Расширительная микроскопия с удержанием этикеток (LR-ExM) обеспечивает визуализацию со сверхвысоким разрешением и высокоэффективную маркировку

Расширительная микроскопия (ExM) используется исследователями с тех пор, как она была впервые представлена в качестве удобного подхода для достижения изображения сверхвысокого разрешения с помощью обычных микроскопов, таких как эпифлуоресценция и конфокальные микроскопы ^{1,2,3,4,5,6,7} . Используя ExM, можно достичь бокового разрешения ~ 70 нм даже с обычными конфокальными микроскопами. Когда ExM сочетается с изображениями со сверхвысоким разрешением, разрешение еще больше улучшается. Например, можно достичь разрешения примерно 30 нм при структурированной микроскопии освещения (SIM) и примерно 4 нм при стохастической оптической реконструкционной микроскопии (STORM)^1,5.

Однако низкая эффективность маркировки является критической проблемой для стандартных методов ExM. Потеря флуоресценции может варьироваться в зависимости от типа флуоресцентных групп и времени пищеварения. В среднем, однако, сообщалось, что более 50% флуорофоров теряются после полимеризации и стадий переваривания белка ExM, что наносит ущерб качеству изображения ^3,4.

Так, была разработана расширительная микроскопия для удержания меток (LR-ExM), которая может эффективно удерживать метки и уменьшать потери сигнала¹. Ключевым новшеством LR-ExM является использование набора трифункциональных анкеров вместо простого использования флуоресцентных красителей, как в стандартной процедуре ExM, для окрашивания интересующих белков. Эти трифункциональные линкеры состоят из трех частей: (1) соединитель (например, N-гидроксисукцинимид (NHS)) для соединения с антителом, (2) якорь (например, метакриламид (MA)) для закрепления белков к полимеру и (3) репортер (например, биотин или дигоксигенин (DIG)) для сопряжения с органическим красителем. Трифункциональные анкеры выдерживают этапы полимеризации и переваривания белка и, следовательно, предотвращают потерю флуорофора.

Кроме того, этот метод обладает большим потенциалом, поскольку он совместим с самомаркирующими ферментативными тегами, такими как SNAP или CLIP. Ферментативные подходы имеют некоторые преимущества по сравнению с иммуноокрашивающим подходом в отношении высокой специфичности и эффективности маркировки ^8,9,10.

В этой рукописи показана подробная процедура LR-ExM. LR-ExM - это высокоэффективный и гибкий метод для достижения высокого пространственного разрешения с повышенной эффективностью маркировки.

1. Клеточная культура

1. Используйте клетки U2OS, культивируемые в среде McCoy 5A, дополненной 10% FBS при 37 ° C в 5% CO₂.
2. Культивируйте клетки на 16 хорошо съемное камерное покровное стекло (площадь культивирования 0,4^см2) для удобства обработки.

2. Фиксация и пермеабилизация

ПРИМЕЧАНИЕ: Условия фиксации и пермеабилизации зависят от оптимизированных протоколов иммуноокрашения. Ниже приведен протокол фиксации и пермеабилизации для коиммуноразморазвитых микротрубочек и ямок с клатриновым покрытием (CCP).

1. Как только количество клеток достигнет ~0,04 х 10⁶, зафиксируйте ячейки со 100 мкл 3,2% параформальдегида (PFA) в буфере PEM (100 мМ PIPES, 1 мМ EGTA и 1 мМ MgCl₂, pH 6,9) в течение 10 мин при комнатной температуре (таблица 1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Фиксация с помощью PFA выполняется в сертифицированной защитной вытяжке.
2. Промывайте клетки три раза в течение 5 мин каждая 200 мкл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS).
3. Пермеабилизируйте клетки 100 мкл буфера пермеабилизации при комнатной температуре в течение 15 мин (таблица 1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Приступайте к маркировке как можно скорее, чтобы избежать деградации целевого белка, РНК или ДНК и получить оптимальный результат. Однако, если это необходимо, фиксированные образцы могут храниться в течение длительного времени (до месяца) в буфере PBS при 4 °C. Замените любую испарившуюся PBS и защитите образец от фотоотбеливания.

