Методическая статья

Расширительная микроскопия с удержанием этикеток (LR-ExM) обеспечивает визуализацию со сверхвысоким разрешением и высокоэффективную маркировку

3.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/63793

⸱

11 октября 2022 г.

 ,  , 
1Center for Complex Biological Systems, University of California Irvine, 2Department of Developmental and Cell Biology, University of California Irvine, 3Department of Chemistry, University of California Irvine

В этой статье

Краткое содержание

Показан протокол расширительной микроскопии удержания этикеток (LR-ExM). LR-ExM использует новый набор трифункциональных анкеров, который обеспечивает лучшую эффективность маркировки по сравнению с ранее введенными микроскопиями расширения.

Аннотация

Расширительная микроскопия (ExM) - это метод подготовки образцов, который можно комбинировать с большинством методов световой микроскопии для увеличения разрешения. После встраивания клеток или тканей в набухающий гидрогель образцы могут быть физически расширены в три-шестнадцать раз (линейный размер) по сравнению с исходным размером. Поэтому эффективное разрешение любого микроскопа увеличивается на коэффициент расширения. Основным ограничением ранее введенного ExM является снижение флуоресценции после полимеризации и процедуры пищеварения. Чтобы преодолеть это ограничение, была разработана расширительная микроскопия для удержания меток (LR-ExM), которая предотвращает потерю сигнала и значительно повышает эффективность маркировки с использованием набора новых трифункциональных анкеров. Этот метод позволяет достичь более высокого разрешения при исследовании клеточных или субклеточных структур в нанометрическом масштабе с минимальными потерями флуоресцентного сигнала. LR-ExM может использоваться не только для иммунофлуоресцентной маркировки, но и с самомаркировкой белковых меток, таких как SNAP- и CLIP-метки, тем самым достигая более высокой эффективности маркировки. В этой работе представлена процедура и устранение неполадок для этого подхода, основанного на иммуноокрашении, а также обсуждение подходов к самомаркировке маркировки LR-ExM в качестве альтернативы.

Введение

Расширительная микроскопия (ExM) используется исследователями с тех пор, как она была впервые представлена в качестве удобного подхода для достижения изображения сверхвысокого разрешения с помощью обычных микроскопов, таких как эпифлуоресценция и конфокальные микроскопы 1,2,3,4,5,6,7 . Используя ExM, можно достичь бокового разрешения ~ 70 нм даже с обычными конфокальными микроскопами. Когда ExM сочетается с изображениями со сверхвысоким разрешением, разрешение еще больше улучшается. Например, можно достичь разрешения примерно 30 нм при структурированной микроскопии освещения (SIM) и примерно 4 нм при стохастической оптической реконструкционной микроскопии (STORM)1,5.

Однако низкая эффективность маркировки является критической проблемой для стандартных методов ExM. Потеря флуоресценции может варьироваться в зависимости от типа флуоресцентных групп и времени пищеварения. В среднем, однако, сообщалось, что более 50% флуорофоров теряются после полимеризации и стадий переваривания белка ExM, что наносит ущерб качеству изображения 3,4.

Так, была разработана расширительная микроскопия для удержания меток (LR-ExM), которая может эффективно удерживать метки и уменьшать потери сигнала1. Ключевым новшеством LR-ExM является использование набора трифункциональных анкеров вместо простого использования флуоресцентных красителей, как в стандартной процедуре ExM, для окрашивания интересующих белков. Эти трифункциональные линкеры состоят из трех частей: (1) соединитель (например, N-гидроксисукцинимид (NHS)) для соединения с антителом, (2) якорь (например, метакриламид (MA)) для закрепления белков к полимеру и (3) репортер (например, биотин или дигоксигенин (DIG)) для сопряжения с органическим красителем. Трифункциональные анкеры выдерживают этапы полимеризации и переваривания белка и, следовательно, предотвращают потерю флуорофора.

Кроме того, этот метод обладает большим потенциалом, поскольку он совместим с самомаркирующими ферментативными тегами, такими как SNAP или CLIP. Ферментативные подходы имеют некоторые преимущества по сравнению с иммуноокрашивающим подходом в отношении высокой специфичности и эффективности маркировки 8,9,10.

В этой рукописи показана подробная процедура LR-ExM. LR-ExM - это высокоэффективный и гибкий метод для достижения высокого пространственного разрешения с повышенной эффективностью маркировки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Клеточная культура

  1. Используйте клетки U2OS, культивируемые в среде McCoy 5A, дополненной 10% FBS при 37 ° C в 5% CO2.
  2. Культивируйте клетки на 16 хорошо съемное камерное покровное стекло (площадь культивирования 0,4см2) для удобства обработки.

