Создание ксенотрансплантатов, полученных от пациентов с рыбками данио, из рака поджелудочной железы для тестирования на химиочувствительность

Одна из проблем клинических исследований рака заключается в том, что рак – это не отдельное заболевание, а множество различных заболеваний, которые могут развиваться с течением времени, требуя специфических методов лечения в зависимости от особенностей самой опухоли^{и пациента1}. Следовательно, задача состоит в том, чтобы перейти к исследованиям рака, ориентированным на пациента, чтобы определить новые персонализированные стратегии для раннего прогнозирования результатов лечения рака². Это особенно актуально для аденокарциномы протоков поджелудочной железы (PDAC), поскольку она считается трудно поддающимся лечению раком с 5-летней выживаемостью 11%³.

Поздняя диагностика, быстрое прогрессирование и отсутствие эффективных методов лечения остаются наиболее актуальными клиническими проблемами PDAC. Таким образом, основная задача состоит в том, чтобы смоделировать пациента и определить биомаркеры, которые могут быть применены в клинике, чтобы выбрать наиболее эффективную терапию в соответствии с персонализированной медициной ^4,5,6. Со временем были предложены новые подходы к моделированию раковых заболеваний: органоиды, полученные от пациента (PDO), и ксенотрансплантаты, полученные от пациентов от мышей (mPDX), происходят из источника опухолевой ткани человека. Они были использованы для воспроизведения заболевания для изучения ответа и резистентности к терапии, а также рецидива заболевания ^7,8,9.

Аналогичным образом, возрос интерес к моделям ксенотрансплантатов, полученных из пациентов (zPDX) на основе рыбок данио, благодаря их уникальным и многообещающим характеристикам¹⁰, представляющим собой быстрый и недорогой инструмент для исследования рака^11,12. Модели zPDX требуют лишь небольшого размера выборки опухоли, что делает возможным высокопроизводительный скрининг химиотерапии¹³. Наиболее распространенный метод, используемый для моделей zPDX, основан на полном переваривании образца и имплантации первичных клеточных популяций, что частично воспроизводит опухоль, но имеет недостатки в виде отсутствия микроокружения опухоли и перекрестных помех между злокачественными и здоровыми клетками¹⁴.

Эта работа показывает, как zPDX могут быть использованы в качестве доклинической модели для определения профиля химиочувствительности пациентов с раком поджелудочной железы. Ценная стратегия облегчает процесс ксенотрансплантата, поскольку нет необходимости в расширении клеток, что позволяет ускорить химиотерапевтический скрининг. Сила модели заключается в том, что все компоненты микроокружения сохраняются в том виде, в каком они находятся в раковой ткани пациента, поскольку, как известно, поведение опухоли зависит от их взаимодействия^15,16. Это очень выгодно по сравнению с альтернативными методами в литературе, поскольку можно сохранить гетерогенность опухоли и способствовать улучшению предсказуемости исхода лечения и рецидива в зависимости от конкретного пациента, что позволяет использовать модель zPDX в совместных клинических испытаниях. В этой рукописи описываются этапы, связанные с созданием модели zPDX, начиная с фрагмента резекции опухоли пациента и его лечения для анализа ответа на химиотерапию.

Министерство здравоохранения Италии одобрило все описанные эксперименты на животных в соответствии с Директивой 2010/63/ЕС об использовании животных и уходе за ними. Местный этический комитет одобрил исследование под регистрационным номером 70213. Информированное согласие было получено от всех вовлеченных субъектов. Перед запуском следует подготовить все растворы и оборудование (раздел 1) и скрестить рыбу (раздел 2).

1. Приготовление растворов и оборудования

ПРИМЕЧАНИЕ: В таблице 1 приведены решения и среды, которые необходимо подготовить.

1. Агарозная гелевая поддержка
   1. Взвесьте порошок агарозы в колбе для микроволновой печи и растворите его в заданном объеме среды рыбок данио-рерио E3, чтобы получился 1% гель. Нагревайте в микроволновой печи до полного растворения агарозы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не перекипятите раствор.
   2. Вылейте растопленную агарозу в чашку Петри и дождитесь, пока гель полностью застынет.
   3. Сделайте небольшие агарозные цилиндры (высотой ~5 мм) с помощью пластиковой пипетки Пастера с отрезанным наконечником. После приготовления хранить в чашке Петри при температуре 4 °C, завернутой в алюминиевую фольгу.
2. Стеклянные микроиглы
   1. Потяните за капилляры боросиликатного стекла с помощью съемника, чтобы получить тонкие иглы (настройки: HEAT 990, PULL 550).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Из одного капилляра можно получить две тонкие иглы с диаметром кончика 10 мкм.

