Методическая статья

Поддержание клеточного разнообразия глиобластомы человека Ex vivo с использованием трехмерной органоидной культуры

4.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/63745

⸱

25 августа 2022 г.

 ,  ,  , 
1Department of Neurological Surgery, Cleveland Clinic, 2Cardiovascular and Metabolic Sciences, Lerner Research Institute, Cleveland Clinic

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы описываем метод генерации органоидов глиобластомы (GBM) из первичных образцов пациента или клеточных культур пациента и поддержания их до зрелости. Эти органоиды GBM содержат фенотипически разнообразные клеточные популяции и воссоздают микроокружение опухоли ex vivo.

Аннотация

Глиобластома (ГБМ) является наиболее часто встречающимся первичным злокачественным раком головного мозга с крайне плохим прогнозом. Внутриопухолевые клеточные и молекулярные различия, а также сложные взаимодействия между микроокружениями опухоли могут сделать поиск эффективных методов лечения проблемой. Традиционные методы адгезивного или сферного культивирования могут маскировать такие сложности, тогда как трехмерная органоидная культура может повторять региональные микроокружательные градиенты. Органоиды представляют собой метод трехмерной культуры GBM, который лучше имитирует архитектуру опухоли пациента, содержит фенотипически разнообразные клеточные популяции и может быть использован для экспериментов со средней пропускной способностью. Хотя трехмерная органоидная культура более трудоемка и трудоемка по сравнению с традиционной культурой, она предлагает уникальные преимущества и может служить для преодоления разрыва между существующими системами in vitro и in vivo . Органоиды зарекомендовали себя как бесценные инструменты в арсенале биологов рака, чтобы лучше понять поведение опухоли и механизмы резистентности, и их применение только продолжает расти. Здесь приведены подробные сведения о методах генерации и поддержания органоидов GBM. Также описаны инструкции о том, как выполнять встраивание и секционирование образца органоида с использованием как замороженных, так и парафиновых методов встраивания, а также рекомендации по протоколам иммуногистохимии и иммунофлуоресценции на органоидных участках и измерению общей жизнеспособности органоидных клеток.

Введение

Глиобластома (GBM) является наиболее часто встречающейся первичной опухолью головного мозга с мрачным прогнозом примерно 15 месяцев с момента постановки диагноза1. Методы лечения, которые эффективны в доклинических исследованиях, часто могут быть плохо эффективными у пациентов 2,3. Плохой клинический ответ объясняется многими факторами, включая микроокружательную гетерогенность GBM и сложные внутриопухолевые взаимодействия. Их может быть трудно воссоздать в лабораторных условиях с помощью традиционных методов адгезивной или сферной культуры4. Наличие подмножества самообновляющихся раковых стволовых клеток (CSC) в GBM также может способствовать этой сложности 5,6. CSC имеют решающее значение для распространения опухоли и поддержания роста опухоли, способствуя активному ангиогенезу, инвазии рака и устойчивости к терапии, включая облучение 7,8,9. CSC не равномерно распределены по опухолям, а скорее обогащаются в определенных микросредах, включая периваскулярную нишу и перинекротические области, каждая из которых обеспечивает четкую молекулярную регуляцию своих клеточных состояний 10,11,12,13,14. CSC не являются пассивными получателями сигналов микросреды, а вместо этого обладают способностью реконструировать свои собственные микросреды 7,15,16. Микроокружение CSC может способствовать поддержанию состояния стволовых клеток в ответ на такие давления, как дефицит питательных веществ, рН и гипоксия 17,18,19,20, что свидетельствует о важности этих условий в модельной системе. Поэтому рекапитуляция разнообразной клеточной микросреды в опухолях имеет решающее значение для понимания терапевтической резистентности и выявления новых методов лечения.

Трехмерная культура возросла в популярности в последниегоды на 21,22. Органоиды использовались в других типах рака, и основная цель поддержания клеток в качестве органоидов заключается в том, чтобы обеспечить рост гетерогенных клеточных популяций (многие из которых обычно могут быть вытеснены в более однородной культуре сферы) и пространственного разнообразия, рассматриваемого как региональные микросреды опухолей с генетической специфичностью 4,23,24,25,26 . Существует множество методов трехмерной культивирования раковых клеток, каждый из которых имеет преимущества и недостатки 27,28,29. Органоидная культура не предназначена для замены традиционной адгезивной или сферной культуры. Его лучше всего использовать в качестве дополнительного метода к двумерным методам, когда есть конкретные вопросы, где взаимодействие между микроокружением клеток и реакциями опухолевых клеток имеет решающее значение.

В этой статье описываются надежные и повторяемые методы получения органоидов GBM из первичных образцов пациентов или культур, полученных от пациента. Мы рассматриваем две различные цели для трехмерной органоидной культуры: (1) создание органоидов из первичной ткани пациента с максимальным потенциалом приживления независимо от однородности или (2) выращивание однородных органоидов для более количественного экспериментального использования. При установлении первичного образца в качестве органоидов нет необходимости фильтровать отдельные клетки или подсчитывать клетки, потому что сохранение максимального количества и типов клеток для установления исходной культуры является приоритетом. Однако при выращивании органоидов для сравнительных экспериментов необходима одноклеточная фильтрация и подсчет клеток, чтобы гарантировать, что реплицируемые органоиды сопоставимы по экспериментальной консистенции. В этом протоколе подробно описывается, как создавать органоидные культуры и создавать однородные органоиды, а также усовершенствованные методы встраивания и сохранения органоидов и стандартные эксперименты с клеточными культурами, включая иммуногистохимию, иммунофлуоресценцию и оценку общей жизнеспособности клеток в органоидах GBM.

Протокол

Все этапы протокола (протоколов), подробно описанного ниже, были разработаны и проведены в соответствии с Протоколом No 2559 Кливлендского совета по институциональному обзору клиник (IRB) и одобрением No 1711 Институционального комитета по биобезопасности (IBC). Сферы и органоиды культивируются в «Нейробазальных средах Complete» (NBMc). Инструкции см. в таблице 1 .

