Методическая статья

Анализ гранулоцитарно-макрофагальных колониестимулирующих фактор-продуцирующих Т-хелперов в мышиной модели контактной гиперчувствительности

DOI:

10.3791/63755

⸱

10 марта 2022 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Human Disease and Immunotherapies, West China Hospital, Sichuan University, 2Institute of Immunology and Inflammation, Frontiers Science Center for Disease-Related Molecular Network, West China Hospital, Sichuan University, 3Core Facilities of West China Hospital, Sichuan University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данной работе мы представляем простой и стандартизированный метод анализа гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора-продуцирующего Т-хелпера in vivo.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Параллельно с традиционными линиями Th1/Th2/Th17/Treg, гранулоцитарно-макрофагальные колониестимулирующие фактор-продуцирующие Т-хелперы (Th-GM) были идентифицированы как отдельное подмножество Т-хелперных клеток (GM-CSF+ IFN-γ-IL-17A-IL-22-эффекторные CD4+ Т-клетки) у человека и мышей. Контактная гиперчувствительность (CHS) считается отличной животной моделью аллергического контактного дерматита (АХД) у человека, проявляющего интактный иммунный ответ, опосредованный Т-клетками. Чтобы обеспечить стандартизированный и всесторонний анализ субпопуляции Th-GM клеток в Т-клеточном иммунном ответе in vivo, мышиную модель CHS индуцировали путем сенсибилизации/провокации с реактивным, низкомолекулярным, органическим гаптеном, 2,4-динитрофробензолом (DNFB). Субпопуляция Th-GM в эффекторных CD4+ Т-клетках, полученная при иммунизации гаптеном, анализировали с помощью проточной цитометрии. Мы обнаружили, что Th-GM в основном был расширен в поражениях и дренирующих лимфатических узлах в мышиной модели CHS, индуцированной DNFB. Этот метод может быть применен для дальнейшего изучения биологии Th-GM клеток и фармакологических исследований терапевтических стратегий, основанных на GM-CSF при различных состояниях, таких как ACD.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Т-хелперные клетки, продуцирующие гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) - подмножество Th-GM - выделяются в отдельную подгруппу Т-хелперов у человека и мышей и, как считается, включают в себя "только экспрессирующие GM-CSF" (GM-CSF+ IFN-γ- IL-17A- IL-22-) CD4 Т-клетки, идентифицированные с помощью анализа одноклеточной РНК, массовой цитометрии и картирования судьбы мышей GM-CSF 1,2,3. В 2014 году Sheng et al. сообщили о программировании сигнального преобразователя и активатора транскрипции 5 (STAT5) подмножества Th-GM и впервые концептуализировали подмножество «Th-GM» 4,5. Клетки Th-GM характеризуются цитокиновой экспрессией GM-CSF, IL-2, TNF-α, IL-3, CCL20 и хемокиновых рецепторов типа C-X-C (CXCR) 4 или CXCR6 1,2. STAT и/или путь NF-κB имеют важное значение для дифференциации линии Th-GM. Был разработан метод in vitro для дифференцировки наивных CD4 Т-клеток в Th-GM клетки с использованием IL-7 в присутствии стимулов TCR6. Между тем, было показано, что цитокины IL-23 и IL-1β поддерживают экспрессию и патогенность клеток Th-GM ex vivo 3,7.

Повышение уровня клеток Th-GM было связано с несколькими аутоиммунными заболеваниями, такими как рассеянный склероз и ревматоидный артрит 2,8,9, что предполагает потенциальную роль в патогенезе аутоиммунитета10. Накапливающиеся данные свидетельствуют о том, что ГМ-КСФ может функционировать как медиатор воспаления. У мышей с генетической гиперэкспрессией Csf2 (гена, кодирующего GM-CSF) в CD4+ Т-клетках спонтанно развивался неврологический дефицит, сопровождающийся инфильтрацией фагоцитов в центральную нервную систему. В модели колита, связанного с переносом Т-клеток, адоптивный перенос Csf2−/− Т-клеток мышам Rag1−/− значительно снижал клинические и гистопатологические особенности заболевания. Тем не менее, существует мало сообщений о роли субпопуляции Th-GM в развитии аллергических заболеваний, таких как АХЗ.

АХП является одним из наиболее распространенных воспалительных дерматологических состояний с высокой распространенностью на работе и в быту11,12. Это реакция гиперчувствительности отсроченного типа IV, опосредованная интактной иммунной цепью, которая развивается в двух временных сегментированных фазах: сенсибилизация и выявление. АКД человека вызывается воздействием некоторых химических веществ (гаптенов или металлов), которые приводят к сенсибилизации. Во время этой фазы Т-клеточный ответ стимулируется гаптен-белковыми комплексами, представленными антигенпрезентирующими клетками. При последующем воздействии того же гаптена гаптен-специфические эффекторные и Т-клетки памяти реактивируются и локализуются на коже, что включает в себя инфильтрацию различных популяций иммунных клеток. Эта острая воспалительная реакция известна как элицитация, приводящая к полному развитию поражений13. ACD человека может быть изучена с использованием животных моделей контактной гиперчувствительности (CHS)14.

Модель CHS, индуцированная реакционноспособным, низкомолекулярным органическим гаптеном, 2,4-динитрофорбензолом (DNFB), является широко используемой мышиной моделью, которая использовалась при изучении патологии, а также потенциальных терапевтических вмешательств ACD15,16. Таким образом, эта Т-клеточно-зависимая модель может быть применена для изучения генерации субпопуляции Th-GM при аллергических заболеваниях. В данной работе мы индуцировали мышиную модель СЧХ с помощью DNFB, проанализировали генерацию Th-GM в поражениях и дренирующих лимфатических узлах и обнаружили, что субпопуляция Th-GM в основном расширяется при повторном воздействии того же гаптена. Это говорит о том, что субпопуляция Th-GM может быть существенной для развития АХД и представляет собой специфическую терапевтическую мишень при АХД.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все мыши, используемые в этом протоколе, находились на генетическом фоне C57BL/6, содержались в определенных условиях, свободных от патогенов, и получали пищу и воду в неограниченном количестве. Все эксперименты были одобрены органом по этической экспертизе благополучия животных Западно-Китайского медицинского центра Сычуаньского университета (20210302059).

1. Подготовка реагентов и материалов

  1. 0,5% раствор DNFB в качестве сенсибилизатора
    1. Для сенсибилизации 10 мышей приготовьте 1,1 мл смеси ацетона и оливкового масла в соотношении 4:1 (v/v): смешайте 880 мкл ацетона и 220 мкл оливкового масла, чтобы 0,1 мл избыточного объема компенсировали любые незначительные потери объема. Добавьте 5 μL DNFB к 1,1 мл смеси гомогенизированного ацетона и оливкового масла 4:1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте свежие продукты в день сенсибилизации. Смесь ацетона и оливкового масла следует готовить в вытяжном шкафу.
  2. Решение DNFB 0,2% в качестве претендента
    1. Чтобы испытать 10 мышей, добавьте 0,5 мкл DNFB в 0,25 мл гомогенизированной смеси ацетона и оливкового масла 4:1, описанной в шаге 1.1. Используйте смесь ацетона и оливкового масла 4:1 в качестве средства при работе с мышами после сенсибилизации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Смесь ацетона и оливкового масла следует готовить в вытяжном шкафу.
  3. Хлоралгидрат в качестве обезболивающего средства
    1. Растворите 4 г хлоралгидрата в 50 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) до получения 8% рабочего раствора. Отфильтровать и хранить при температуре 4 °C до 3 месяцев. Используйте 5 мкл на г массы тела для мыши.
  4. 50x коллагеназа внутривенно подвой
    1. Растворите 100 мг коллагеназы в/в в 1 мл базовой среды RPMI 1640 (без добавления антибиотиков или фетальной бычьей сыворотки [FBS]) до получения запаса 100 мг/мл. Хранить при температуре -20 °C в 100 μл аликвот до 6 месяцев.
  5. 1 000x DNase I stock
    1. Растворите 5 мг ДНКазы I в 1 мл 0,15 М NaCl до получения запаса 5 мг/мл. Хранить при температуре -20 °C в 100 μл аликвот до 6 месяцев.
  6. Буфер остановки
    1. Растворите 1,681 г ЭДТА в 50 мл базовой среды RPMI 1640 до получения запаса 100 мМ. Хранить при температуре 4 °C до 2 недель.
  7. Моющая среда
    1. Растворите 0,372 г ЭДТА до конечной концентрации 2 мМ и 5 мл FBS до конечной концентрации 1% с 500 мл PBS. Отфильтровать и хранить при температуре 4 °C до 1 месяца.
  8. Буфер для окрашивания
    1. Растворите 0,372 г ЭДТА до конечной концентрации 2 мМ и 10 мл FBS до конечной концентрации 2% с 500 мл PBS. Отфильтровать и хранить при температуре 4 °C до 1 месяца.
  9. Реагенты для рестимуляции
    1. Растворите 1 мг форбола 12-миристат13-ацетата (ФМА) в 20 мл ДМСО с получением запаса 50 мкг/мл (500x) и храните его при -20 °C в 50 мкл аликвот.
    2. Разведите 250 мкл иономицина в растворе (4 мг/мл) в 7,75 мл ДМСО с получением запаса 500 мкг/мл (500x) и храните его при -20 °C в 50 мкл аликвот.
    3. Аликвоту 1 мл раствора ингибитора транспорта белка (содержащего брефельдин А) в 50 мкл и хранить аликвоты при 4 °С.