2. Фиксация и пермеабилизация

ПРИМЕЧАНИЕ: Условия фиксации и пермеабилизации зависят от оптимизированных протоколов иммуноокрашения. Ниже приведен протокол фиксации и пермеабилизации для коиммуноразморазвитых микротрубочек и ямок с клатриновым покрытием (CCP).

  1. Как только количество клеток достигнет ~0,04 х 106, зафиксируйте ячейки со 100 мкл 3,2% параформальдегида (PFA) в буфере PEM (100 мМ PIPES, 1 мМ EGTA и 1 мМ MgCl2, pH 6,9) в течение 10 мин при комнатной температуре (таблица 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Фиксация с помощью PFA выполняется в сертифицированной защитной вытяжке.
  2. Промывайте клетки три раза в течение 5 мин каждая 200 мкл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS).
  3. Пермеабилизируйте клетки 100 мкл буфера пермеабилизации при комнатной температуре в течение 15 мин (таблица 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Приступайте к маркировке как можно скорее, чтобы избежать деградации целевого белка, РНК или ДНК и получить оптимальный результат. Однако, если это необходимо, фиксированные образцы могут храниться в течение длительного времени (до месяца) в буфере PBS при 4 °C. Замените любую испарившуюся PBS и защитите образец от фотоотбеливания.

3. Блокирование эндогенного стрептавидина и биотина

  1. Инкубировать клетки раствором стрептавидина, разбавленным в клеточном блокирующем буфере (100 мкл) в течение 15 мин при комнатной температуре (таблица 1).
  2. Ненадолго промойте 200 мкл буфера блокировки клеток.
  3. Инкубировать клетки со 100 мкл раствора биотина, разбавленного в клеточном блокирующем буфере в течение 15 мин при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании подхода к самомаркировке тегов, такого как использование тегов SNAP- или CLIP-, пропустите шаг 4 и перейдите к шагу 5.1: подход к самовымещению тегов.

4. Первичное окрашивание антителами

  1. Инкубировать клетки с антителом против α-тубулина крыс (разведение 1:500) и антителом с тяжелой цепью против клатрина кролика (разведение 1:100) в 100 мкл буфера блокировки клеток в течение 16 ч при 4 °C или 1 ч при комнатной температуре. Удвоение времени инкубации образцов тканей.
  2. Промывайте образцы четыре раза 200 мкл PBS в течение 5 минут каждый.

5. Окрашивание LR-ExM специфическими вторичными антителами

  1. Конъюгируют антитела IgG с трифункциональными линкерами, такими как N-гидроксисукцинимид (NHS) - метакриламид (MA) -биотин или NHS-MA-Digoxigenin (Dig) (Рисунок 1B). Синтез трифункциональных якорей и конъюгация вторичных антител ранее введены в Shi et al.1. Подход к самовымещению маркировки: конъюгированные антитела IgG с трифункциональными линкерами, такими как MA-бензилгуанин (BG)-Биотин или MA-бензилцитозин (BC)-Dig (Рисунок 1B). Синтез трифункциональных якорей и конъюгация вторичных антител ранее введены в Shi et al.1.
  2. Инкубировать клетки с ослиными анти-кролик-Dig-MA (разведение 1:100) и ослиным анти-крысо-биотин-МА (1:100 разведение) вторичными антителами в 100 мкл клеточного блокирующего буфера в течение 1 ч при комнатной температуре. Удвойте это время инкубации для образцов тканей.
  3. Промывайте образцы четыре раза в 200 мкл PBS в течение 5 минут каждый.

6. Дополнительная анкеровка

  1. Инкубировать клетки с 0,25% глутаровым альдегидом (GA) в PBS (100 мкл) в течение 15 мин при комнатной температуре, чтобы закрепить белки на гидрогеле. В качестве альтернативы для анкеровки используют эфир метакриловой кислоты N-гидроксисукцинимида (MA-NHS) 25 мМ. Рекомендуется одночасовая инкубация при комнатной температуре.
  2. Промывайте образцы три раза в PBS в течение 5 минут каждый.

7. Гелеобразование

ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость расширения определяется временем диффузии соли и воды наружу или в гель; таким образом, литье тонких гелей ускоряет время расширения.