1. Изготовление органоидных форм

  1. Снимите восковую бумагу с листа парапленки (размером примерно 4 см х 4 см) и поместите ее между двумя стерильными пластинами полимеразной цепной реакции (ПЦР) из 96 скважин.
    1. Выполните эти шаги в культуре и позаботьтесь о том, чтобы «внутренняя» парапленка (сторона, которая покрыта бумагой) была чистой. Эта чистая сторона должна делать вогнутость отступов.
  2. Нанесите равномерное давление на верхнюю 96-луночную ПЦР-пластину, чтобы сформировать небольшие ямочки в парапленке. Цель состоит в том, чтобы ямочки были примерно 2 мм в глубину, не создавая отверстий в парапленке.
  3. Осторожно разделите две 96-луночные ПЦР-пластины. Парапленка с ямочками будет прилипать к верхней пластине. Поместите его на сухой лед примерно на 30 с.
  4. После того, как парапленка находилась на сухом льду в течение 30 с, используйте стерильные щипцы, чтобы вытащить парапленку из верхней 96-луночной ПЦР-пластины.
    1. При снятии парапленки используйте быстрое движение, а не будьте очень «осторожны». Замороженную парапленку легче удалить, чем нагретую парапленку, которая может привести к инвертированию ямочек.
  5. Поместите готовую форму для парапленки в закрытую, стерильную 10 см чашку для культивирования клеток. Формы могут быть изготовлены заранее и храниться при сохранении стерильности.

2. Макродиссекция образца ткани пациента

  1. В стерильной чашке для культивирования (пластины для культивирования клеток 10 см) используйте два стерильных лезвия бритвы, чтобы мелко измельчить образец пациента, применяя равномерное давление.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Измельчение образца проще всего, если на блюде для культивирования находится около 500 мкл NBMc. Старайтесь лезвиями бритвы как можно тоньше измельчать кусочки; в идеале, отдельные части составляют 1 мм3 или меньше.
  2. Переложите мелко измельченные кусочки опухоли в центрифужную трубку объемом 15 мл с помощью разрезанного наконечника пипетки p1000.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Всякий раз, когда вы работаете с органоидами, важно использовать только вырезанные наконечники пипетки p1000. Их можно разрезать с помощью острой бритвы до желаемого размера отверстия (примерно от 5 до 8 мм) и автоклавировать.
  3. Добавьте 2 мл раствора для отсоединения клеток комнатной температуры (RT) (Таблица материалов) и поместите его в инкубатор с температурой 37 °C, 5% CO2 в течение приблизительно 10 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Наблюдайте и смешивайте каждые несколько минут. Некоторые растворы или образцы для отслоения клеток могут нуждаться в различном времени инкубации. Если появляется слипание, которое может указывать на высвобождение ДНК из-за лизиса клеток, немедленно переходите к следующему шагу.
  4. Добавьте 8 мл среды NBMc для нейтрализации раствора для отсоединения клеток и вращайте в течение 3 мин при 65 х г.
  5. Аспирировать супернатант и повторно суспендировать ткань в 1-2 мл NBMc.

3. Генерация органоидов из первичной ткани пациента

ПРИМЕЧАНИЕ: Целью изготовления органоидов из первичной ткани пациента является создание трехмерной культуры. Не фильтруйте отдельные ячейки и не подсчитывайте ячейки, но сохраняйте начальную нагрузку ячейки как можно более равномерной с помощью визуального контроля. Нормально иметь неоднородность в росте и становлении исходных органоидов. Каждый органоид будет иметь объем 20 мкл (16 мкл богатого ламином внеклеточного матрикса (lrECM) и 4 мкл ткани, взвешенной в NBMc, со стадии 2,5). Инструкции могут быть скорректированы по количеству предназначенных органоидов; цель состоит в том, чтобы обычно образовывать около 20-30 органоидов из первичных образцов пациента.

  1. В ведро со льдом или холодный блок поместите lrECM и небольшую центрифужную трубку. Поместите соответствующее количество lrECM (16 мкл х X числа предполагаемых органоидов) в небольшую центрифужную трубку.
  2. Добавьте соответствующий объем тканевой суспензии со стадии 2,5 (4 мкл х числа предполагаемых органоидов) в трубку центрифуги на льду.
  3. Аккуратно пипетку 20 мкл смеси lrECM/клеточной суспензии на парапленочные формы; это приведет к образованию жемчужной капли.
    1. Обязательно тщательно перемешайте смесь lrECM/клеточной суспензии; клетки, как правило, легко оседают в lrECM, что приводит к гетерогенным органоидам.
    2. Держите смесь lrECM/клеточной суспензии на льду. Если lrECM нагревается, он может полимеризовать и скомпрометировать образование органоидов. Обязательно охлаждайте наконечник пипетки каждые два-три органоида, чтобы предотвратить полимеризацию lrECM. Не вводите пузырьки воздуха в органоиды (избегайте «двойного нажатия» пипетки).
  4. После того, как нужное количество органоидов пипетируют на парапленочную форму в 10-сантиметровой пластине для культивирования клеток, накрывают крышкой пластины и инкубируют в инкубаторе клеточной культуры при 37 °C, 5% CO2 в течение 1-2 ч.
  5. После того, как органоиды затвердеют, используйте среду NBMc, чтобы аккуратно смыть их с формы парапленки и в новую, стерильную 10 см культуральную пластину с общим количеством NBMc 20 мл. Использование наконечника p1000 лучше всего смывает органоиды с плесени; они будут плавно соскальзывать.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Когда органоиды смываются из плесени в пластины клеточной культуры, они должны быть видны в среде в виде небольших розовых сфер. Если органоиды, по-видимому, развалились или разбились в среде, это указывает на более раннюю проблему с полимеризацией lrECM, и органоиды все еще могут расти, но вряд ли будут однородными по размеру.
  6. Поместите 10 см культуральную чашку в инкубатор для культивирования клеток при 37 °C, 5% CO2 (без встряхивания) в течение 4 дней.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Размещение органоидов на орбитальном шейкере в первые дни может привести к их развалу. Убедитесь, что они не трясутся до 4-го дня.
  7. Через 4 дня обменивают среду и помещают на орбитальный шейкер при 80 об/мин в инкубатор клеточной культуры при 37 °C, 5% CO2.
    1. Обмен носителями с незрелыми органоидами является сложной задачей, потому что их трудно визуализировать. Наклоните чашку для культивирования клеток и подождите не менее 20 с; органоиды будут оседать на дне и позволят медленно удалять среду сверху стеклянной или пластиковой пипеткой 10-20 мл.
    2. Обратите пристальное внимание на сбор органоидов внизу; если они кажутся перемешанными с силой удаления носителя, лучше всего сделать паузу и позволить им переселиться. По мере того, как органоиды созревают и их легче визуализировать, этот процесс становится менее нюансированным.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Иногда помещение листа темной бумаги под пластину клеточной культуры может помочь визуализировать незрелые органоиды. Рекомендуется не использовать пипетку Пастера с вакуумным всасыванием для удаления среды, так как органоиды очень легко всасываются и теряются таким образом.
    3. Когда органоиды впервые установлены, они не потребляют среду так же быстро, как зрелые органоиды. Начиная с 50% медиаобменов уменьшает ненужное использование носителей и снижает вероятность случайного повреждения или аспирации новых органоидов во время процесса обмена медиа.