2. Индукция CHS у мышей

  1. На 5-й день обезболите мышей, введя 400 мг/кг хлоралгидрата внутрибрюшинно.
  2. С помощью бритвы для домашних животных выбрейте область живота мыши от 2 см × 2 см.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не царапайте кожу мыши; сохранить целостность кожного барьера в целости.
  3. Аккуратно и равномерно нанесите 100 мкл 0,5% раствора DNFB на выбритый живот с помощью микропипетки с одноразовыми наконечниками. Подержите мышей 5-10 секунд, чтобы часть растворителя испарилась.
  4. На день -4 повторите шаги 2.1-2.3 для повторной сенсибилизации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Два сенсибилизирующих события работают лучше, чем одно.
  5. В день 0 обработайте правое ухо мышей 20 μл 0,2% DNFB с помощью микропипеттора с одноразовыми наконечниками, а левое ухо обработайте тем же объемом смеси ацетона и оливкового масла 4:1, что и носитель.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Проработайте тыльную и вентральную стороны уха с помощью одинакового объема DNFB или носителя.
  6. В последующие 3 дня ежедневно измеряйте толщину уха правого и левого уха мышей с помощью циферблатного толщиномера, и рассчитывайте увеличение толщины уха: толщина правого уха - толщина левого уха.
    Примечание: Постепенное увеличение толщины ушей может наблюдаться у 0,2% ушей мышей, подвергшихся воздействию DNFB, по сравнению с ушами, обработанными носителем.

3. Выборочная коллекция мышей CHS

  1. На 3-й день обезболите мышей внутрибрюшинной инъекцией 400 мг/кг хлоралгидрата. Подождите 5-10 минут, пока мышь не войдет в бессознательное состояние, и выполните легкое ущипывание пальцев обеих задних ног, чтобы подтвердить, что мыши глубоко обезболились.
  2. Сфотографируйте каждое ухо каждой мыши с помощью камеры. Оцените инкрустацию (шелушение на ухе) и покраснение уха (эритему на ухе) самостоятельно для оценки выраженности воспаления по шкале от 0 до 5:0, нет; 1, незначительный; 2, умеренный; 3, помеченный; 4, очень заметный; 5, самый тяжелый.
  3. Усыпите мышь при вывихе шейки матки. Отрежьте все ухо и рассеките параллельно дренируемые лимфатические узлы мышей с помощью стерильных острых ножниц и щипцов. Поместите ткани в одну лунку 6-луночного планшета, помещенного на лед, содержащую 5 мл предварительно охлажденного PBS для ферментативной или физической диссоциации с получением суспензий одиночных клеток (дополнительный рисунок S1A и дополнительный рисунок S2A).
  4. Для гистологического анализа зафиксировать образцы из уха в 4% параформальдегиде, обезвожить и погрузить их в парафин для иммуногистохимического окрашивания, как описано в другом месте17.