2. Скрещивание рыбы и сбор яиц

1. Переведите взрослых рыб в резервуары для разведения за 3 дня до имплантации ткани, как описано Avdesh et ^al.17.
2. ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется соотношение мужчин и женщин 1:1 или 2:3. Плотность рыбы должна составлять максимум пять рыб на литр воды. Держите самцов и самок отдельно барьером на ночь.
3. На следующий день снимите барьер и дайте рыбкам спариться.
4. Извлеките рыбу из резервуаров для разведения и верните ее в резервуары для содержания.
5. Вылейте воду из емкости для разведения через мелкоячеистую сетку. Переложите оплодотворенные яйца в чашку Петри со средой для рыбок данио-рерио E3.
6. Проверьте чашку Петри стереомикроскопом и выбросьте мутные яйца. Храните оплодотворенные яйца в свежей среде для рыбок данио-рерио E3 при температуре 28 °C.

3. Сбор образцов

ПРИМЕЧАНИЕ: Автоклавные щипцы и ручка скальпеля.

1. Немедленная обработка
   1. Соберите хирургический образец опухоли в 10 мл опухолевой среды при 4 ° C (образец опухоли от 5 мм до 10 мм в диаметре). Перенесите образец при температуре 4 °C из нужного места для немедленной обработки.
2. Хранение на ночь (опционально)
   1. Соберите образец хирургической опухоли в 10 мл опухолевой среды и храните образец в течение ночи при температуре 4 ° C.
3. Хранение при температуре -80 °C (опционально, не рекомендуется)
   1. Хранят образец при -80 °C в криогенном флаконе с опухолевой средой с добавлением 5% диметилсульфоксида (ДМСО).

4. Обработка образцов

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните шаги под вытяжкой ламинарного потока стерильной культуры тканей.

1. Промойте всю опухолевую ткань 5 мл свежей опухолевой среды, пипеткой вверх и вниз 10 раз с помощью пластиковой пипетки Пастера. Аспирируйте и выбросьте моющее средство. Повторите этот шаг 3 раза.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте аспирации опухолевой ткани, так как она может оставаться прикрепленной к пластиковой пипетке Пастера.
2. Перенесите образец в чашку Петри и погрузите его в 1-2 мл свежей опухолевой среды. Разрезают образец опухоли на мелкие кусочки (1-2^мм3) с помощью лезвия скальпеля и помещают их в стерильную пластиковую пробирку объемом 5 мл с опухолевой средой.
3. Установите измельчитель тканей McIlwain на толщину 100 мкм. Поместите фрагменты образца на круглый пластиковый стол измельчителя и измельчите их. Поверните стол на 90° и повторите измельчение.
4. Центрифугируют фрагменты при 300 × г в течение 3 мин. Затем осторожно аспирируйте надосадочную жидкость и выбросьте ее.
5. Инкубируйте фрагменты с помощью флуоресцентного трекера клеток, CM-DiI (конечная концентрация 10 мкг/мл в фосфатном буферном физиологическом растворе Dulbecco [DPBS]), Deep Red (конечная концентрация 1 мкл/мл в DPBS) или CellTrace (конечная концентрация 5 мкМ в DPBS) в течение 30 мин, помещая пробирку на водяную баню с температурой 37 °C.
6. Ресуспендируйте фрагменты, осторожно пипетируя вверх и вниз каждые 10 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В случае CellTrace добавьте среду, содержащую не менее 1% белка, в конце инкубации в соответствии с инструкциями производителя.
7. Центрифугу при 300 х г в течение 3 мин и выбросьте надосадочную жидкость. Повторите этот шаг 3 раза с 1 мл DPBS, чтобы удалить неинкорпорированный краситель.
8. Суспендировать фрагменты в 5 мл DPBS в чашке Петри диаметром 60 мм.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за тем, чтобы ткань не пересыхала.

5. Создание zPDX

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните шаги под вытяжкой ламинарного потока стерильной культуры тканей.