4. Генерация органоидов из установленной сферы GBM, адгезивной или органоидной культуры

ПРИМЕЧАНИЕ: Цель здесь состоит в том, чтобы сделать органоиды, которые однородны по размеру и количеству клеток для использования в сравнительных экспериментах, поэтому используйте одноклеточный фильтр и подсчитывайте клетки, чтобы обеспечить это.

  1. Приготовление одноклеточной суспензии из культуры сферы GBM.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сферные культуры клеток GBM поддерживаются в средах NBMc.
    1. Поместите сферы в трубку центрифуги объемом 15 мл и вращайте при 120 х г в течение 5 мин.
    2. Удалите супернатант и добавьте 2 мл раствора для отсоединения клеток RT. Поместите в инкубатор при температуре 37 °C на 3 мин.
    3. Добавьте 8 мл среды NBMc для нейтрализации раствора отсоединения клеток. Процедить через одноклеточный сетчатый фильтр (70 мкм) и вращать в течение 5 мин при 120 х г.
    4. Извлеките супернатант из трубки и повторно суспендируйте оставшиеся клетки в ~1 мл NBMc. Подсчитайте клетки (используя окрашивание без ячеек) и перейдите к шагу 4.4.
  2. Приготовление одноклеточной суспензии из адгезивной культуры GBM.
    1. Извлеките использованную среду из пластины, добавьте 2 мл раствора для отсоединения клеток RT в пластину и поместите в инкубатор с температурой 37 °C на 3 мин.
    2. Подтвердите под микроскопом, что клетки отделены от пластины.
    3. Добавьте 8 мл среды NBMc для нейтрализации раствора отслоения клеток. Деформация через одноклеточный сетчатый фильтр (70 мкм).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Одноклеточное процеживание является необязательным при работе с адгезивной культурой.
    4. Отжим в течение 5 мин при 120 х г. Извлеките супернатант из трубки и повторно суспендируйте оставшиеся клетки в ~1 мл NBMc. Подсчитайте клетки (используя окрашивание без ячеек) и перейдите к шагу 4.4.
  3. Получение одноклеточной суспензии из органоидной культуры GBM.
    1. Перенесите органоиды с помощью разрезанного наконечника пипетки p1000 на 10-сантиметровую культуральную пластину и аккуратно удалите как можно больше остаточных сред.
    2. Используя две стерильные бритвы, тщательно измельчите органоиды. С помощью вырезанного наконечника p1000 переместите измельченные органоиды в трубку центрифуги объемом 15 мл и добавьте ~2-3 мл среды NBMc.
    3. Открутите при 120 х г в течение 3 мин и удалите супернатант (рекомендуется использовать наконечник пипетки, а не вакуумное всасывание для этой части).
    4. Добавить 2 мл раствора холодной клеточной отслойки в течение 10 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор для отсоединения клеток следует использовать непосредственно при температуре 4 °C, а не нагревать сначала. Это, по-видимому, смягчает любой оставшийся матригель и помогает в восстановлении клеток.
    5. Затем перейдите в инкубатор при температуре 37 °C в течение 10-20 мин, наблюдая и перемешивая каждые несколько минут. При появлении скопления, которое может свидетельствовать о лизисе клеток, немедленно переходите к следующему шагу.
    6. Добавьте 8 мл среды NBMc, чтобы разбавить раствор для отсоединения клеток. Процедить через одноклеточный сетчатый фильтр (70 мкм) и вращать в течение 5 мин при 120 х г.
    7. Извлеките супернатант из трубки и повторно суспендируйте оставшиеся клетки в ~1 мл NBMc. Подсчитайте клетки (используя окрашивание без ячеек) и перейдите к шагу 4.4.
  4. Изготовление органоидов из одноклеточной суспензии
    1. В ведро со льдом или холодный блок поместите lrECM и небольшую центрифужную трубку. Поместите соответствующее количество lrECM (16 мкл х X числа предполагаемых органоидов) в небольшую центрифужную трубку.
    2. Создайте смесь клеток в общем объеме (4 мкл х X числа предполагаемых органоидов), которая будет содержать 20 000 клеток / органоидов, и добавьте это в небольшую центрифужную трубку с lrECM на льду.
    3. Аккуратно пипетку 20 мкл смеси lrECM/клеточной суспензии на парапленочные формы; это приведет к образованию жемчужной капли.
      1. Обязательно тщательно перемешайте смесь lrECM / клеточной суспензии, так как клетки, как правило, легко оседают в lrECM, и это приведет к гетерогенным органоидам.
      2. Держите смесь lrECM/клеточной суспензии на льду. Если lrECM нагревается, он может полимеризовать и скомпрометировать образование органоидов.
      3. Обязательно охлаждайте наконечник пипетки каждые два-три органоида, чтобы предотвратить полимеризацию lrECM. Не вводите пузырьки воздуха в органоиды (избегайте «двойного нажатия» на кончик пипетки).
    4. После того, как нужное количество органоидов пипетируют на парапленочную форму в 10-сантиметровой культуральной пластине, инкубируют при 37 °C в течение 1-2 ч в инкубаторе клеточной культуры.
    5. После того, как органоиды затвердеют, используйте среду NBMc, чтобы аккуратно смыть их с формы парапленки и в новую, стерильную 10 см культуральную пластину с общим объемом 20 мл NBMc. Использование наконечника p1000 лучше всего работает для смывания органоидов из формы; они будут плавно соскальзывать.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется около 15-20 органоидов на 10 см чашки культуры.
    6. Поместите 10 см культуральную посуду в инкубатор (без встряхивания) на 4 дня.
    7. Через 4 дня обменивают среду и помещают на орбитальный шейкер при 80 об/мин в инкубатор клеточной культуры. После этого обменивайтесь носителями каждые 2-3 дня.
      1. Обмен носителями с незрелыми органоидами является сложной задачей, потому что их трудно визуализировать. Наклоните чашку для культивирования клеток и подождите не менее 20 с; органоиды осядут внизу и позволят медленно удалять среду сверху с помощью большой открывающейся стеклянной пипетки.
      2. Обратите пристальное внимание на сбор органоидов внизу; если они кажутся перемешанными с силой удаления носителя, сделайте паузу и дайте им переселиться. По мере того, как органоиды созревают и их легче визуализировать, этот процесс становится менее нюансированным.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Иногда помещение листа темной бумаги под пластину клеточной культуры может помочь визуализировать незрелые органоиды. Не используйте пипетку Пастера с вакуумным всасыванием для удаления среды, так как органоиды очень легко всасываются и теряются таким образом.
      3. Когда органоиды впервые установлены, они не потребляют среду так же быстро, как зрелые органоиды. Начните с 50% обмена носителями, чтобы уменьшить ненужное использование носителей и уменьшить вероятность случайного повреждения или аспирации новых органоидов во время процесса обмена медиа.