3. Блокирование эндогенного стрептавидина и биотина

1. Инкубировать клетки раствором стрептавидина, разбавленным в клеточном блокирующем буфере (100 мкл) в течение 15 мин при комнатной температуре (таблица 1).
2. Ненадолго промойте 200 мкл буфера блокировки клеток.
3. Инкубировать клетки со 100 мкл раствора биотина, разбавленного в клеточном блокирующем буфере в течение 15 мин при комнатной температуре.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании подхода к самомаркировке тегов, такого как использование тегов SNAP- или CLIP-, пропустите шаг 4 и перейдите к шагу 5.1: подход к самовымещению тегов.

4. Первичное окрашивание антителами

1. Инкубировать клетки с антителом против α-тубулина крыс (разведение 1:500) и антителом с тяжелой цепью против клатрина кролика (разведение 1:100) в 100 мкл буфера блокировки клеток в течение 16 ч при 4 °C или 1 ч при комнатной температуре. Удвоение времени инкубации образцов тканей.
2. Промывайте образцы четыре раза 200 мкл PBS в течение 5 минут каждый.

5. Окрашивание LR-ExM специфическими вторичными антителами

1. Конъюгируют антитела IgG с трифункциональными линкерами, такими как N-гидроксисукцинимид (NHS) - метакриламид (MA) -биотин или NHS-MA-Digoxigenin (Dig) (Рисунок 1B). Синтез трифункциональных якорей и конъюгация вторичных антител ранее введены в Shi et ^al.1. Подход к самовымещению маркировки: конъюгированные антитела IgG с трифункциональными линкерами, такими как MA-бензилгуанин (BG)-Биотин или MA-бензилцитозин (BC)-Dig (Рисунок 1B). Синтез трифункциональных якорей и конъюгация вторичных антител ранее введены в Shi et ^al.1.
2. Инкубировать клетки с ослиными анти-кролик-Dig-MA (разведение 1:100) и ослиным анти-крысо-биотин-МА (1:100 разведение) вторичными антителами в 100 мкл клеточного блокирующего буфера в течение 1 ч при комнатной температуре. Удвойте это время инкубации для образцов тканей.
3. Промывайте образцы четыре раза в 200 мкл PBS в течение 5 минут каждый.

6. Дополнительная анкеровка

1. Инкубировать клетки с 0,25% глутаровым альдегидом (GA) в PBS (100 мкл) в течение 15 мин при комнатной температуре, чтобы закрепить белки на гидрогеле. В качестве альтернативы для анкеровки используют эфир метакриловой кислоты N-гидроксисукцинимида (MA-NHS) 25 мМ. Рекомендуется одночасовая инкубация при комнатной температуре.
2. Промывайте образцы три раза в PBS в течение 5 минут каждый.

7. Гелеобразование

ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость расширения определяется временем диффузии соли и воды наружу или в гель; таким образом, литье тонких гелей ускоряет время расширения.

1. Удалите верхнюю структуру 16-луночной гелевой пластины. Добавьте 40 мкл раствора мономера в каждую лунку, чтобы кондиционировать клетки на льду. Инкубировать на льду в течение 5 мин.
   1. Для приготовления раствора мономера см. Таблицу 2.
2. Приготовьте гелеобразный раствор на льду. Добавьте двойную дистиллированную воду и 10% N,N,N',N' тетраметилэтилендиамина (TEMED) в раствор мономера (10% TEMED: раствор мономера = 1:47); пока не добавляйте инициатора (таблица 3).
3. Для камеры клеточной культуры площадью 0,4^см2 используют гелеобразующий раствор объемом около 40 мкл. Приготовьте 45 мкл гелеобразующего раствора для каждой лунки.
4. Добавьте 10% персульфат аммония (APS) в гелеобразный раствор, инкубируйте на льду и немедленно выпейте 40 мкл раствора для гелеобразования в каждую силиконовую прокладку на льду. Инкубировать на льду в течение 3 мин (10% APS:10% TEMED:раствор мономера = 1:1:47).
5. Защитите образец от света и переместите покровное стекло в чашке Петри 10 см в инкубатор при температуре 37 °C в течение 1,5 ч для гелеобразования. Чтобы сохранить влажность геля во время инкубации 37 °C, накройте чашку Петри крышкой и положите несколько капель воды в чашку Петри.