  1. Удалите верхнюю структуру 16-луночной гелевой пластины. Добавьте 40 мкл раствора мономера в каждую лунку, чтобы кондиционировать клетки на льду. Инкубировать на льду в течение 5 мин.
    1. Для приготовления раствора мономера см. Таблицу 2.
  2. Приготовьте гелеобразный раствор на льду. Добавьте двойную дистиллированную воду и 10% N,N,N',N' тетраметилэтилендиамина (TEMED) в раствор мономера (10% TEMED: раствор мономера = 1:47); пока не добавляйте инициатора (таблица 3).
  3. Для камеры клеточной культуры площадью 0,4см2 используют гелеобразующий раствор объемом около 40 мкл. Приготовьте 45 мкл гелеобразующего раствора для каждой лунки.
  4. Добавьте 10% персульфат аммония (APS) в гелеобразный раствор, инкубируйте на льду и немедленно выпейте 40 мкл раствора для гелеобразования в каждую силиконовую прокладку на льду. Инкубировать на льду в течение 3 мин (10% APS:10% TEMED:раствор мономера = 1:1:47).
  5. Защитите образец от света и переместите покровное стекло в чашке Петри 10 см в инкубатор при температуре 37 °C в течение 1,5 ч для гелеобразования. Чтобы сохранить влажность геля во время инкубации 37 °C, накройте чашку Петри крышкой и положите несколько капель воды в чашку Петри.

8. Пищеварение

  1. После гелеобразования снимите стакан, чтобы отделить гель и переложить гель на 6-луночную пластину. Переваривайте внедренные клетки с 2 мл буфера пищеварения (таблица 1) в течение ночи при комнатной температуре или 4 ч при 37 °C. Используйте не менее 10-кратного избыточного объема буфера пищеварения.
  2. Гели для мытья с по крайней мере 10-кратным избыточным объемом воды, чем конечный объем геля. Повторяйте этап стирки четыре раза в течение 20-30 минут каждый раз. Гель расширяется примерно в два раза в каждом измерении.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы геля могут храниться до 1 месяца в буфере PBS при 4 °C. Замените испарившуюся воду, чтобы избежать высыхания и защитить образец от света во время хранения. Чтобы избежать деградации трифункциональных анкеров, образцы следует окрашивать как можно скорее после переваривания и промывки.

9. Флуоресцентное окрашивание после пищеварения

  1. Инкубировать гели в буфере окрашивания стрептавидином (STV)/дигоксигенином (DIG) объемом 2 мл с STV-красителем от 2 до 5 мкМ и/или анти-DIG-красителем в течение 24 ч при комнатной температуре. Храните образцы в темноте.

10. Расширение

  1. Вымойте и разверните гель четыре раза, запивая водой (2-3 мл) в течение 30 мин до 1 ч каждый раз.
  2. Для более легкой визуализации клеток под флуоресцентной микроскопией окрашивайте клетки с помощью DAPI во время третьей из пяти промывок. Разбавить концентрацию запаса DAPI (5 мг/мл, хранить при 4 °C) в 1:5000 разведениях в промывочной воде. Инкубировать гель водным раствором DAPI (2 мл) в течение 30 мин - 1 ч.
  3. Два дополнительных раза промыть 3 мл воды.
  4. Разверните гели в любой плоской посуде, которая достаточно велика, чтобы содержать образцы. Расширенные гели, которые готовятся на покровном стекле площадью 0,4см2 , хорошо вписываются в стеклянную нижнюю 6-луночную пластину.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы, окрашенные после расширения, могут храниться до 4 месяцев в буфере PBS при 4°C. Добавьте достаточно воды, чтобы избежать высыхания и защитить образец от фотоотбеливания. Повторите этап расширения и окрашивания DAPI перед визуализацией. Чтобы избежать риска деградации флуорофоров, образцы должны быть изображены как можно скорее.

11. Визуализация

  1. Покройте камеру визуализации 6-луночного стеклянного дна 0,01% поли-L-лизином (по 3 мл каждая), чтобы обездвижить образцы геля.
  2. Перенесите образцы геля в камеру визуализации с покрытием.
  3. Изобразите образцы с любыми желаемыми флуоресцентными прицелами.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Котлованные ямы (CCP), покрытые клатрином, иммуноокрашены с использованием трифункциональных анкеров (рисунок 1B), а LR-ExM выполняется, как описано на рисунке 1A. LR-ExM (Рисунок 2C,E) показывает гораздо более высокую интенсивность флуоресценции по сравнению с микроскопией расширения удержания белка (proExM, Рисунок 2A) или биотин-ExM (Рисунок 2B); сигнал ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Ключевым новшеством LR-ExM является использование трифункциональных якорей для эффективной маркировки целевых белков и улучшения качества изображения. Этот метод ограничен трифункциональными якорями, которые не так легко доступны исследователям. Тем не менее, трифункциональные якоря могут быть переданы другим исследователям по запросу, и аналогичные продукты, такие как зонды ExM от Chrometa, теперь также коммерчески доступны.