5. Криоэмбеддинг

  1. Поместите каждый органоид в индивидуальную трубку объемом 1,5 мл (используя отрезанный наконечник p1000), содержащую 1 мл 4% параформальдегида (PFA). Хранить органоиды в течение ночи при температуре 4 °C. При встраивании органоидов в парафин переходите к разделу 6.
  2. После ночной фиксации в 4% PFA промыть органоиды в 1x фосфат-буферном физиологическом растворе (PBS) три раза.
  3. Перенесите органоид в новую трубку объемом 1,5 мл (используя вырезанный наконечник пипетки p1000), содержащую 1 мл 30% сахарозы в воде, и храните при 4 °C в течение ночи.
  4. Добавьте небольшое количество (обычно 1-2 мл) оптимального компаунда температуры резки (OCT) в криомольд, покрывая дно и заполняя примерно от 1/3 до 1/2 глубины формы.
  5. Переведите один органоид в криомольд, используя вырезанный наконечник пипетки p1000. Это приведет к передаче некоторых сред с органоидом, что неизбежно. Используйте меньший наконечник пипетки, чтобы аккуратно удалить окружающие среды, не нарушая органоид.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это может быть трудно визуализировать, но медленное пипетирование продемонстрирует четкую разницу в плотностях между средой и OCT, поэтому это делается «на ощупь» в некоторой степени).
  6. Поместите криомольда на лоток с сухим льдом. OCT начнет замерзать, становясь непрозрачным в процессе.
  7. Добавьте дополнительную ОКТ, чтобы полностью покрыть органоид, заполнив остальную часть объема криомольда. Блоки могут храниться при -20 °C для краткосрочного хранения в течение нескольких дней или при -80 °C для длительного хранения неопределенно долго.

6. Встраивание парафина

  1. Сортируйте органоиды по размеру (мелкие органоиды ниже 3 мм, крупные органоиды более 3 мм). Перенесите каждый органоид на гистологическую кассету с помощью вырезанного наконечника пипетки p1000 и обработайте парафиновым воском в соответствии с Таблицей 2 или Таблицей 3.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Размер/конфигурация гистологической кассеты зависит от пользователя.
  2. Перенесите органоиды из кассет во встраиваемые формы с 1-2 мл расплавленного парафинового воска и охладите его до тех пор, пока воск не станет полутвердым.
  3. Как только воск частично затвердеет, добавьте больше воска в верхнюю часть формы. Поместите маркированную кассету поверх формы и перенесите ее на холодную пластину. Продолжайте охлаждение до тех пор, пока воск не станет полностью твердым.
  4. Когда воск затвердеет, разделите блок с помощью микротома. Кроме того, хранить при RT или 4 °C для последующего секционирования.

7. Иммунофлуоресценция (ИФ)

  1. Депарафинизировать и регидратировать 5-12 мкм парафиновых участков тканей с помощью скользящей окрашивающей посуды, в соответствии со следующими шагами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании секций из органоидов, встроенных в OCT, мы рекомендуем использовать секции размером 12 мкм. Удалите OCT, встряхнув затвор в PBS в течение 30 минут. Перейдите к шагу 7.2.
    1. Инкубировать в течение 5 мин в ксилоле. Повторите это еще два раза. Затем инкубировать в течение 10 мин в 100% этаноле. Повторите это еще раз.
    2. Инкубировать в течение 10 мин в 95% этаноле. Повторите еще раз. Промыть секции в дистиллированной воде в течение 5 мин, два раза.
  2. Для демаскации антигена погрузите слайды в 1x раствор для демаскации цитрата (Таблица материалов) и микроволновую печь при температуре субкипения в течение 10 мин. Не дайте раствору закипеть.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это лучше всего достигается, если сначала разогреть в микроволновой печи в течение ~ 2 мин до тех пор, пока не произойдет кипение, а затем снизить мощность и следить за тем, чтобы раствор не закипел. Предпочтительная температура распаковки чуть ниже 100 °C, в идеале 98 °C.
  3. Дайте слайдам остыть в течение 30 минут при RT в 1x растворе для демаскировки цитрата.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это тот же 1x раствор цитрата; на этом этапе нет необходимости заменять решение.
  4. Промойте горки в дистиллированной воде в течение 5 мин, два раза.
  5. Промывайте слайды в 1x TBST (Tris-буферный физиологический раствор с 0,1% Tween 20) буфере в течение 5 мин.
  6. Извлеките слайды из TBST и тщательно высушите их вокруг участков ткани, используя лабораторную чистящую салфетку, стараясь не дать участку ткани высохнуть. Как только слайд достаточно высохнет, обведите участки тканей гидрофобной барьерной ручкой.
  7. Блокируют каждый участок 100-400 мкл 10% раствора для блокировки сыворотки в течение 1 ч при РТ. Выбирайте раствор для блокировки сыворотки на основе вторичного антитела. Например, если используется вторичное антитело, изготовленное у осла, используйте 10% нормальную ослиную сыворотку в 1x TBST.
  8. Удаляют блокирующий раствор и затем добавляют 100-400 мкл первичного антитела, разведенного до нужной концентрации в блокирующем растворе.
  9. При 4 °C инкубируют срезы с первичным антителом в течение ночи.
  10. Удалите первичный раствор антител и промыть слайды в 1x TBST в течение 5 мин, три раза.
  11. Добавляют 100-400 мкл вторичного антитела (1:1000 разведения в блокирующем растворе или по указанию производителя) в каждую секцию и инкубируют в течение 1,5 ч при РТ.
  12. Вымойте слайды в 1x TBST в течение 5 мин, два раза. Затем мойте слайды в 1x PBS в течение 5 минут.
  13. Извлеките слайды из PBS и высушите их вокруг участков тканей с помощью салфетки для лабораторной очистки. Добавьте несколько капель крепления для жидкого отверждения и аккуратно установите стеклянную крышку. Как только слайды высохнут, храните при температуре -20 °C, защищенные от света, пока они не будут готовы к визуализации.