1. Анестезируют эмбрионы через 2 дня после оплодотворения (АКДФ) 0,16 мг / мл трикаина в среде рыбок данио-рерио E3.
2. Поместите три агарозных цилиндра (шаг 1.1.3) в чашку Петри и положите эмбрион рыбки данио-рерио на цилиндр, обнажив одну сторону. Удалите излишки раствора, чтобы сохранить эмбрион в тонкой пленке.
3. Перенесите кусочек окрашенной ткани стерильными щипцами из чашки Петри в 1%-ную агарозную подложку, где лежит эмбрион. Возьмите ткань, положите ее поверх желтка эмбриона, а затем протолкните ее в перивителлиновое пространство с помощью термовытянутой стеклянной микроиглы (шаг 1.2.1).
4. Аккуратно добавьте несколько капель E3 1% пенициллин-стрептомицин (Pen-Strep) к эмбриону, чтобы вернуть его в жидкость.
5. Повторите шаги 5.2-5.4 для всех эмбрионов и, наконец, снимите агарозные подложки с чашки Петри и инкубируйте эмбрионы при 35 ° C.
6. Проверьте эмбрионы на наличие правильных ксенотрансплантатов (положительное окрашивание) через 2 ч после имплантации с помощью флуоресцентного стереомикроскопа. Отбрасывают эмбрионы с опухолевыми фрагментами, которые не полностью находятся внутри перивителлинового пространства, а также мертвые эмбрионы. Случайным образом распределите эмбрионы по шести многолуночным планшетам (максимум n = 20 эмбрионов в лунку), поровну разделенных на группы в соответствии с планом эксперимента (например, контрольная группа и FOLFOXIRI).

6. Лечение

1. Разбавьте препарат (например, 5-фторурацил, оксалиплатин, иринотекан) в E3 1% Pen-Strep, тщательно перемешав, пипеткой вверх и вниз несколько раз. Как было предложено Usai et ^al.12, используют пятикратное разведение препарата в рыбной воде по отношению к эквивалентной концентрации в плазме (EPC).
2. Смешайте препараты для приготовления коктейля (например, FOLFOXIRI).
3. Извлеките носитель из каждой лунки и добавьте лекарственный коктейль через 2 ч после имплантации.
4. Обрабатывайте эмбрионы в течение 3 дней. Обновляйте лекарственный коктейль каждый день.

7. Цельное иммунофлюоресцентное окрашивание

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом работы поместите ацетон при -20 ° C и приготовьте растворы, перечисленные в таблице 1.

1. День 1:
   1. Зафиксируйте личинки 1 мл 4% параформальдегида в стеклянных флаконах при температуре 4 ° C на ночь.
2. День 2:
   1. Вымойте личинок 3 раза 5 мин 1 мл PBS, осторожно перемешивая на коромысле лабораторной платформы (400 об/мин).
   2. Хранить в 1 мл 100% метанола при температуре -20 °C в течение ночи (или для длительного хранения).
   3. Регидратируйте 3 x 10 мин с 1 мл PTw (0,1% tween в PBS), осторожно перемешивая на коромысле лабораторной платформы (400 об/мин).
   4. Пермеабилизируют 1 мл 150 мМ Tris-HCl при рН 8,8 в течение 5 мин при RT с последующим нагреванием в течение 15 мин при 70 °C.
   5. Промывайте 2 раза 10 мин 1 мл PTw, осторожно перемешивая на коромысле лабораторной платформы (400 об/мин).
   6. Промывайте 2 x 5 мин 1 мл dH₂O, осторожно перемешивая на коромысле лабораторной платформы (400 об/мин).
   7. Пермеабилизировать 1 мл ледяного ацетона в течение 20 мин при -20 °C.
   8. Промывайте 2 x 5 мин 1 мл dH₂O, осторожно перемешивая на коромысле лабораторной платформы (400 об/мин).
   9. Промыть 2 x 5 мин 1 мл PTw, осторожно перемешивая на коромысле лабораторной платформы (400 об/мин).
   10. Инкубируют личинок в 1 мл блокирующего буфера в течение 3 ч при 4 °C, осторожно перемешивая на коромысле лабораторной платформы (400 об/мин).
   11. Поместите личинок в луночные пластины, разделенные по группам следующим образом: 10 личинок в 50 мкл объема/лунка в 96-луночном планшете или 20 личинок в 100 мкл объема/лунки в 48-луночном планшете.
   12. Откажитесь от блокирующего буфера, инкубируйте личинки раствором первичных антител (например, расщепленной каспазой-3 кролика против человека, 1:250), разведенным в инкубационном буфере на ночь при 4 ° C в темноте, и осторожно покачайте на шейкере (400 об/мин). Рекомендуемые тома см. в шаге 7.2.11.
3. День 3:
   1. Вымойте личинок последовательно 3 х 1 ч с 1 мл PBS-TS (10% козьей сыворотки, 1% Triton X-100 в PBS), а затем через 2 x 10 мин с 1 мл PBS-T (1% Triton X-100 в PBS) и 2 x 1 ч с 1 мл PBS-TS. При каждой стирке аккуратно перемешивайте пластины с личинками на шейкере (400 об/мин).
   2. Инкубируйте личинок с конъюгированными флуоресцентными красителями вторичными антителами (например, перекрестно-адсорбированным вторичным антителом козьего антикролика IgG [H+L], Alexa Fluor 647, 1:500) и 100 мкг/мл Hoechst 33258, разведенным в инкубационном буфере в темноте в течение ночи при 4 °C, при осторожном перемешивании на шейкере (400 об/мин). Рекомендуемые объемы раствора вторичных антител см. в шаге 7.2.11.
4. День 4:
   1. Промыть 3 x 1 ч с 1 мл PBS-TS и 2 x 1 ч с 1 мл PTw при осторожном перемешивании на шейкере (400 об/мин).
   2. Создайте круговой слой эмали (толщиной ~0,5-1 мм) на предметных стеклах микроскопа. Дайте эмали высохнуть и поместите личинки в центр круглого слоя, обнажив сторону ксенотрансплантата.
   3. Высушите излишки раствора и установите на стекло покровное стекло водорастворимой нефлуоресцирующей монтажной средой.