В этом протоколе инкубация 1 ч при комнатной температуре была выполн...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения США (R00 GM126136 to X.S.), Национальным научным фондом США (DMS1763272 to S.P.) и Фондом Саймонса (594598 S.P.).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Акриламид Сигма А9099 ExM гель
AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgGJackson ImmunoResearchH+L, 711– 005-152Антитело
AffiniPure Donkey Anti-Rat IgGJackson ImmunoResearchH+L, 712– 005-153Антитело
Alexa Fluor 488-стрептавидинJackson ImmunoResearch016-540-084Флуоресцентные зонды 
Alexa Fluor 594 СтрептавидинJackson ImmunoResearch016-580-084Флуоресцентные зонды 
Alexa Fluor 647 СтрептавидинJackson ImmunoResearch016-600-084Флуоресцентные зонды 
Персульфат аммония Сигма А3678 ExM гель
anti-H3K4me3Abcamab8580Антитело
anti-H3K9me3Abcamab176916Антитело
DAPI дилацетатThermofisher ScientificD3571Флуоресцентные зонды 
DyLight 488 меченый анти-дигоксигенин/дигоксин (DIG)Vector LaboratoriesDI-7488Флуоресцентные зонды 
DyLight 594 меченый анти-дигоксигенин/дигоксин (DIG)Vector LaboratoriesDI-7594Флуоресцентные зонды 
EGTAEMD Millipore Corp.324626-25GMФиксирующий буфер
этилендиаминтетрауксусная кислотаСигма ЭДТАБуфер для пищеварения
Глутаральдегид 10% ЭМ КлассЭлектронная микроскопия Науки50-262-13Анкеринг
Grace Bio-Labs CultureХорошо съемное камерное защитное стеклоGrace Bio-Labs GBL112358-8EAКамера для клеточных культур
Grace Bio-Labs CultureWell removal toolGrace Bio-Labs GBL103259Инструмент для удаления
Guanidine HCl Сигма G3272 Буфер для разложения
Хлорид магнияSigmaM8266-1KGФиксирующий буфер
McCoy's 5aATCC30– 2007Клеточная культуральная среда
Метакриловая кислота N-гидроксисукцинимид эфир, 98%  (MA-NHS)Сигма 730300-1GАнкеринг
моноклонального мышиного антитела против Nup153 Abcamab24700антитела
N,N′ Метиленбисакриламид Сигма M7279 ExM гель
N,N,N′,N′ Тетраметилэтилендиамин (ТЕМЕД)Сигма Т7024 ExM гель
16% параформальдегид водные растворыЭлектронная микроскопия науки50-980-487Фиксирующий буфер
PIPESSigmaP6757-25GФиксирующий буфер
поли-L-лизинSigmaP8920-100MLПокрытие камеры
Proteinase K Sigma-AldrichP4850-5MLБуфер для пищеварения
Кролик против клатрина с тяжелой цепью антителAbcamab21679Антитело
крысы против – &альфа;-тубулин антитело,тирозинированный, клон YL1/2миллипоры SigmaMAB1864-Iантитела
акрилата натрия Sigma408220ExM Гель
Стрептавидин / Набор для блокирования биотинаVector LaboratoriesSP-2002Блокирующий буфер
Tris-HCl Технологии жизни AM9855 Буфер для разложения
U2OSATCCHTB-96Клеточная линия
6-луночные стеклянные донные пластиныCellvisP06-1.5H-NВизуализирующая пластина

Ссылки

  1. Shi, X., et al. Label-retention expansion microscopy. The Journal of Cell Biology. 220 (9), 202105067(2021).
  2. Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
  3. Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).
  4. Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy. Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).
  5. Wang, Y., et al. Combined expansion microscopy with structured illumination microscopy for analyzing protein complexes. Nature Protocols. 13 (8), 1869-1895 (2018).
  6. Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
  7. Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super resolution imaging of three-dimensional protein localization in size adjustable tissues. Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).
  8. Gautier, A., et al. An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells. Chemistry & Biology. 15 (2), 128-136 (2008).
  9. Keppler, A., Pick, H., Arrivoli, C., Vogel, H., Johnsson, K. Labeling of fusion proteins with synthetic fluorophores in live cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (27), 9955-9959 (2004).
  10. Thevathasan, J. V., et al. Nuclear pores as versatile reference standards for quantitative super resolution microscopy. Nature Methods. 16 (10), 1045-1053 (2019).
  11. Truckenbrodt, S., et al. X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes. EMBO Reports. 19 (19), 45836(2018).
  12. Damstra, H. G. J., et al. Visualizing cellular and tissue ultrastructure using Ten-fold Robust Expansion Microscopy (TREx). eLife. 11, 73775(2021).
  13. M'Saad, O., Bewersdorf, J. Light microscopy of proteins in their ultrastructural context. Nature Communications. 11 (1), 3850(2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи