Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Поддразнивание взаимодействия между естественными клетками-киллерами и нейронами ноцицепторов

2.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/63800

⸱

30 июня 2022 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology and Physiology, Université de Montréal

В этой статье

Краткое содержание

Ноцицепторные нейроны и NK-клетки активно взаимодействуют в воспалительном контексте. Кокультурный подход позволяет изучать это взаимодействие.

Аннотация

Соматосенсорные нейроны эволюционировали для обнаружения вредных раздражителей и активации защитных рефлексов. Разделяя средства связи, ноцицепторные нейроны также настраивают защиту хозяина, контролируя активность иммунной системы. Связь между этими системами в основном адаптивная, помогая защитить гомеостаз, она также может привести или способствовать возникновению хронических заболеваний. Обе системы совместно эволюционировали, чтобы обеспечить такое локальное взаимодействие, как в первичных и вторичных лимфоидных тканях и слизистой оболочке. Недавние исследования показали, что ноцицепторы непосредственно обнаруживают и реагируют на чужеродные антигены, цитокины, полученные из иммунных клеток, и микробы.

Активация ноцицепторов не только приводит к гиперчувствительности к боли и зуду, но и снижает порог срабатывания ноцицепторов, что приводит к локальному высвобождению нейропептидов. Пептиды, которые вырабатываются периферическими терминалами ноцицепторов и высвобождаются из них, могут блокировать хемотаксис и поляризацию лимфоцитов, контролируя локализацию, продолжительность и тип воспаления. Последние данные показывают, что сенсорные нейроны взаимодействуют с врожденными иммунными клетками через клеточный контакт, например, привлекая рецепторы группы 2D (NKG2D) на клетках-естественных киллерах (NK).

Учитывая, что NK-клетки экспрессируют родственные рецепторы для различных медиаторов, продуцируемых ноцицепторами, вполне возможно, что ноцицепторы используют нейропептиды для контроля активности NK-клеток. Здесь мы разрабатываем метод кокультуры для изучения взаимодействия ноцицепторных нейронов и NK-клеток в чашке. Используя этот подход, мы обнаружили, что поясничные ноцицепторные нейроны уменьшают экспрессию цитокинов NK-клеток. В целом, такой редукционистский метод может быть полезен для изучения того, как иннервирующие опухоль нейроны контролируют противоопухолевую функцию NK-клеток и как NK-клетки контролируют устранение поврежденных нейронов.

Введение

Клеточные тела сенсорных нейронов берут свое начало в дорсальных корневых ганглиях (ДРГ). ДРГ расположены в периферической нервной системе (ПНС), между дорсальным рогом спинного мозга и периферическими нервными окончаниями. Псевдоуниполярная природа нейронов ДРГ позволяет передавать информацию от периферической ветви, которая иннервирует ткань-мишень, к центральной ветви, которая несет соматосенсорную информацию к спинному мозгу1. Используя специализированные рецепторы ионных каналов, нейроны первого порядка ощущают угрозы, создаваемые патогенами, аллергенами и загрязняющими веществами2, что приводит к притоку катионов (Na+, Ca2+) и генерации потенциала действия 3,4,5.

Эти нейроны также посылают антидромный потенциал действия к периферии, где произошло первоначальное ощущение опасности, что приводит к локальному высвобождению нейропептидов 1,4. Поэтому нейроны ноцицептора служат защитным механизмом, предупреждая хозяина об экологической опасности 4,5,6,7.

Для связи с нейронами второго порядка ноцицепторы высвобождают различные нейротрансмиттеры (например, глутамат) и нейропептиды (например, пептид, связанный с геном кальцитонина (CGRP), вещество P (SP) и вазоактивный кишечный пептид (VIP))6,7. Эти пептиды действуют на капилляры и способствуют экстравазации плазмы, отекам, а также местному притоку и модуляции иммунных клеток 2,4,7.

Соматосенсорная и иммунная системы используют общую систему связи, состоящую из цитокинов и нейропептидов, и их соответствующих родственных рецепторов4. Хотя эта двунаправленная связь помогает защитить от опасности и сохранить гомеостаз, она также может способствовать патофизиологии заболевания4.