8. Иммуногистохимия

  1. Депарафинизируйте и регидратируйте парафиновые участки тканей с помощью скользящей окрашивающей посуды, в соответствии со следующими шагами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании секций из органоидов, встроенных в OCT, удалите OCT, встряхнув слайд в PBS в течение 30 минут. Перейдите к шагу 8.2.
    1. Инкубировать в течение 5 мин в ксилоле. Повторите еще два раза.
    2. Инкубировать в течение 10 мин в 100% этаноле. Повторите еще раз.
    3. Инкубировать в течение 10 мин в 95% этаноле. Повторите еще раз.
    4. Промыть секции в дистиллированной воде в течение 5 мин, два раза.
  2. Для демаскации антигена погрузите слайды в 1-кратный раствор для демаскации цитрата и поставьте в микроволновую печь при температуре субкипения в течение 10 минут. Не дайте раствору закипеть.
  3. Дайте слайдам остыть в течение 30 минут при RT в 1x растворе для демаскировки цитрата.
  4. Промыть горки в течение 5 мин в дистиллированной воде, трижды.
  5. Инкубируйте слайды в течение 10 минут в 3% перекиси водорода.
  6. Промыть горки в течение 5 мин в дистиллированной воде дважды.
  7. Мойте слайды в течение 5 мин в 1x TBST.
  8. Извлеките слайды из 1x TBST, а затем используйте угол лабораторной чистящей салфетки, чтобы тщательно высушить участки ткани.
  9. Обведите участки тканей гидрофобной барьерной ручкой, как только слайд высохнет.
  10. Поместите 100-400 мкл блокирующего раствора на каждый участок в пределах гидрофобного барьерного перьевого круга при РТ в течение 1 ч. Используйте либо 10% обычной ослиной сыворотки (NDS), либо 0,75% бычьего сывороточного альбумина (BSA), разведенного в 1x TBST.
  11. Далее удаляют блокирующий раствор и добавляют 100-400 мкл первичного антитела к каждому участку. Разбавляют это первичное антитело до нужной концентрации, используя соответствующий разбавитель производителя.
  12. Инкубировать секции при температуре 4 °C в течение ночи. Удалите первичный раствор антител и промыть слайды в 1x TBST в течение 5 мин, три раза.
  13. Добавьте 100-400 мкл реагента для обнаружения IHC в каждую секцию и инкубируйте в течение 1 ч при RT. Выберите реагент для обнаружения IHC в соответствии с первичным антителом.
  14. Промывайте каждую секцию 1x TBST в течение 5 мин, два раза, затем 1x PBS в течение 5 мин один раз.
  15. Готовят 3,3-диаминобензидин (DAB) раствор в соответствии с указаниями производителя. Добавьте 100-400 мкл раствора DAB к каждому участку ткани и внимательно наблюдайте под микроскопом. Между 1-10 мин обеспечит приемлемую интенсивность окрашивания; обязательно отметьте это время и соблюдайте последовательность для всех участков тканей.
  16. После достижения желаемой интенсивности окрашивания погрузите горки в дистиллированную воду.
  17. Выполняют противоувлажнение гематоксилина и обезвоживание скольжения для монтажа в соответствии с инструкцией в таблице 4.
  18. Извлеките слайд из заменителя ксилола (Таблица материалов) и вытрите лишнюю жидкость вокруг участка ткани с помощью салфетки для лабораторной очистки. Используйте небольшое количество постоянной монтажной среды, чтобы закрепить крышку над срезом ткани и дать высохнуть.

9. Измерение общей жизнеспособности клеток

  1. Перенесите каждый органоид в трубку объемом 2 мл и, используя небольшой наконечник пипетки, аккуратно удалите все лишние среды вокруг органоида (см. Схему этой процедуры на рисунке 3 ).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ жизнеспособности клеток должен быть выполнен с органоидами, которые были сделаны с одинаковым количеством клеток. Этот эксперимент не следует проводить на органоидах, изготовленных непосредственно из образцов пациентов из хирургии, от разрезания органоидов, образованных алредией, или других случаев, когда отдельные клетки не были отфильтрованы и подсчитаны.
  2. Подготовьте реагент для анализа жизнеспособности люминесцентных клеток и 1x PBS в соотношении 1:1 и добавьте 500 мкл в каждую трубку.
  3. Используйте наконечник пипетки p1000, чтобы агрессивно пипетку вверх и вниз разрушить органоид и дать постоять в течение 5 минут. К настоящему времени органоид должен быть несколько диссоциированным и более мягким; повторите смешивание с наконечником пипетки p1000 еще раз.
  4. Цель состоит в том, чтобы иметь общий объем 100 мкл на скважину плиты из 96 скважин. Добавьте 25 мкл смеси со стадии 9.3 (будет достаточно для нескольких технических реплик) и добавьте 75 мкл оставшегося анализа жизнеспособности люминесцентных клеток и смеси PBS.
  5. Поместите тарелку на шейкер на 2 мин, а затем инкубируйте в течение 20 мин на RT.
  6. Считайте пластину с помощью настройки люминесценции на считывателе пластин и соберите данные (см. Рисунок 4).

Результаты

На рисунке 1 показан ранний рост органоидов, наблюдаемый с помощью световой микроскопии при 10-кратном увеличении. На рисунке 1A показана миграция и инвазия одиночных ячеек через lrECM в центральном представлении. Клетки будут продолжать расширяться и «колонизировать» lrECM, и они будут казаться более плотными и в конечном итоге непрозрачными при визуальном осмотре. На рисунке 1B показано несколько зрелых органоидов (через 7 недель) без увеличения, относительно размера копейки.