8. Пищеварение

1. После гелеобразования снимите стакан, чтобы отделить гель и переложить гель на 6-луночную пластину. Переваривайте внедренные клетки с 2 мл буфера пищеварения (таблица 1) в течение ночи при комнатной температуре или 4 ч при 37 °C. Используйте не менее 10-кратного избыточного объема буфера пищеварения.
2. Гели для мытья с по крайней мере 10-кратным избыточным объемом воды, чем конечный объем геля. Повторяйте этап стирки четыре раза в течение 20-30 минут каждый раз. Гель расширяется примерно в два раза в каждом измерении.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы геля могут храниться до 1 месяца в буфере PBS при 4 °C. Замените испарившуюся воду, чтобы избежать высыхания и защитить образец от света во время хранения. Чтобы избежать деградации трифункциональных анкеров, образцы следует окрашивать как можно скорее после переваривания и промывки.

9. Флуоресцентное окрашивание после пищеварения

1. Инкубировать гели в буфере окрашивания стрептавидином (STV)/дигоксигенином (DIG) объемом 2 мл с STV-красителем от 2 до 5 мкМ и/или анти-DIG-красителем в течение 24 ч при комнатной температуре. Храните образцы в темноте.

10. Расширение

1. Вымойте и разверните гель четыре раза, запивая водой (2-3 мл) в течение 30 мин до 1 ч каждый раз.
2. Для более легкой визуализации клеток под флуоресцентной микроскопией окрашивайте клетки с помощью DAPI во время третьей из пяти промывок. Разбавить концентрацию запаса DAPI (5 мг/мл, хранить при 4 °C) в 1:5000 разведениях в промывочной воде. Инкубировать гель водным раствором DAPI (2 мл) в течение 30 мин - 1 ч.
3. Два дополнительных раза промыть 3 мл воды.
4. Разверните гели в любой плоской посуде, которая достаточно велика, чтобы содержать образцы. Расширенные гели, которые готовятся на покровном стекле площадью 0,4^см2 , хорошо вписываются в стеклянную нижнюю 6-луночную пластину.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы, окрашенные после расширения, могут храниться до 4 месяцев в буфере PBS при 4°C. Добавьте достаточно воды, чтобы избежать высыхания и защитить образец от фотоотбеливания. Повторите этап расширения и окрашивания DAPI перед визуализацией. Чтобы избежать риска деградации флуорофоров, образцы должны быть изображены как можно скорее.

11. Визуализация

1. Покройте камеру визуализации 6-луночного стеклянного дна 0,01% поли-L-лизином (по 3 мл каждая), чтобы обездвижить образцы геля.
2. Перенесите образцы геля в камеру визуализации с покрытием.
3. Изобразите образцы с любыми желаемыми флуоресцентными прицелами.

Котлованные ямы (CCP), покрытые клатрином, иммуноокрашены с использованием трифункциональных анкеров (рисунок 1B), а LR-ExM выполняется, как описано на рисунке 1A. LR-ExM (Рисунок 2C,E) показывает гораздо более высокую интенсивность флуоресценции по сравнению с микроскопией расширения удержания белка (proExM, Рисунок 2A) или биотин-ExM (Рисунок 2B); сигнал для LR-ExM был примерно в шесть раз выше, чем proExM (рисунок 2D). LR-ExM может эффективно захватывать небольшие структуры, такие как CCP, которые даже меньше дифракционного предела (рисунок 2F, G).

Некоторые репрезентативные результаты LR-ExM демонстрируются с использованием иммуноокрашающего подхода. Микротрубочки и CCP коиммунорашиваются с использованием трифункциональных анкеров, включая NHS-MA-DIG и NHS-MA-биотин (рисунок 3A, B). LR-ExM доступен для ферментативного подхода, основанного на тегах. Результат демонстрируется с использованием трифункциональных анкеров BG-MA-biotin (для SNAP-tag) и BC-MA-DIG (для CLIP-tag) на рисунке 3C-F. Кроме того, в LR-ExM можно сочетать как иммуноокрашающий, так и белково-меточный подход, как показано на рисунке 3G-J. Из этих результатов подтверждается, что LR-ExM полезен для получения высококачественных изображений с повышенной эффективностью маркировки и разрешением.

LR-ExM также показывает отличную производительность в образцах тканей. LR-ExM выполняется на мозговой ткани мыши путем совместного иммуноиммунажения пресинаптического маркера фагота и постсинаптического маркера Homer1. Эти две метки четкие и хорошо разделенные, которые поддерживают высокое разрешение и эффективность маркировки (рисунок 4A-E).