NK-клетки классифицируются как врожденные лимфоидные клетки и специализируются на устранении вирусно инфицированных клеток. Функция NK-клеток регулируется балансом стимулирующих и тормозных рецепторов, включая активирующий рецептор NKG2D8. Эндогенный лиганд NKG2D, ранняя индуцируемая ретиноевая кислота1 (RAE1), экспрессируется клетками, подвергающимися стрессу, такому как опухолевый генез и инфекция 8,9.

Недавние исследования показали, что повреждение периферических нервов заставляет сенсорные нейроны экспрессировать дезадаптивные молекулы, такие как статмин 2 (STMN2) и RAE1. Таким образом, через клеточно-клеточный контакт NKG2D-экспрессирующие NK-клетки активировались взаимодействием с RAE1-экспрессирующими нейронами. В свою очередь, NK-клетки смогли устранить поврежденные нейроны ноцицептора и тупую болевую гиперчувствительность, обычно связанную с повреждением нерва10. В дополнение к оси NKG2D-RAE1, NK-клетки экспрессируют родственные рецепторы для различных медиаторов, продуцируемых ноцицепторами. Поэтому возможно, что эти медиаторы модулируют активность NK-клеток. В данной работе представлен метод кокультуры для исследования биологии взаимодействия нейрон-NK-клетка ноцицептора. Этот подход поможет продвинуть понимание того, как нейроны ноцицепторов модулируют врожденные иммунные клеточные реакции на травму, инфекцию или злокачественность.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Институциональные комитеты по уходу за животными и их использованию Монреальского университета (#22053, #22054) одобрили все процедуры для животных. Список растворов и их состав см. в Таблице 1 , а в Таблице материалов — список материалов, оборудования и реагентов, используемых в настоящем протоколе.

1. Выделение, культивирование и стимуляция NK-клеток

  1. Генерация неповрежденного ноцицепторного нейрона (контроль помета; TRPV1wt::D TAfl/wt) и абляционные (TRPV1cre::D TAfl/wt) мыши путем скрещивания мышей с токсином lox-stop-lox-diphtheria (DTAfl/fl) с мышами TRPV1cre/wt .
  2. Используя ингаляциюCO2 , усыплите наивную мышь для контроля помета (TRPV1wt: :D TAfl / wt).
  3. Соберите селезенку в микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл, содержащую 500 мкл стерильного фосфат-буферного физиологического раствора (PBS).
  4. Гомогенизируйте селезенку с помощью пестика.
  5. Разбавить клетки 1 мл стерильного PBS.
  6. Отфильтруйте смесь через клеточный сетчатый фильтр 50 мкм в коническую трубку объемом 15 мл.
  7. Доливайте объем (10 мл) стерильным PBS.
  8. Соберите 10 мкл и подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра.
  9. Центрифугируют клетки (500 × г, 5 мин) и удаляют супернатант.
  10. Повторное суспендирование клеток в концентрации 108 клеток/мл в дополненной среде RPMI 1640.
  11. Следуйте инструкциям производителя для магнитной очистки NK-клеток селезенки с помощью комплекта изоляции NK-клеток мыши. Подтвердите чистоту NK-клеток с помощью проточной цитометрии11.
  12. Соберите 10 мкл и подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра.
  13. Центрифугируют клетки (500 × г, 5 мин) и удаляют супернатант.
  14. Повторное суспендирование NK-клеток в дополненной питательной среде RPMI 1640 (содержащей IL-2 и IL-15).
  15. Культивирование 2 × 106 NK-клеток/мл в 96-луночной U-образной нижней пластине в течение 48 ч.