4. Приготовление одноклеточной суспензии из ушей

  1. Разделите вентральную и тыльную стороны уха, зажав и разорвав обрезанные концы двумя изогнутыми щипцами (дополнительный рисунок S1B). Поместите их в лунку 6-луночного планшета, содержащего 4,5 мл буфера для пищеварения, убедившись, что эти ткани полностью погружены в буфер для пищеварения (дополнительный рисунок S1C).
    Примечание: Буфер для расщепления состоял из RPMI 1640, содержащего 10% FBS + 25 мМ HEPES + 2 мг/мл коллагеназы IV + 5 мкг/мл ДНКазы I.
  2. Инкубируйте листочки колоса в инкубаторе для клеточных культур при температуре 37 °C в течение 20 минут. Разрежьте ушные листочки ножницами как можно мельче, чтобы облегчить переваривание тканей (дополнительный рисунок S1D), и поместите образец обратно в инкубатор еще на 40 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эффективное пищеварение может быть достигнуто в течение 40-50 минут. Переваривание при 37 °C влияет на жизнеспособность клеток.
  3. Добавьте 0,5 мл стоп-буфера на лунку, чтобы нейтрализовать ферментативную активность коллагеназы IV и ДНКазы I. Выполните следующие шаги на льду.
  4. Перенесите фрагменты ткани уха с помощью пары изогнутых щипцов в центрифужную пробирку объемом 50 мл, содержащую клеточный фильтр 70 мкм, и нанесите пипетку всего объема среды в тот же клеточный фильтр.
  5. Разрушьте ткани с помощью верхнего конца поршня шприца объемом 1 мл. Надавливайте круговыми движениями на клеточный фильтр 70 мкм, пока не останутся только белые соединительные ткани (дополнительный рисунок S1D).
  6. Дважды промойте сетчатые фильтры 1 000 μл моющей среды. Перенесите весь объем лунки в центрифужную пробирку объемом 50 мл через сетчатый фильтр 40 μм. Держите трубку на льду.

5. Приготовление одноклеточных суспензий из дренирующих лимфатических узлов (дЛН)

  1. Перенесите лимфатические узлы с помощью пары изогнутых щипцов на клеточный фильтр 70 мкм, расположенный поверх лунки 6-луночного планшета (дополнительный рисунок S2B). Диссоциируйте лимфатические узлы с помощью верхнего конца поршня шприца объемом 1 мл. Надавливайте круговыми движениями на сетчатый фильтр 70 мкм до тех пор, пока не останется только белый мусор (дополнительный рисунок S2C).
  2. Дважды промойте сетчатое фильтр 1 000 μл моющей среды. Переложите весь объем лунки в трубку объемом 5 мл. Держите трубки на льду.

6. Рестимуляция субпопуляции Th-GM 12-миристатом 13-ацетатом (PMA)/иономицином в присутствии ингибитора транспорта белка

  1. Центрифугируйте клетки, выделенные из уха и образцов дренируемых лимфатических узлов, в течение 8 минут при 400 × г при 4 °C и выбросьте надосадочную жидкость. Осторожно восстановите суспендию в 1 000 μл моющей среды.
  2. Соберите небольшую часть каждого образца, чтобы подсчитать общее количество клеток, полученных из уха и дренируемого лимфатического узла, с помощью гемоцитометра. Добавьте 0,04% трипанового синего для измерения жизнеспособности клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Жизнеспособность клеток должна составлять более 60% для последующей стимуляции и анализа Т-клеток. Плотность клеток может составлять 1-5 × 106/мл.
  3. Центрифугируйте клетки на шаге 6.1 и выбросьте надосадочную жидкость. Осторожно ресуспендируйте гранулу 1000 мкл среды RPMI 1640, содержащей 2% FBS, и затравите 1 мл суспензии одиночных клеток (10–6 клеток/мл) в 12-луночных планшетах для культуры тканей с плоским дном.
  4. Добавьте 2 мкл форбол 12-миристат13-ацетата (PMA) (конечная концентрация 100 нг/мл), 2 мкл иономицина (конечная концентрация 1000 нг/мл) и 1 мкл ингибитора переноса белка (содержащего брефельдин А) в каждую лунку в 12-луночный планшет, содержащий 1 мл вышеуказанной суспензии одиночных клеток, и инкубируйте при 37 °C в течение 4 ч.

