травления в зависимости от толщины слоя SixNy .
  8. Исключите PR.
    1. Устраните PR, погрузив набор микросхем с узорчатым рисунком в раствор 1-метил-2-пирролидинона (NMP) при 60 °C и оставив его на ночь. Промойте чипсет, окунув его в воду DI 2x, и полностью высушите узорчатый чипсет путем выдувания газа N2 .
    2. Устраните остатки PR с помощью плазменного процесса O2 с использованием газа 100 sccm O2 при мощности ВЧ 150 Вт в течение 1 мин с помощью лабораторного RIE.
  9. Промойте микроструктурированный чип.
    1. Готовят 1,5 М КОН раствора при 80 °C.
    2. Погрузите микроструктурированные чипы в раствор KOH на 30 с, чтобы полностью устранить остатки PR и промыть чипы, погружая их в воду DI 2x. Полностью высушите стружку путем выдувания газа N2 .
    3. Полностью высушите стружку на воздухе не менее 1 ч.
  10. Перенос оксида графена (GO) методом капельного литья.
    1. Разбавляйте раствор ГО (2 мг/мл) до 0,2 мг/л водой DI и ультразвуком в течение 10 мин для расщепления агрегатов листов ГО. Центрифугировать разбавленный раствор ГО при 300 х г в течение 30 с.
    2. Тлеющий разряд Si-травленой стороны микроструктурированного чипа для визуализации поверхности чипа с положительным зарядом с помощью тлеющего разряда (Таблица материалов) при 15 мА в течение 1 мин.
    3. Опустите 3 мкл раствора GO на светящуюся разряженную сторону микроструктурированного чипа и оставьте каплю на чипе в течение 1 минуты. Через 1 мин смойте лишний раствор GO на чипе фильтровальной бумагой.
    4. Промыть чип, перенесенный GO, каплями воды DI, приготовленными на парафиновой пленке, и смыть воду DI на чипе фильтровальной бумагой. Повторите эту процедуру 2x на передаваемой стороне GO и 1x на противоположной стороне. Высушите ГО-переносной стружки при комнатной температуре в течение ночи.
    5. Вымойте микроструктурированный чип с помощью окон GO, погрузив его в воду DI, и высушите чип газом N2 .

2. Крио-ЭМ визуализация

  1. Подготовьте криоблик.
    1. Подготовьте криообразец с помощью механической криокоотопляющей машины (Таблица материалов), которая контролирует температуру, влажность, время промокания и силу. После загрузки прокладки на блоттеры убедитесь, что влажность и температура в камере поддерживаются на уровне 100% и 15 °C соответственно.
    2. Возьмите микроструктурированный чип с типичным крио-пинцетом и загрузите пинцет в крио-погружную машину. Пипетируйте 3 мкл раствора образца на микроструктурированный чип со стороны с рисунком отверстия, с окнами GO внизу. Контролируйте время и силу промокания в зависимости от образца раствора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь для крио-ЭМ визуализации использовались биологические образцы, а именно вирус иммунодефицита человека (ВИЧ-1), ферритин, протеасома 26S, groEL, частицы белка апоферритина и белки тау-нитей. Кроме того, различные типы неорганических материалов, такие как наночастицы Fe2O3 (NP), наночастицы Au, наностержни Au и наночастицы кремнезема, использовались для крио-ЭМ визуализации. Нужное время и сила промокания были установлены на криокливне для различных типов образцов.
    3. После процесса промокания немедленно заморозьте чип, загруженный образцом, в жидком этане. Перенесите чип в сетку в жидком азоте (LN2) и сохраните его в LN2 перед крио-ЭМ-визуализацией.
  2. Проводите крио-ЭМ визуализацию.
    1. Загрузите криообразец в крио-ЭМ-держатель с температурой-180 °C.