2. Изоляция и культивирование нейронов DRG

  1. За 24 ч до окончания стимуляции NK-клеток (стадия 1.15) покрывают 96-луночную пластину 100 мкл/лунку ламинина (1 нг/мл) и инкубируют в течение 45 мин (37°С).
  2. После инкубации удалите раствор и дайте лункам высохнуть на воздухе в шкафу для биобезопасности.
  3. Используя ингаляциюCO2 , усыпляют неповрежденный нейрон ноцицептора (контроль помета; TRPV1wt: :D TAfl / wt) или абляционные (TRPV1cre: :D TAfl / wt) мыши.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вдыхание CO2 предпочтительнее шейного вывиха, поскольку оно позволяет избежать нарушения спинномозговых нервов, связанных с DRG.
  4. Закрепите мышь на доске в положении лежа, поднимите кожу и прорежьте кожу вдоль спинного столба. Обратитесь к Perner et al. для подробного видео12.
  5. Отрежьте пояснично-крестцовый сустав и отделите крестец от поясничного отдела позвоночника ножницами.
  6. Отделите позвоночник, разрезав мышцы и ребра с обеих сторон позвоночника в черепном направлении, пока не будет достигнуто основание черепа.
  7. С помощью ножниц отрежьте позвоночник в атланто-затылочном суставе.
  8. Удалить мышечную и жировую ткань из позвоночника.
  9. Закрепите и откройте позвоночный столб, чтобы удалить спинной мозг и получить доступ к DRG. Ищите ДРГ в межпозвоночной форамине, соединенной со спинным мозгом через дорсальный корень, но отделенной от мозговых оболочек.
  10. Соберите DRG в коническую трубку объемом 15 мл, заполненную 10 мл DMEM, дополненной ледяным холодом.
  11. Центрифугируют препарат (200 × г, 5 мин, комнатной температуры) и удаляют надосадочное вещество.
  12. Добавьте 250 мкл PBS, содержащего коллагеназу IV (1 мг/мл) и диспазу II (2,4 Ед/мл).
  13. Инкубировать ДРГ с раствором коллагеназы IV/Dispase II (C/D) (80 мин, 37 °C, легкое перемешивание). При объединении ганглиев от нескольких мышей поддерживайте соотношение 125 мкл раствора C/D на ганглий.
  14. Чтобы инактивировать ферменты, добавьте 5 мл добавленной среды DMEM.
  15. Центрифугируют раствор (200 × г, 5 мин) и аккуратно удаляют супернатант с помощью пипетки.
  16. Чтобы избежать нежелательной потери клеток, оставьте ~ 100 мкл супернатанта.
  17. Добавьте 1 мл дополненной среды DMEM.
  18. Используя пипетку и три стеклянные пипетки Пастера уменьшающихся размеров, аккуратно тритурируйте (~ 10 вверх / вниз на размер пипетки Пастера) DRG в одноклеточный препарат.
  19. В кабинете биобезопасности разводят бычий сывороточный альбумин (BSA) в стерильном PBS до конечной концентрации 15%. Хранить 1 мл аликвоты при −20 °C.
  20. Создайте градиент BSA в конической трубке объемом 15 мл, добавив 2 мл стерильного PBS и медленно дозируя 1 мл 15% раствора BSA в нижней части трубки. Избегайте нарушения градиента, аккуратно удалив пипетку.
  21. Используя пипетку P200, медленно пипетку тритурированной суспензии ганглиев (которая содержит нейроны) на стороне трубки в градиент.
  22. Центрифуга нейронсодержащего градиента BSA (200 × г, 12 мин, комнатная температура). Установите ускорение и замедление центрифуги на минимальную скорость.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После центрифугирования нейроны будут находиться в нижней части трубки, в то время как обломки клеток будут захвачены в градиенте BSA.
  23. Аккуратно удалите все супернатанты с помощью пипетки.
  24. Повторное суспендирование клеток в 500 мкл нейробазала.
  25. Пластина 104 нейрона на лунку (200 мкл нейробазальной/луночной) в пластине с ламининовым покрытием и плоским дном из 96 лунок.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В среднем, исследователь сможет заполнить ~ 8 скважин на мышь.
  26. Культивируйте нейроны (37 °C, ночью), чтобы обеспечить прикрепление.