7. Анализ субпопуляций Th-GM, полученных in vivo путем окрашивания клеточной поверхности и внутриклеточного окрашивания

  1. Перенесите стимулированные клетки в центрифужные пробирки объемом 1,5 мл с помощью пипетки. Центрифугируйте пробирки центрифуги в течение 8 мин при 400 × г при комнатной температуре и выбросьте надосадочную жидкость.
  2. Промойте гранулу клетки один раз 1 мл буфера для окрашивания и обеспечьте клетки центрифугированием, как описано в шаге 7.1. Ресуспендируйте клетки в дозе 1-10 × 106/мл в 0,5 мл окрашивающего буфера.
  3. Добавьте 0,5 мкл стокового раствора красителя для жизнеспособности (см. Таблицу материалов) в 0,5 мл клеточной суспензии и немедленно сделайте вихрь. Выдержать смесь в течение 10 минут при комнатной температуре в темноте. Дважды промойте клетки 1 мл буфера для окрашивания и повторите центрифугирование в шаге 7.1 для гранулирования клеток.
  4. Суспендируйте гранулу в 0,1 мл буфера для окрашивания. Добавьте 1 мкл анти-CD4 антитела (FITC-конъюгированное), 1 мкл анти-CD44 антитела (APC-конъюгированное) и 1 мкл анти-CD62L антитела (PE/Cyanine7-конъюгированное) к трем 0,1 мл аликвот клеточной суспензии. Вихрь сразу же выдержать и инкубировать при комнатной температуре в течение 15 минут, защищенном от света месте.
  5. Повторите промывку и центрифугирование на шаге 7.3.
  6. Повторно суспендируйте гранулу в 200 мкл буфера для фиксации IC и инкубируйте в течение 20 минут в темноте. Тем временем приготовьте пермеабилизационный буфер (1x), разбавив 1 часть пермеабилизационного буфера (10x) 9 частями дистиллированной воды. Дважды промойте клетки 1 мл пермеабилизационного буфера (1x) центрифугированием при 600 × г в течение 5 минут при комнатной температуре.
  7. Ресуспендируют гранулу в 0,1 мл пермеабилизационного буфера (1x) с антителами против GM-CSF (PE-конъюгированный, 1 μл/анализ), ИФН-γ (BV711-конъюгированный, 1 μл/анализ), IL-17A (BV421-конъюгированный, 1 μл/анализ) и IL-22 (PerCP/Cyanine5,5-конъюгированный, 5 μл/анализ) и инкубируют в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте.
  8. Повторите промывки и центрифугирование на шаге 7.6.
  9. Повторно суспендируйте клеточную гранулу в 200 мкл PBS и перенесите суспензию в пробирку с круглым дном. Запустите окрашенные клетки в проточный цитометр.

8. Стратегия стробирования для идентификации подмножества Th-GM

  1. Проанализируйте данные проточной цитометрии (см. Таблицу материалов для получения подробной информации об используемом программном обеспечении) с использованием стратегии стробирования, показанной на дополнительном рисунке S1. Используемое здесь программное обеспечение можно скачать и настроить на компьютере.
  2. Импортируйте данные проточной цитометрии, нажав на Файл |Открыть | Импортируйте файлы FCS в программное обеспечение и аннотируйте группу и имя каждого образца, выбрав вкладку Переименовать .
  3. Выберите лимфоциты на графике FSC и SSC ( FSC low SSC low, P1), чтобы исключить мусор, обнаруженный в нижнем левом углу, и миелоидные клетки с большим размером и высокой зернистостью, щелкнув по графику плотности, и отобразите ось X этого графика как FSC-A , а ось Y как SSC-A.
  4. Дважды щелкните события в P1, чтобы создать еще один график плотности, и отделите отдельные ячейки (показаны в виде коррелированной линии, P2) от агрегатов ячеек, выбрав высоту и площадь ячейки на этом графике (ось X как FSC-A и ось Y как FSC-H).
  5. Дважды щелкните события в P2, чтобы создать еще один график плотности, и покажите ось X этого графика как FSC-A , а ось Y как SSC-A. Гейтирование жизнеспособных клеточных популяций с помощью событий FVS 780- (P3).
  6. Дважды щелкните события в P3, чтобы построить следующий график плотности ( ось X как CD4-A , а ось Y как SSC-A), и выделите CD4 T-клетки, выбрав популяцию CD4+ (P4).
  7. Дважды щелкните события в P4, чтобы создать еще один график плотности (ось X как CD44-A, а ось Y как CD62L-A), и определите вспомогательные ячейки эффектора T, выбрав верхнюю правую популяцию этого графика (CD62L- CD44+, P5).