На рисунке 2 показано иммуногистохимическое окрашивание органоидов GBM для фосфогистона H3, маркера активной пролиферации. Большинство высокопролиферативных клеток наблюдаются в органоидном периметре по сравнению с органоидным ядром. Положительное окрашивание будет иметь коричневый / медный вид.

На рисунке 3 описан процесс гомогенизации и измерения общего количества клеток в органоидах GBM с использованием 3D-специфического анализа жизнеспособности люминесцентных клеток. Из-за большого количества клеток, присутствующих в органоидах GBM, более крупная органоидная структура первоначально гомогенизируется путем тритурации в люминесцентном реагенте. Затем фракции общего органоидного лизата загружают в отдельные скважины и разбавляют дополнительным люминесцентным пробирным реагентом перед инкубацией и считыванием на соответствующем многолуночном пластинчатом считывателе.

На рисунке 4 представлены данные управления DMSO (common vehicle) для органоидов. Построенные данные демонстрируют внутриорганоидную и межорганоидную консистенцию. Данные о люминесцентной жизнеспособности обычно нормализуются для элементов управления для каждого образца при генерации экспериментальных данных.

figure-results-1
Рисунок 1: Просмотр через световой микроскоп (10x). (A) Ранний рост органоидов, демонстрирующий миграцию/инвазию клеток GBM по всему богатому ламинином внеклеточному матриксу. (B) Зрелые органоиды относительно размера копейки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-2
Рисунок 2: Иммуногистохимия органоидов GBM. (A, B) органоиды GBM, показывающие фосфо-гистоновые H3 окрашенные клетки для активной пролиферации. Масштаббары составляют 600 мкм и 300 мкм для А и В соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-3
Рисунок 3: Протокол жизнеспособности люминесцентных клеток для органоидов. (А) Переместите отдельные органоиды в небольшие центрифужные трубки и удалите лишние среды. (B) Добавьте 500 мкл 1:1 PBS и смесь для анализа жизнеспособности люминесцентных клеток в каждую трубку и пипетку агрессивно, чтобы разрушить органоид. (C) Добавить 25 мкл этой органоидной смеси и 75 мкл той же смеси для анализа жизнеспособности 1:1 PBS и люминесцентных клеток в каждую лунку пластины из 96 лунок. (D) Поместите на шейкер на 2 мин, затем инкубируйте в течение 20 мин на RT, а затем считывайте люминесценцию на пластинчатом считывателе. Рисунок выполнен с использованием BioRender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-4
Рисунок 4: Жизнеспособность клеток. Данные о жизнеспособности клеток для органоидов в 0,1% диметилсульфоксиде (ДМСО) для шести технических реплик четырех органоидов для четырех образцов пациентов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

КомпонентКоличество
Нейробазальная среда минус фенол красный500 мл
Добавка B-27 минус витамин А (50x)10 мл
Антибиотик-антимикотик (100x)5 мл
Пируват натрия (100 мМ)5 мл
Глютамин в 0,85% NaCl (200 мМ)5 мл
Рекомбинантный человеческий FGF основной (250 мкг/мл)20 мкл
Рекомбинантный человеческий белок EFG (250 мкг/мл)20 мкл
Фенол красный500 мкл

Таблица 1: Состав нейробазальной среды полной (NBMc)

РеагентВремя
50% этанол3 мин
75% этанол3 мин
95% этанол3 мин
95% этанол4 мин
100% этанол2 мин
100% этанол3 мин
100% этанол4 мин
Заменитель ксилола2 мин
Заменитель ксилола3 мин
Заменитель ксилола4 мин
Парафин15 мин
Парафин15 мин

Таблица 2: График обработки малых органоидов (диаметром менее 3 мм)

РеагентВремя
50% этанол6 мин
75% этанол6 мин
95% этанол5 мин
95% этанол8 мин
100% этанол5 мин
100% этанол5 мин
100% этанол8 мин
Заменитель ксилола5 мин
Заменитель ксилола5 мин
Заменитель ксилола8 мин
Парафин30 мин
Парафин30 мин

Таблица 3: График обработки крупных органоидов (диаметром более 3 мм)

РеагентВремя
Гематоксилин2 мин
Запуск diH2O2 мин
Ядерный гематоксилин осветляющий реагент1 мин
Запуск diH2O1 мин
Реагент Bluing1 мин
Запуск diH2O2 мин
70% этанол1 мин
100% этанол1 мин
100% этанол1 мин
Заменитель ксилола2 мин
Заменитель ксилола2 мин

Таблица 4: Гематоксилин контрокрашен

Обсуждение

Органоиды GBM являются дополнительным методом культивирования к традиционным сферам, которые включают большую клеточную и микросреду гетерогенность 4,22,30. Несмотря на то, что органоидная культура требует больше времени и ресурсов, она может дать ценную информацию о внутриопухолевом поведении и механизмах лекарственной устойчивости.

GBM управляется населением CSC 5,31, и эти методы были разработаны, чтобы обеспечить дальнейший рост и самообновление этой популяции CSC. Известно, что эпидермальный фактор роста (EGF) и фактор роста фибробластов (FGF) улучшают поддержание и рост стволовых клеток и обеспечивают передачу сигналов активной рецепторной тирозинкиназы (RTK). Формирование гетерогенных клеточных популяций и различных микросред опухоли в опухолях GBM зависит от поддержки поведения CSC. Выбор lrECM имитирует богатую ламининами среду мозга и поддерживает клетки в органоидной культуре для самоорганизации и миграции путем инвазии. Хотя некоторые группы создали органоидную культуру без использования lrECM или EGF/FGF обогащенной среды24,28, которая может предложить более эффективный по времени способ этого метода культивирования и более сильный отбор онкогенной сигнализации для стимулирования роста, эти методы были выбраны для оптимизации среды простековых клеток, чтобы наилучшим образом установить клеточную гетерогенность органоидов. Как церебральные органоиды, так и органоиды GBM были сделаны с lrECM в литературе ранее 21,32,33. Хотя мы установили данные о популяциях опухолей, обнаруженных в органоидах, и пространственных вариациях, меньше известно о неопухолевых популяциях внутри органоидов и о том, как долго они выживают от исходных образцов пациентов. Некоторые пятна IHC (такие как CD45) могут предоставить эти данные и могут быть интересной точкой исследования в будущем с органоидами.

Знание предполагаемого использования органоидной культуры важно для выбора соответствующих методов. Создание органоидов из первичных образцов по сравнению с выращиванием однородных органоидов для конкретных экспериментов имеет несколько разные процедуры. Понимание того, как органоиды созревают и визуально заполняют каркас lrECM, важно для того, чтобы иметь возможность выделять надлежащее время и ресурсы на органоидную культуру. Разреженные области клеток в органоидах будут медленно расширяться и расти, чтобы заполнить lrECM, что может занять от 2 до 8 недель, в зависимости от поведения образца. Эта скорость роста в некоторой степени присуща каждому экземпляру; она сохраняется на разных партиях органоидов и вполне соответствует относительной скорости роста сфер. Органоиды могут сохраняться более 1 года и сохранять способность к образованию опухолей на ксенотрансплантате у мышей; однако рекомендуется выращивать их с определенной целью, чтобы не тратить лабораторные ресурсы (как материалы, так и время)4. Рост органоидов был протестирован в нескольких размерах и форматах скважин и показывает, что пластина размером 10 см является идеальной установкой для поддержания оптимальной жизнеспособности клеток, за которой следует 6-луночная пластина с тремя органоидами наскважину 34. Органоиды потребляют больше среды по сравнению с их двумерными аналогами культуры, и использование меньшего формата скважины не приводит к надлежащему обслуживанию. Например, одна скважина пластины формата 96 лунок не имеет достаточного пространства или объема среды относительно размера органоида для поддержания роста органоида.

Как устанавливают органоиды, наблюдательность важна для увеличения успеха. Первоначально органоиды будут потреблять среду медленно, но по мере того, как они становятся более плотными и зрелыми, они будут потреблять медиа быстрее. Добавление фенольного красного в среду может помочь служить индикатором потребления среды. Когда среда становится более желтой, это может побудить нас скорректировать схему кормления, будь то обмен большим объемом среды, увеличение общего количества среды в пластине, разделение органоидов между пластинами нескольких клеточных культур, чтобы идти в ногу с их ростом, или даже корректировка временной шкалы для экспериментов.

Во многих отношениях органоиды являются неэффективным способом проведения исследований рака. Они имеют длительные временные масштабы и являются дорогостоящими и ресурсоемкими по сравнению с культурой сферы GBM. Однако, по сравнению с ксенотрансплантатами, полученными от пациентов, альтернативным методом воссоздания клеточного и микроокружного разнообразия, они более просты, менее дороги и контролируемы. Выбор того, когда лучше всего использовать органоиды, важен для исследователей рака. Они не предназначены для замены традиционной сферы или адгезивной культуры и не для замены моделей ксенотрансплантатов. Органоиды могут, при применении к правильному научному вопросу, сочетать преимущества обеих этих систем и могут позволить нам наблюдать биологию опухолевых клеток, которая в противном случае оставалась бы скрытой. Научное сообщество только начинает понимать, какие возможности обучения предлагают органоиды, но ясно, что они станут бесценным инструментом в будущем для понимания сложной биологии GBM.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликтов для раскрытия.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить д-ра Джастина Латию за его бесценные советы и постоянную поддержку. Мы также благодарим Катрину Файф, Лизу Уоллес и Майю Камхи за отличную техническую поддержку.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
3,3-Диаминобензидин (DAB) таблеткиMP Biomedicals089806813,3-Диаминобензидин (DAB) таблетки
96-луночные ПЦР-планшетыThermoFisher Scientific96-луночные ПЦР-планшеты
AccutaseThermoFisher ScientificSCR005Раствор для отслойки
клеток Антибиотик-антимикотикThermoFisher Scientific15240062Антибиотико-антимикотическая
добавка B-27 минус витамин АThermoFisher Scientific12587001добавка B-27 минус витамин А (50 шт)
Реактив GelCode Blue StainThermoFisher Scientific24590Реактив Bluing
Клеточный фильтр (70 & микро; m)CellTreat Scientific229483Клеточный фильтр (70 & микро; m)
CellTiter-Glo 3DPromegaG9681анализа жизнеспособности люминесцентных клеток
2ThermoFisher Scientific7301Ядерный гематоксилин осветляющий реагент
Clear-Rite 3ThermoFisher Scientific6901заменитель ксилола
Epredia Gill 2 ГематоксилинThermoFisher Scientific72504Гематоксилин
Глутамин в 0,85% NaClThermoFisher Scientific35050061Глютамин в 0,85% NaCl (200 мМ)
MatrigelThermoFisher Scientific354234Обогащенный ламинином внеклеточный матрикс
Мини-ПАП-ручкаThermoFisher Scientific008877Гидрофобная барьерная ручка
Монтажная средаThermoFisherScientific 22-050-102Монтажная среда
Нейробазальная среда минус фенол красныйThermoFisher Scientific12349015Нейробазальная среда минус фенол красный (500 мл)
Нормальная ослиная сыворотка (NDS)Jackson ImmunoResearch017-000-121Нормальная ослиная сыворотка (NDS)
Параформальдегид 4% в PBSThermoFisher ScientificAAJ19943K2Параформальдегид 4% в PBS
Фенол красныйSigmaP0290Фенол красный (0.5%)
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPIThermoFisher ScientificP10144Жидкий отверждаемый монтант
Рекомбинантный человеческий EGF белокR& D systems236-EG-01MРекомбинантный человеческий белок EGF (250 &; г/мл)
Рекомбинантный человеческий FGF базовыйR& D системы4144-TC-01Рекомбинантный человеческий FGF базовый (250 &; г/мл)
СигналStain Разбавитель антителКлеточная сигнализация8112Разбавитель антител
SignalStain Boost IHC Реагент для детектированияклеток Клеточная сигнализация8114Иммуногистохимический реагент для детектирования
SignalStain Раствор для демаскирования цитратаCell Signaling14746Раствор для демаскирования цитрата
Лезвие бритвы с одним лезвиемUlineH-595BОднолезвие бритвенное лезвие
Пируват натрияThermoFisher Scientific11360070Пируват натрия (100 мМ)
Cryomolds Tissue-Tek VWR25608-916Одноразовые криоформы
Tissue-Tek O.C.T. CompoundVWR25608-930Оптимальная температура резки
Трипановая синяя морилкаThermoFisher ScientificT10282Клеточная антимагнитная морилка (0.4%)
КсилолThermoFisher ScientificX3P-1GALКсилол
Осветлитель для