8. Визуализация

1. Получение изображений под конфокальной микроскопией с 40-кратным объективом. Используйте следующие параметры сбора данных: разрешение 1024 x 512 пикселей с шагом по оси Z 5 мкм.

9. Анализ апоптоза с помощью ImageJ

1. Загрузите (Фиджи просто) программное обеспечение ImageJ (https://imagej.net/Fiji/Downloads) и откройте образ файла Z-stack (нажмите «Файл» | Открытый). Во всплывающем окне выберите Stack viewing/Hyperstack и нажмите OK.
2. Наложите различные каналы, выбрав «Изображение» | Цвет | Сделайте композитный.
3. Перетащите полосу Z в нижней части изображения, чтобы просмотреть изображение Z-стека и определить область ксенотрансплантата (клетки, которые являются положительными для флуоресцентного трекера клеток. См. шаг 4.5) в перивителлийном пространстве рыбок данио.
4. Выберите инструмент «Точка» и подсчитайте количество апоптотических клеток человека (от положительного до флуоресцентного трекера клеток и расщепленной каспазы-3), как показано в дополнительном видео S1.
5. Дважды щелкните значок Point Tool , измените счетчик и подсчитайте общее количество ядер клеток человека (ядер CM-DiI-положительных клеток).

Этот протокол описывает экспериментальный подход к установлению zPDX из первичной аденокарциномы поджелудочной железы человека. Образец опухоли собирали, измельчали и окрашивали с использованием флуоресцентного красителя, как описано в разделе протокола 4. Затем zPDX были успешно установлены путем имплантации фрагмента опухоли в перивителлиновое пространство 2 эмбрионов рыбок данио-рерио, как описано в разделе 5 протокола. Как описано в разделе 6 протокола, zPDX были дополнительно проверены для выявления профилей чувствительности к химиотерапии раковых клеток, полученных от пациента. Например, была протестирована комбинация химиотерапии FOLFOXIRI (5-фторурацил, фолиновая кислота, оксалиплатин и иринотекан), поскольку она используется в качестве химиотерапии первой линии при прогрессирующей аденокарциноме протоков поджелудочной железы и при метастатическом колоректальном раке. Изображения zPDX были получены в виде Z-стеков на конфокальном микроскопе, а индукция апоптоза была проанализирована, как описано в разделах 8 и 9 протокола. Как показано на рисунке 1А,В, комбинированная терапия приводила к увеличению апоптоза клеток по сравнению с контрольной группой. В тематическом исследовании, представленном здесь, было выявлено статистически значимое увеличение доли апоптотических клеток в имплантированных ксенотрансплантатах для группы, получавшей FOLFOXIRI, по сравнению с контрольной группой (рис. 1C).

Таблица 1: Решения и носители, используемые в протоколе.

Дополнительный рисунок S1: Образец опухоли PDAC был окрашен в зеленый цвет и ксенотрансплантирован в перивителлиновое пространство 2 эмбрионов рыбок данио-рерио. После 3-дневного инкубационного периода zPDX вводили 2 мкг/мл йодида пропидия (PI; красный), а затем подвергали 3D-конфокальной визуализации. Жизнеспособность клеток проверяли путем измерения PI-положительных клеток из общего числа клеток человека (DiO-положительных). Масштабная линейка = 100 мкм. Сокращения: PDAC = аденокарцинома протоков поджелудочной железы; DPF = дни после оплодотворения; zPDX = ксенотрансплантат, полученный от пациента рыбок данио. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительное видео S1: Пример апоптотического подсчета клеток человека с использованием многоточечного инструмента ImageJ. Видео представляет собой Z-стек zPDX через 3 дня после имплантации, полученный после расщепления каспазы-3 и иммуноокрашивания Hoechst 33258. Сокращения: zPDX = ксенотрансплантат, полученный от пациента рыбок данио. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

У авторов нет конфликтов интересов, о которых можно было бы заявить.