В возбуждающих синапсах в мозге млекопитающих пресинаптически высвобождаемый глутамат активирует рецепторы, встроенные в постсинаптическую мембрану 1,2. Прочность этих синаптических связей обусловлена пластичностью, зависящей от опыта, что позволяет осуществлять различные формы обучения и памяти 3,4,5,6,7,8,9. Патологические изменения количества синапсов и их сигнальных свойств приводят к изменению активности цепей и обработки информации, проявляющейся при многочисленных неврологических и психических расстройствах 10,11,12. Таким образом, существует острая необходимость в понимании основных механизмов, которые управляют нейронными связями и силой синаптических связей.
Возбуждающие синапсы образуются на дендритных шипах, крошечных постсинаптических выступах, содержащих каркасные белки, рецепторы, сигнальные факторы, цитоскелетные белки и тракционирующие органеллы 1,2,13,14,15,16. Эти сигнальные отсеки микронного размера позволяют контролировать синаптическую силу на основе синапса за синапсом13,16. Морфология дендритных шипиков варьируется по длине дендритов нейронов, при этом формы шипиков обычно описываются как тонкие, филоподиальные, короткие, грибовидныеили разветвленные. Важно отметить, что форма позвоночника коррелирует с синаптической функцией и стабильностью. Например, более крупные шипы имеют увеличенное количество рецепторов и большую синаптическую силу 16,17,18. В отличие от тонких шипов, более крупные шипы могут сохраняться в течение нескольких месяцев in vivo, что может обеспечить стабильные синаптические связии долгосрочное хранение памяти.
Морфологию и плотность шипа вдоль дендрита обычно отслеживают для изучения степени нейронных связей и свойств возбуждающих синапсов в определенной области мозга, как в нормальном, так и в болезненномсостоянии. Разработаны различные методы визуализации морфологии позвоночника в различных тканевых препаратах и модельных системах с использованием стандартной световой и флуоресцентной микроскопии, а также сверхразрешающей и электронной микроскопии (ЭМ)21. Эти мощные методы визуализации дали потрясающее представление о нашем современном понимании организации, функции и болезней мозга. Эта коллекция методов включает в себя важные методы визуализации для мониторинга морфологической сложности дендритов и шипиков, а также оптогенетические инструменты для активации и измерения нейронной активности в дендритах и одиночных шипах.
Pekarek et al.22 представляют относительно быстрый, высокопроизводительный протокол для визуализации и количественной оценки структуры нейрональных дендритов глубоко внутри интактной нервной ткани. Авторы выполняют методочистки тканей, который удаляет липиды из мозговой ткани и помогает свести к минимуму рассеяние света при последующей визуализации23. После очистки Z-стеки нейронов, экспрессирующих флуоресцентные белки, собирали с помощью конфокальной или двухфотонной микроскопии. Анализ изображений и автоматизированная количественная оценка позволили точно измерить плотность и форму колючек, а также сложность дендритного дерева. Этот протокол позволяет одновременно визуализировать структуры, начиная от одиночных шипов и заканчивая дендритными деревьями, и устраняет трудоемкий и потенциально опасный этап резки тонких сечений. Этот метод будет очень полезен исследователям, стремящимся количественно оценить изменения морфологии позвоночника и дендритной сложности в интактных тканях мозга после введения или удаления интересующего гена (генов).
Разработанное более 100 лет назад24 года, окрашивание по методу Гольджи остается мощным инструментом для визуализации организации нервной системы и морфологии нейронов. В этом методе разреженные популяции нейронов окрашиваются микрокристаллизацией хромата серебра, что позволяет визуализировать аксоны, дендритные деревья и шипы25. Франкфурт и Боуманподробно описывают протокол быстрой пропитки Гольджи для визуализации нейронов и дендритных шипиков в гиппокампе крысы и медиальной префронтальной коре. Авторы демонстрируют, как подготавливать, окрашивать и визуализировать ткань для последующей световой микроскопии, а также количественно оценивать плотность колючек вдоль дендритных деревьев. Описанный здесь протокол обеспечивает последовательную, надежную пропитку нейронов и снижает воздействие токсичных химических веществ.
В то время как световая и флуоресцентная микроскопия хорошо подходят для визуализации дендритов и шипиков, ЭМ позволяет визуализировать пре- и постсинаптические структуры с нанометровым разрешением. Подходы ЭМ обычно используются для измерения ультраструктурных свойств синапсов, включая размеры постсинаптической плотности, а также количество и размер синаптических везикул21. В этой коллекции Śliwińska et al.27 предлагают протокол для получения трехмерных (3D) ЭМ-изображений с помощью сканирования Serial Block-face Electron Microscopy (SBEM) в тканях гиппокампа мыши28,29. В частности, они описывают, как подготавливать образцы, встраивать ткани в смолу, монтировать и обрезать образцы, выполнять SBEM и анализировать изображения для создания 3D-реконструкций. Этот протокол позволяет получать высококонтрастные изображения с четко очерченными мембранами и может быть адаптирован для различных типов тканей.
Во время развития нервной системы нейроны претерпевают драматические морфологические изменения, так как синаптические связи формируются и уточняются нервной активностью30,31. Чтобы отследить созревание нейронов в развивающемся мозжечке, Chan et al.32 предлагают протокол постнатальной электропорации развивающихся гранулярных нейронов in vivo. Здесь исследователи ввели и электропорировали ДНК в задний мозг постнатальных детенышей мышей, чтобы трансфицировать разреженную популяцию нейронов флуоресцентными белками. Конфокальная микроскопия высокого разрешения и 3D-визуализация позволили исследователям охарактеризовать морфологию дендритов и дендритных когтей на нескольких стадиях постнатального развития. Важно отметить, что этот подход может позволить вставлять или удалять гены, которые могут влиять на созревание и функционирование гранулярных клеток, и будет представлять большой интерес для исследователей, изучающих развитие мозжечка и созревание гранулярных нейронов.
Наконец, протоколы Куэнтаса-Кондори и Миллера33 используют визуализацию сверхвысокого разрешения34, оптогенетику35 и визуализацию динамики кальция на живых клетках36 для изучения активности ГАМКергических нейронов у нематоды C. elegans. Используя конфокальный микроскоп, оснащенный для визуализации со сверхвысоким разрешением, авторы экспрессируют флуоресцентные белки в дендритах для измерения частоты различных форм шипов. Кроме того, авторы оценивают нейронную функцию по экспрессии оптогенетического белка пресинаптически и показателя кальция постсинаптически После световой активации окончаний в отдельных дендритных шипах наблюдались переходные процессы кальция. Эти протоколы, наряду с недавними открытиями38, подчеркивают захватывающее использование C. elegans в качестве мощной модельной системы для отслеживания морфологии позвоночника и синаптической активности.
Взятые вместе, протоколы, описанные в этой коллекции методов, дополнят и без того богатый набор инструментов, доступных для визуализации нейронной структуры и функции21. Применение этих методов в будущих исследованиях, вероятно, даст дополнительное представление о процессах, которые управляют синаптической пластичностью, связанной с обучением, и клеточных механизмах, лежащих в основе болезненных состояний.