Ссылки

  1. Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
  2. Heffernan, J. M., Sirianni, R. W. Modeling microenvironmental regulation of glioblastoma stem cells: a biomaterials perspective. Frontiers in Materials. 5, 7(2018).
  3. Zanders, E. D., Svensson, F., Bailey, D. S. Therapy for glioblastoma: is it working. Drug Discovery Today. 24 (5), 1193-1201 (2019).
  4. Hubert, C. G., et al. A Three-dimensional organoid culture system derived from human glioblastomas recapitulates the hypoxic gradients and cancer stem cell heterogeneity of tumors found in vivo. Cancer Research. 76 (8), 2465-2477 (2016).
  5. Lathia, J. D., Heddleston, J. M., Venere, M., Rich, J. N. Deadly teamwork: neural cancer stem cells and the tumor microenvironment. Cell Stem Cell. 8 (5), 482-485 (2011).
  6. Meyer, M., et al. Single cell-derived clonal analysis of human glioblastoma links functional and genomic heterogeneity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 851-856 (2015).
  7. Bao, S., et al. Stem cell-like glioma cells promote tumor angiogenesis through vascular endothelial growth factor. Cancer Research. 66 (16), 7843-7848 (2006).
  8. Yu, S. C., Bian, X. W. Enrichment of cancer stem cells based on heterogeneity of invasiveness. Stem Cell Reviews and Reports. 5 (1), 66-71 (2009).
  9. Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).
  10. Vescovi, A. L., Galli, R., Reynolds, B. A. Brain tumour stem cells. Nature Reviews. Cancer. 6 (6), 425-436 (2006).
  11. Zhu, T. S., et al. Endothelial cells create a stem cell niche in glioblastoma by providing NOTCH ligands that nurture self-renewal of cancer stem-like cells. Cancer Research. 71 (18), 6061-6072 (2011).
  12. Calabrese, C., et al. A perivascular niche for brain tumor stem cells. Cancer Cell. 11 (1), 69-82 (2007).
  13. Charles, N., et al. Perivascular nitric oxide activates notch signaling and promotes stem-like character in PDGF-induced glioma cells. Cell Stem Cell. 6 (2), 141-152 (2010).
  14. Seidel, S., et al. A hypoxic niche regulates glioblastoma stem cells through hypoxia inducible factor 2 alpha. Brain. 133, 983-995 (2010).
  15. Yan, K., et al. Glioma cancer stem cells secrete Gremlin1 to promote their maintenance within the tumor hierarchy. Genes & Development. 28 (10), 1085-1100 (2014).
  16. Cheng, L., et al. Glioblastoma stem cells generate vascular pericytes to support vessel function and tumor growth. Cell. 153 (1), 139-152 (2013).
  17. Flavahan, W. A., et al. Brain tumor initiating cells adapt to restricted nutrition through preferential glucose uptake. Nature Neuroscience. 16 (10), 1373-1382 (2013).
  18. Hjelmeland, A. B., et al. Acidic stress promotes a glioma stem cell phenotype. Cell Death and Differentiation. 18 (5), 829-840 (2011).
  19. Bar, E. E., Lin, A., Mahairaki, V., Matsui, W., Eberhart, C. G. Hypoxia increases the expression of stem-cell markers and promotes clonogenicity in glioblastoma neurospheres. The American Journal of Pathology. 177 (3), 1491-1502 (2010).
  20. Li, Z., et al. Hypoxia-inducible factors regulate tumorigenic capacity of glioma stem cells. Cancer Cell. 15 (6), 501-513 (2009).
  21. Azzarelli, R., Ori, M., Philpott, A., Simons, B. D. Three-dimensional model of glioblastoma by co-culturing tumor stem cells with human brain organoids. Biology Open. 10 (2), 056416(2021).
  22. Linkous, A., et al. Modeling patient-derived glioblastoma with cerebral organoids. Cell Reports. 26 (12), 3203-3211 (2019).
  23. da Silva, B., Mathew, R. K., Polson, E. S., Williams, J., Wurdak, H. Spontaneous glioblastoma spheroid infiltration of early-stage cerebral organoids models brain tumor invasion. SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R & D. 23 (8), 862-868 (2018).
  24. Jacob, F., et al. A Patient-derived glioblastoma organoid model and biobank recapitulates inter- and intra-tumoral heterogeneity. Cell. 180 (1), 188-204 (2020).
  25. Boretto, M., et al. Patient-derived organoids from endometrial disease capture clinical heterogeneity and are amenable to drug screening. Nature Cell Biology. 21 (8), 1041-1051 (2019).
  26. Huang, L., et al. Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell-and patient-derived tumor organoids. Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).
  27. Ledur, P. F., Onzi, G. R., Zong, H., Lenz, G. Culture conditions defining glioblastoma cells behavior: what is the impact for novel discoveries. Oncotarget. 8 (40), 69185-69197 (2017).
  28. Lenin, S., et al. A drug screening pipeline using 2D and 3D patient-derived in vitro models for preclinical analysis of therapy response in glioblastoma. International Journal of Molecular Sciences. 22 (9), 4322(2021).
  29. Rybin, M. J., Ivan, M. E., Ayad, N. G., Zeier, Z. Organoid models of glioblastoma and their role in drug discovery. Frontiers in Cellular Neuroscience. 15 (4), 605255(2021).
  30. Shakya, S., et al. Altered lipid metabolism marks glioblastoma stem and non-stem cells in separate tumor niches. Acta Neuropathologica Communications. 9 (1), 101(2021).
  31. Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
  32. Bian, S., et al. Genetically engineered cerebral organoids model brain tumor formation. Nature Methods. 15 (8), 631-639 (2018).
  33. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
  34. Sundar, S. J., et al. Three-dimensional organoid culture unveils resistance to clinical therapies in adult and pediatric glioblastoma. Translational Oncology. 15 (1), 101251(2021).

Перепечатки и разрешения

Теги

FACS
Поддержание клеточного разнообразия глиобластомы человека Ex vivo с использованием трехмерной органоидной культуры
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.