3. Кокультура и проточная цитометрия

  1. Медленно удаляют нейробазаль из культуры нейронов.
  2. После 48 ч стимуляции IL-2 и IL-15 (см. шаги 1.14-1.15) повторно суспендировать NK-клетки и добавить 105 NK-клеток/лунку в культуру нейронов (96-луночная плоская нижняя пластина).
    ПРИМЕЧАНИЕ: В среднем, исследователь сможет заполнить ~ 6 скважин на мышь.
  3. Совместно культивирование клеток в дополненном нейробазальном MX (37 °C, 48 ч).
  4. Соберите ячейки, промыть PBS (3x) и центрифугой (500 × g, 5 мин, 4 °C).
  5. Откажитесь от надотворного вещества и окрашивайте клетки красителем жизнеспособности eFlour-780 (1:1000, 15 мин, 4 °C).
  6. Собрать ячейки, промыть PBS (3x) и центрифугой (500 × г, 5 мин, 4 °C).
  7. Блокирует неспецифические участки на клетках с CD16/32 (1:100, 15 мин, 4 °C).
  8. Собрать ячейки, промыть PBS (3x) и центрифугой (500 × г, 5 мин, 4 °C).
  9. Окрашивание (15 мин, 4 °C) клеток анти-NK-1.1 (1:100), флуоресцеина изотиоцианата (FITC) анти-NKp46 (1:100) и фикоэритрина (PE) анти-GM-CSF (1:100).
  10. Собрать ячейки, промыть PBS (3x) и центрифугой (500 × г, 5 мин, 4 °C).
  11. Отбросьте супернатант, повторно суспендируйте клетки в буфере FACS (500 мкл) и иммунофенотипе NK-клеток методом проточной цитометрии11. См. рисунок 1A для стратегии гатинга.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

NK-клетки были магнитно очищены от контрольных (TRPV1wt: :D TAfl / wt) спленоцитов мышей и стимулировали (48 ч) IL-2 и IL-15. Затем NK-клетки культивировали отдельно или совместно культивировали с нейронами DRG, собранными из неповрежденного ноцицепторного нейрона (контроль помета; TRPV1wt: :D TAfl / wt) или абляционные (TRPV1cre: :D TAfl / wt) мыши. Затем клетки подвергались воздействию агониста TRPV1 капсаицина (1 мкМ) или его носителя. После 24 ч совмес...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Davies et al.11 обнаружили, что поврежденные нейроны повышают регуляцию RAE1. Благодаря клеточно-клеточному контакту NKG2D-экспрессирующие NK-клетки смогли идентифицировать и устранить нейроны RAE1+ , которые, в свою очередь, ограничивают хроническую боль11. Учитывая, что NK-клетки также экспрессируют различные нейропептидные рецепторы, и что эти нейропептиды известны своими иммуномодулирующими способностями, становится все более важным изучать взаимодей...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Благодарности

Эта работа была поддержана Фондом новых рубежей в исследованиях (NFRFE201901326), Канадскими институтами исследований в области здравоохранения (162211, 461274, 461275), Канадским фондом инноваций (37439), Канадской программой исследовательской кафедры (950-231859), Советом по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады (RGPIN-2019-06824) и Фондом исследований природы Квебека и технологий (253380).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Анти-мышь CD16/32Jackson LaboratoryКошачий No: 017769
B-27Jackson LaboratoryКошачий No: 009669
Бычья сыворотка Альбумин (BSA) культуральный классWorld Precision InstrumentsКошачий No: 504167
BV421 антимышиный NK-1.1Fisher ScientificКошачий No: 12430112
Клеточный фильтр (50 μ m)Fisher ScientificCat No: A3160702
Collagenase IVFisher ScientificCat No: 15140148
Diphteria toxinfl/flFisherScientificCat No: SH3057402
Dispase IIFisher ScientificCat No: 13-678-20B
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Fisher ScientificCat No: 07-200-95
EasySep Mouse NK Cell Isolation KitNo: CLS2595
Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)SigmaCat No: C0130
FACSAria IIISigmaCat no: 04942078001
Фетальная бычья сыворотка (FBS)SigmaCat No: 806552
FITC anti-mouse NKp46SigmaCat No: L2020
Планшет с плоским дном 96 лунокSigmaНомер для катания: 03690
Стеклянная пипетка ПастераSigmaНомер для катания: 470236-274
Нейротрофический фактор глиальных клеток (GDNF)VWRНомер для катания: 02-0131
ЛамининCedarlaneНомер для катания: 03-50/31
L-глютаминGibcoНомер для катания: A14867-01
Мышь рекомбинантный IL-15GibcoНомер для катания: 22400-089
Мышиный рекомбинантный IL-2GibcoНомер для катания: 21103-049
Фактор роста нервов (NGF)Life TechnologiesNo для катания: 13257-019
Нейробазальная средаPeproTech: 450-51-10
PE анти-мышь GM-CSFPeproTechNo для животных: 212-12
Пенициллин и СтрептомицинPeproTechКошка No: 210-15
PestlesТехнология стволовых клетокКошка No: 19855
Фосфатный буферный физиологический раствор (PBS)BiolegendКошка No: 108732Клон PK136
RPMI 1640 mediaBiolegendКошка No: 137606Клон 29A1.4
TRPV1CreBiolegendКошка No: 505406Клон MP1-22E9
Пинцет и инструменты для препарирования.BiolegendNo для катания: 65-0865-14
U-образное дно 96-луночная пластинаBiolegendNo для катания: 101319
Viability Dye eFlour-780Becton Dickinson
No для животных

Ссылки

  1. Berta, T., Qadri, Y., Tan, P. H., Ji, R. R. Targeting dorsal root ganglia and primary sensory neurons for the treatment of chronic pain. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 21 (7), 695-703 (2017).
  2. Baral, P., et al. Nociceptor sensory neurons suppress neutrophil and gammadelta T cell responses in bacterial lung infections and lethal pneumonia. Nature Medicine. 24, 417-426 (2018).
  3. Binshtok, A. M., et al. Nociceptors are interleukin-1beta sensors. Journal of Neuroscience. 28 (52), 14062-14073 (2008).
  4. Chesne, J., Cardoso, V., Veiga-Fernandes, H. Neuro-immune regulation of mucosal physiology. Mucosal Immunology. 12 (1), 10-20 (2019).
  5. Samad, T. A., et al. Interleukin-1beta-mediated induction of Cox-2 in the CNS contributes to inflammatory pain hypersensitivity. Nature. 410 (6827), 471-475 (2001).
  6. Godinho-Silva, C., et al. Light-entrained and brain-tuned circadian circuits regulate ILC3s and gut homeostasis. Nature. 574, 254-258 (2019).
  7. Talbot, J., et al. Feeding-dependent VIP neuron-ILC3 circuit regulates the intestinal barrier. Nature. 579, 575-580 (2020).
  8. Raulet, D. H., Gasser, S., Gowen, B. G., Deng, W., Jung, H. Regulation of ligands for the NKG2D activating receptor. Annual Review of Immunology. 31, 413-441 (2013).
  9. Vivier, E., et al. Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells. Science. 331, 44-49 (2011).
  10. Davies, A. J., et al. Natural Killer Cells Degenerate Intact Sensory Afferents following Nerve Injury. Cell. 176, 716-728 (2019).
  11. Perner, C., Sokol, C. L. Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release. STAR Protocols. 2, 100333(2021).
  12. Goswami, S. C., et al. Molecular signatures of mouse TRPV1-lineage neurons revealed by RNA-Seq transcriptome analysis. Journal of Pain. 15, 1338-1359 (2014).
  13. Mishra, S. K., Tisel, S. M., Orestes, P., Bhangoo, S. K., Hoon, M. A. TRPV1-lineage neurons are required for thermal sensation. EMBO J. 30, 582-593 (2011).
  14. Kim, H. S., et al. Attenuation of natural killer cell functions by capsaicin through a direct and TRPV1-independent mechanism. Carcinogenesis. 35, 1652-1660 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Взаимодействие нейронов и иммунной системыметод совместного культивированияспинномозговой ганглийпроточная цитометрияэкспрессия цитокиновсекреция нейропептидовизоляция спинномозговых ганглиевфункция NK-клеток
Поддразнивание взаимодействия между естественными клетками-киллерами и нейронами ноцицепторов
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.