9. Статистический анализ

  1. Выполняйте статистический анализ, сравнивая две группы с помощью непарного t-критерия. *P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001 и **** P < 0,0001 (среднее значение ± SD).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNFB-индуцированная CHS (контактная гиперчувствительность) у мышей
Чтобы индуцировать CHS у мышей, мышам проводили сенсибилизацию и вводили DNFB, наносимый на кожу уха, как показано на рисунке 1A. Толщина уха, являющаяся индикатором эпидермального спонгиоза, была заметно увеличена у мышей, получавших DNFB, по сравнению с мышами, получавшими носители (рис. 1B, 70 против 3 мкм в 1-й день, 203 против 7,5 мкм во 2-й день, 276 против 5 мкм в 3-й д...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол обеспечивает простой анализ in vivo для анализа генерации и расширения субпопуляции клеток Th-GM. Важно использовать Т-клеточно-опосредованную модель заболевания у мышей, инициируемую гаптенами или антигенами, имитируя эту активацию у человека. DNFB представляет собой низкомолекулярный гаптен, который является более экономичным и экономящим время, чем пептидные или белковые антигены, для запуска иммунного ответа Т-клеток in vivo18,19

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (No 81602763, 81803142, 82003347), Программой выдающихся исследователей Китайского фонда постдокторантуры (No 2017T100700) и Программой регулярных исследователей Китайского фонда постдокторантуры (No 2016M592673). Авторы хотели бы поблагодарить Ян Ванга и Мэн-Ли Чжу (Male Wang и Meng-Li Zhu) (Основные учреждения Западно-Китайской больницы, Сычуаньский университет) за техническую поддержку проточной цитометрии в этом исследовании.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2,4-динитрофторбензолРЕАГЕНТP0001746CAS NO: 70-34-8
АцетонCHRON CHEMICALS/67-64-1
анти-CD4 антителоBiolegend3005061:100 Разведенное
анти-CD44 антителоBiolegend1030121:100 Разведенное
анти-CD62L антителоBiolegend1044171:100 Разведенное
антитело против GM-CSFBD Bioscience5545071:100 Разбавленное
антитело против ИФН-&гаммаBiolegend5058361:100 Разбавленное
антитело против IL-17ABDBioscience 5633541:100 Разбавленное
антитело против IL-22Biolegend5164115 &микро; L/test
CD45Biolegend1031011:200 Разбавленный
хлоралгидратCHRON CHEMICALS/302-17-0
Циферблатный толщиномер (тип 0,01 мм)PEACOCKG-1A/
DMSOLIFESCIENCESD837167-68-5
EDTA Na2SolarbioE80306381-92-6
F4/80Biolegend1231021:200 Разбавленный
Корректируемый Окрашиватель Жизнеспособности 780BD Bioscience5653881:1,000 Разбавленный, Краситель
Проточный цитометрBD BioscienceBD FACS ARIA II SORP/
GraphPad PrismПрограммное обеспечение GraphPad Программное обеспечениеPrism 7Программное обеспечение для статистики и построения графиков
Набор буферов для внутриклеточной фиксации и пермеабляцииThermo Fisher88-8824-00Свежеприготовленный
иономицинSigma-Aldrich407951CAS NO: 56092-81-0
Ly6GBiolegend1276021:200 Разведенный
NovoExpressAgilent/Программное обеспечение для анализа данных проточной цитометрии; https://www.agilent.com.cn/zh-cn/product/research-flow-cytometry/flow-cytometry-software/novocyte-novoexpress-software-1320805
Оливковое маслоYUANYE BIOS305038001-25-0
PMASigma-AldrichP8139CAS NO: 16561-29-8
Ингибитор переноса белка (содержащий брефельдин A)BD Bioscience5550291 &микро; Л/мл
BT

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rasouli, J., et al. A distinct GM-CSF(+) T helper cell subset requires T-bet to adopt a TH1 phenotype and promote neuroinflammation. Science Immunology. 5 (52), (2020).
  2. Galli, E., et al. GM-CSF and CXCR4 define a T helper cell signature in multiple sclerosis. Nature Medicine. 25 (8), 1290-1300 (2019).
  3. Komuczki, J., et al. Fate-mapping of GM-CSF expression identifies a discrete subset of inflammation-driving T helper cells regulated by cytokines IL-23 and IL-1beta. Immunity. 50 (5), 1289-1304 (2019).
  4. Sheng, W., et al. STAT5 programs a distinct subset of GM-CSF-producing T helper cells that is essential for autoimmune neuroinflammation. Cell Research. 24 (12), 1387-1402 (2014).
  5. Herndler-Brandstetter, D., Flavell, R. A. Producing GM-CSF: a unique T helper subset. Cell Research. 24 (12), 1379-1380 (2014).
  6. Lu, Y., Fu, X. Y., Zhang, Y. In vitro differentiation of mouse granulocyte-macrophage-colony-stimulating Factor (GM-CSF)-producing T Helper (THGM) Cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e58087(2018).
  7. Hu, Y., et al. Interleukin-1beta-induced IRAK1 ubiquitination is required for TH-GM-CSF cell differentiation in T cell-mediated inflammation. Journal of Autoimmunity. 102, 50-64 (2019).
  8. Reynolds, G., et al. Synovial CD4+ T-cell-derived GM-CSF supports the differentiation of an inflammatory dendritic cell population in rheumatoid arthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 75 (5), 899-907 (2016).
  9. Al-Mossawi, M. H., et al. Unique transcriptome signatures and GM-CSF expression in lymphocytes from patients with spondyloarthritis. Nature Communation. 8 (1), 1510(2017).
  10. Wicks, I. P., Roberts, A. W. Targeting GM-CSF in inflammatory diseases. Nature Reviews Rheumatology. 12 (1), 37-48 (2016).
  11. Scheinman, P. L., et al. Contact dermatitis. Nature Reviews Disease Primers. 7 (1), 38(2021).
  12. Pesonen, M., Koskela, K., Aalto-Korte, K. Contact urticaria and protein contact dermatitis in the Finnish Register of Occupational Diseases in a period of 12 years. Contact Dermatitis. 83 (1), 1-7 (2020).
  13. Vocanson, M., Hennino, A., Rozieres, A., Poyet, G., Nicolas, J. F. Effector and regulatory mechanisms in allergic contact dermatitis. Allergy. 64 (12), 1699-1714 (2009).
  14. Gaspari, A. A., Katz, S. I., Martin, S. F. Contact hypersensitivity. Current Protocols in Immunology. 113, 1-7 (2016).
  15. Manresa, M. C. Animal models of contact dermatitis: 2,4-dinitrofluorobenzene-induced contact hypersensitivity. Methods in Molecular Biology. 2223, 87-100 (2021).
  16. Kim, J. H., et al. CD1a on Langerhans cells controls inflammatory skin disease. Nature Immunology. 17 (10), 1159-1166 (2016).
  17. Canene-Adams, K. Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry. Methods in Enzymology. 533, 225-233 (2013).
  18. Achuthan, A., et al. Cytokine-induced acute inflammatory monoarticular arthritis. Methods in Molecular Biology. 1784, 215-223 (2018).
  19. Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Active induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nature Protocols. 1 (4), 1810-1819 (2006).
  20. Kruisbeek, A. M., Shevach, E., Thornton, A. M. Proliferative assays for T cell function. Current Protocols in Immunology. , Chapter 3, Unit 3 (2004).
  21. Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). European Journal of Immunology. 49 (10), 1457(2019).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Th GMTGM CSFCD4 TT24
Видео скоро будет доступно

Похожие статьи