    2. Загрузите держатель крио-ЭМ в ТЕА и наблюдайте за образцами в режиме системы минимальной дозы (MDS).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Микроструктурированный чип с окнами GO был изготовлен путем изготовления MEMS и передачи нанолиста 2D GO. Чипы для микроструктурирования производились серийно, причем около 500 чипов производились из одной пластины 4 (рисунок 1B и рисунок 2A, B). Конструкциями микроструктурированных чипов можно манипулировать, используя различные конструкции хромовой маски (рисунок 2) во время процедуры фотолитографии. Изготовленные...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь представлены процессы микрофабрикации для производства микроструктурированных чипов с окнами GO. Изготовленный микроструктурированный чип предназначен для регулирования толщины стекловидного слоя льда путем контроля глубины микроотверстия с помощью окон GO в зависимости от размера анализируемого материала. Микроструктурированный чип с окнами GO был изготовлен с использованием серии методов MEMS и метода передачи 2D-нанолистов (рисунок 1). Основным преимуществом использования метода изг...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M.-H.K., S.K., M.L. и J.P. признают финансовую поддержку со стороны Института фундаментальных наук (грант No. IBS-R006-D1). S.K., M.L. и J.P. признают финансовую поддержку со стороны Creative-Pioneering Researchers Program через Сеульский национальный университет (2021) и грант NRF, финансируемый корейским правительством (MSIT; Грант Nos. NRF-2020R1A2C2101871 и NRF-2021M3A9I4022936). M.L. и J.P. признают финансовую поддержку со стороны POSCO Science Fellowship of POSCO TJ Park Foundation и грант NRF, финансируемый корейским правительством (MSIT; Номер гранта НРФ-2017R1A5A1015365). J.P. признает финансовую поддержку из гранта NRF, финансируемого корейским правительством (MSIT; Номер гранта NRF-2020R1A6C101A183) и междисциплинарные исследовательские инициативные программы Инженерного колледжа и Медицинского колледжа Сеульского национального университета (2021). M.-H.K. признает финансовую поддержку из гранта NRF, финансируемого корейским правительством (MSIT; Номер гранта НРФ-2020R1I1A1A0107416612). Авторы благодарят сотрудников и экипаж Центра макромолекулярной и клеточной визуализации Сеульского национального университета (SNU CMCI) за их неустанные усилия и настойчивость в крио-ЭМ-экспериментах. Авторы благодарят S. J. Kim из Национального центра межуниверситетских исследовательских учреждений за помощь в экспериментах FIB-SEM.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1-метил-2-пирролидинон (NMP)Sigma Aldrich, США443778
Acetone
AFMPark Systems, Южная КореяNX-10
AlignerMidas System, Южная КореяMDA-600S
AZ 300 MIF разработчикAZ Electronic Materials США Corp., США184411
держательCryo-EMГатан, США626 однонаклонный крио-ЭМ держатель
Крио-погружающаяся машинаThermo Fisher SCIENTIFIC, СШАVitrobot Mark IV
Сфокусированная ионно-лучевая сканирующая электронная микроскопия (FIB-SEM)Компания FEI, СШАГелиос НаноЛаб 650
Разрядник свеченияTed Pella Inc., СШАPELCO легкое решение для оксида
Aldrich, США
Hexamethyldisizazne (HMDS), 98+%Alfa Aesar, США10226590
Химическое осаждение из газовой фазы низкого давления (LPCVD)Centrotherm, ГерманияLPCVD E1200
maP1205 положительная технология PRMicro resistГермания A15139
Гидроксид калия (KOH), чешуйкиDAEJUNG CHEMICALS & METALS Co. LTD., Южная Корея6597-4400
Рамановский спектрометрNOST, ЮжнаяКорея Конфокальная микрорамановская система HEDA
Реактивный ионный травитель (RIE)Научная инженерия, Южная КореяЛабораторный
SEMCarl Zeiss, ГерманияSUPRA 55VP
Si пластинаJP COMMERCE, Южная4" Кремниевая пластина, тип P(B), (100), 1-30 Ом м, DSP, T: 100 мкм
Прядильная машинаDong Ah Trade Corp., Южная КореяACE-200
TEMJEOL, ЯпонияJEM-2100F
графена (GO) Sigma 763705, Корея

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dillard, R. S., et al. Biological applications at the cutting edge of cryo-electron microscopy. Microscopy and Microanalysis. 24 (4), 406-419 (2018).
  2. Meyerson, J. R., et al. Self-assembled monolayers improve protein distribution on holey carbon cryo-EM supports. Scientific Reports. 4, (2014).
  3. Palovcak, E., et al. A simple and robust procedure for preparing graphene-oxide cryo-EM grids. Journal of Structural Biology. 204 (1), 80-84 (2018).
  4. Xu, B. J., Developments Liu, L. applications, and prospects of cryo-electron microscopy. Protein Science. 29 (4), 872-882 (2020).
  5. Stewart, P. L. Cryo-electron microscopy and cryo-electron tomography of nanoparticles. Wiley Interdisciplinary Reviews-Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9 (2), (2017).
  6. Murata, K., Wolf, M. Cryo-electron microscopy for structural analysis of dynamic biological macromolecules. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1862 (2), 324-334 (2018).
  7. Darrow, M. C., et al. Chameleon: next generation sample preparation for cryoEM based on spotiton. Acta Crystallographica a-Foundation and Advances. 75, 424(2019).
  8. Hite, R. K., Tao, X., MacKinnon, R. Structural basis for gating the high-conductance Ca2+-activated K+ channel. Nature. 541 (7635), 52-57 (2017).
  9. Zhang, Y., et al. Cryo-EM structure of the activated GLP-1 receptor in complex with a G protein. Nature. 546 (7657), 248-253 (2017).
  10. Shaik, M. M., et al. Structural basis of coreceptor recognition by HIV-1 envelope spike. Nature. 565 (7739), 318-323 (2019).
  11. Liu, C., et al. The architecture of inactivated SARS-CoV-2 with postfusion spikes revealed by cryo-EM and cryo-ET. Structure. 28 (11), 1218-1224 (2020).
  12. Ren, X. C., Zhang, X. Q., Xu, R., Huang, J. Q., Zhang, Q. Analyzing energy materials by cryogenic electron microscopy. Advanced Materials. 32 (24), 1908293(2020).
  13. Li, Y. Z., et al. Atomic structure of sensitive battery materials and Interfaces revealed by cryo-electron microscopy. Science. 358 (6362), 506-510 (2017).
  14. Li, Y. B., Huang, W., Li, Y. Z., Chiu, W., Cui, Y. Opportunities for cryogenic electron microscopy in materials science and nanoscience. Acs Nano. 14 (8), 9263-9276 (2020).
  15. Kim, Y., et al. Uniform synthesis of palladium species confined in a small-pore zeolite via full ion-exchange investigated by cryogenic electron microscopy. Journal of Materials Chemistry A. 9 (35), 19796-19806 (2021).
  16. Baumgartner, J., et al. Nucleation and growth of magnetite from solution. Nature Materials. 12 (4), 310-314 (2013).
  17. Rice, W. J., et al. Routine determination of ice thickness for cryo-EM grids. Journal of Structural Biology. 204 (1), 38-44 (2018).
  18. D'Imprima, E., et al. Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it. Elife. 8, 42747(2019).
  19. Alden, N. A., et al. Cryo-EM-on-a-chip: custom-designed substrates for the 3D analysis of macromolecules. Small. 15 (21), 1900918(2019).
  20. Naydenova, K., Peet, M. J., Russo, C. J. Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (24), 11718-11724 (2019).
  21. Kang, M. H., et al. Graphene oxide-supported microwell grids for preparing cryo-EM samples with controlled ice thickness. Advanced Materials. 33 (43), 2102991(2021).
  22. Johra, F. T., Lee, J. W., Jung, W. G. Facile and safe graphene preparation on solution based platform. Journal of Industrial and Engineering Chemistry. 20 (5), 2883-2887 (2014).
  23. Yang, C., Pham, J. Characteristic study of silicon nitride films deposited by LPCVD and PECVD. Silicon. 10 (6), 2561-2567 (2018).
  24. Olson, J. M. Analysis of LPCVD process conditions for the deposition of low stress silicon nitride. Part I: preliminary LPCVD experiments. Materials Science in Semiconductor Processing. 5 (1), 51-60 (2002).
  25. Zheng, B. R., Zhou, C., Wang, Q., Chen, Y. F., Xue, W. Deposition of low stress silicon nitride thin film and its application in surface micromachining device structures. Advances in Materials Science and Engineering. 2013, 835942(2013).
  26. Chuang, W. H., Fettig, R. K., Ghodssi, R. An electrostatic actuator for fatigue testing of low-stress LPCVD silicon nitride thin films. Sensors and Actuators a-Physical. 121 (2), 557-565 (2005).
  27. Shafikov, A., et al. Strengthening ultrathin Si3N4 membranes by compressive surface stress. Sensors and Actuators a-Physical. 317, 112456(2021).
  28. Ng, W. H., et al. Controlling and modelling the wetting properties of III-V semiconductor surfaces using re-entrant nanostructures. Scientific Reports. 8, 3544(2018).
  29. Han, D., et al. Nanopore-templated silver nanoparticle arrays photopolymerized in zero-mode waveguides. Frontiers in Chemistry. 7, 216(2019).
  30. Escobedo, C. On-chip nanohole array based sensing: a review. Lab Chip. 13, 2445-2463 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cryogenic Electron MicroscopyMicro Patterned ChipControlled Ice ThicknessGraphene Oxide WindowSilicon Nitride MembraneUV PhotolithographyChemical Vapor DepositionReactive Ion EtchingHigh Throughput ImagingBiomolecule Structure Analysis

Related Articles