Рисунок 1: Рабочий процесс микроскопии расширения удержания этикеток (LR-ExM). (A) Рабочий процесс LR-ExM. (B) Схемы трифункциональных анкеров. Эта цифра была изменена по сравнению с Shi et al.1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Количественная оценка удержания сигнала (A-C) Расширительная микроскопия (ExM) конфокальные изображения ям с покрытием клатрином (CCP) в клетках U2OS, косвенно иммуноокрашенных для клатрина с тяжелой цепью (POI). (A) Удержание белка ExM (ProExM) с использованием AF488-конъюгированных вторичных антител. (B) ExM с пострасширяющей маркировкой с использованием биотин-конъюгированных антител. (C) LR-ExM с использованием антител, конъюгированных с трифункциональными якорями NHS-MA-biotin. Образцы в B и C после расширения окрашены стрептавидином-AF488. D) Количественная оценка интенсивности А-С. Полосы ошибок представляют SD. n = 3 для каждого случая. Коэффициенты расширения длины для изображений в A, B, C и E-G составляют 4,3, 4,5, 4,6 и 4,3 соответственно. Коэффициент расширения длины для образцов, используемых на графике D, составляет 4,5 ± 0,2. Шкала баров, 500 нм (A-C и E) и 100 нм (F и G). Все весовые стержни находятся в блоках предварительного расширения. Арб. у., произвольные единицы; СТВ, стрептавидин. Все изображения получены с помощью вращающегося дискового конфокального микроскопа (Nikon CSU-W1) с 60-кратным водоиммерным объективом (NA1.27). Эта цифра была изменена по сравнению с Shi et al.1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Репрезентативные результаты LR-ExM с использованием конфокальных микроскопов. (A,B) LR-ExM конфокальные изображения микротрубочек, помеченных NHS-MA-биотин-конъюгированными вторичными антителами (пурпурный) и CCP, помеченных NHS-MA-DIG-конъюгированными вторичными антителами (зеленый) в клетке U2OS. (B) Увеличенный вид. (С-Ф) Конфокальные изображения LR-ExM CCP и/или митохондрий в клетках HeLa, помеченные с использованием подхода к белковой метке (C) помеченного тегом SNAP клатрина, (D) меченого тегом CLIP TOMM20 и (E) двухцветного изображения. (F) Увеличенный вид. (G) Двухцветные конфокальные изображения LR-ExM с использованием комбинации иммуноокрашивающего подхода (NPC, red hot) и подхода с белковой меткой (помеченный SNAP lamin A/C (голубой)). (H) Увеличенный вид. (I,J) Виды отдельных каналов H. Обратите внимание, что цитоплазматический фон в G вызван антителом против NUP153. Коэффициенты расширения длины для изображений в форматах A-B: 4,7, C-D: 4,4, E-F: 4,5 и G-J равны 4,5. Шкала баров, 1 мкм для A, 200 нм для B и F, 500 нм для C-E, 2 мкм для G и 500 нм для H, I и J. Все весовые стержни находятся в блоках предварительного расширения. Все изображения получены с помощью вращательно-дискового конфокального микроскопа (Nikon CSU-W1) с 60-кратным водомерным объективом (NA1.27). Эта цифра была изменена по сравнению с Shi et al.1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Репрезентативные результаты LR-ExM на образцах тканей. (A) LR-ExM конфокальное изображение среза мозга мыши, косвенно иммуноокрашенного для пресинаптического маркера фагота (пурпурного) и постсинаптического маркера Homer1 (зеленый). (В,С) Увеличенные изображения синапсов. (Д,Д) Поперечные профили интенсивности вдоль длинных осей желтой коробки. Фагот помечен NHS-MA-DIG-конъюгированными вторичными антителами, а Homer1 помечен NHS-MA-биотин-конъюгированными вторичными антителами. Все образцы после расширения окрашиваются стрептавиндином-AF488 и/или анти-дигоксином-AF594. Коэффициенты расширения длины для изображений в форматах A-C равны 4,2. Шкала стержней, 1 мкм (A) и 200 нм (B,C). Все весовые стержни находятся в блоках предварительного расширения. Все изображения получены с помощью вращательно-дискового конфокального микроскопа (Nikon CSU-W1) с 60-кратным водомерным объективом (NA1.27). Эта цифра была изменена по сравнению с Shi et al.1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Химические вещества и буферы Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Таблица 2: Мономерное решение Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Таблица 3: Раствор для гелеобразования Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.