Ноцицепторные нейроны и NK-клетки активно взаимодействуют в воспалительном контексте. Кокультурный подход позволяет изучать это взаимодействие.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Поддразнивание взаимодействия между естественными клетками-киллерами и нейронами ноцицепторов
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Соматосенсорные нейроны эволюционировали для обнаружения вредных раздражителей и активации защитных рефлексов. Разделяя средства связи, ноцицепторные нейроны также настраивают защиту хозяина, контролируя активность иммунной системы. Связь между этими системами в основном адаптивная, помогая защитить гомеостаз, она также может привести или способствовать возникновению хронических заболеваний. Обе системы совместно эволюционировали, чтобы обеспечить такое локальное взаимодействие, как в первичных и вторичных лимфоидных тканях и слизистой оболочке. Недавние исследования показали, что ноцицепторы непосредственно обнаруживают и реагируют на чужеродные антигены, цитокины, полученные из иммунных клеток, и микробы.
Активация ноцицепторов не только приводит к гиперчувствительности к боли и зуду, но и снижает порог срабатывания ноцицепторов, что приводит к локальному высвобождению нейропептидов. Пептиды, которые вырабатываются периферическими терминалами ноцицепторов и высвобождаются из них, могут блокировать хемотаксис и поляризацию лимфоцитов, контролируя локализацию, продолжительность и тип воспаления. Последние данные показывают, что сенсорные нейроны взаимодействуют с врожденными иммунными клетками через клеточный контакт, например, привлекая рецепторы группы 2D (NKG2D) на клетках-естественных киллерах (NK).
Учитывая, что NK-клетки экспрессируют родственные рецепторы для различных медиаторов, продуцируемых ноцицепторами, вполне возможно, что ноцицепторы используют нейропептиды для контроля активности NK-клеток. Здесь мы разрабатываем метод кокультуры для изучения взаимодействия ноцицепторных нейронов и NK-клеток в чашке. Используя этот подход, мы обнаружили, что поясничные ноцицепторные нейроны уменьшают экспрессию цитокинов NK-клеток. В целом, такой редукционистский метод может быть полезен для изучения того, как иннервирующие опухоль нейроны контролируют противоопухолевую функцию NK-клеток и как NK-клетки контролируют устранение поврежденных нейронов.
Введение
Клеточные тела сенсорных нейронов берут свое начало в дорсальных корневых ганглиях (ДРГ). ДРГ расположены в периферической нервной системе (ПНС), между дорсальным рогом спинного мозга и периферическими нервными окончаниями. Псевдоуниполярная природа нейронов ДРГ позволяет передавать информацию от периферической ветви, которая иннервирует ткань-мишень, к центральной ветви, которая несет соматосенсорную информацию к спинному мозгу1. Используя специализированные рецепторы ионных каналов, нейроны первого порядка ощущают угрозы, создаваемые патогенами, аллергенами и загрязняющими веществами2, что приводит к притоку катионов (....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Институциональные комитеты по уходу за животными и их использованию Монреальского университета (#22053, #22054) одобрили все процедуры для животных. Список растворов и их состав см. в Таблице 1 , а в Таблице материалов — список материалов, оборудования и реагентов, используемых в настоящем протоколе.
1. Выделение, культивирование и стимуляция NK-клеток
- Генерация неповрежденного ноцицепторного нейрона (контроль помета; TRPV1wt::D TAfl/wt) и абляционные (TRPV1cre::D TAfl/wt) мыши путем скрещивания мышей с токсином lox-stop-lox-diphtheria (....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
NK-клетки были магнитно очищены от контрольных (TRPV1wt: :D TAfl / wt) спленоцитов мышей и стимулировали (48 ч) IL-2 и IL-15. Затем NK-клетки культивировали отдельно или совместно культивировали с нейронами DRG, собранными из неповрежденного ноцицепторного нейрона (контроль помета; TRPV1wt: :D TAfl / wt) или абляционные (TRPV1cre: :D TAfl / wt) мыши. Затем клетки подвергались воздействию агониста TRPV1 капсаицина (1 мкМ) или его носителя. После 24 ч совмес.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Davies et al.11 обнаружили, что поврежденные нейроны повышают регуляцию RAE1. Благодаря клеточно-клеточному контакту NKG2D-экспрессирующие NK-клетки смогли идентифицировать и устранить нейроны RAE1+ , которые, в свою очередь, ограничивают хроническую боль11. Учитывая, что NK-клетки также экспрессируют различные нейропептидные рецепторы, и что эти нейропептиды известны своими иммуномодулирующими способностями, становится все более важным изучать взаимодей.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.
Благодарности
Эта работа была поддержана Фондом новых рубежей в исследованиях (NFRFE201901326), Канадскими институтами исследований в области здравоохранения (162211, 461274, 461275), Канадским фондом инноваций (37439), Канадской программой исследовательской кафедры (950-231859), Советом по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады (RGPIN-2019-06824) и Фондом исследований природы Квебека и технологий (253380).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Анти-мышь CD16/32 | Jackson Laboratory | Кошачий No: 017769 | |
| B-27 | Jackson Laboratory | Кошачий No: 009669 | |
| Бычья сыворотка Альбумин (BSA) культуральный класс | World Precision Instruments | Кошачий No: 504167 | |
| BV421 антимышиный NK-1.1 | Fisher Scientific | Кошачий No: 12430112 | |
| Клеточный фильтр (50 μ m) | Fisher Scientific | Cat No: A3160702 | |
| Collagenase IV | Fisher Scientific | Cat No: 15140148 | |
| Diphteria toxinfl/flFisher | Scientific | Cat No: SH3057402 | |
| Dispase II | Fisher Scientific | Cat No: 13-678-20B | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Fisher Scientific | Cat No: 07-200-95 | |
| EasySep Mouse NK Cell Isolation Kit | No: CLS2595 | ||
| Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) | Sigma | Cat No: C0130 | |
| FACSAria III | Sigma | Cat no: 04942078001 | |
| Фетальная бычья сыворотка (FBS) | Sigma | Cat No: 806552 | |
| FITC anti-mouse NKp46 | Sigma | Cat No: L2020 | |
| Планшет с плоским дном 96 лунок | Sigma | Номер для катания: 03690 | |
| Стеклянная пипетка Пастера | Sigma | Номер для катания: 470236-274 | |
| Нейротрофический фактор глиальных клеток (GDNF) | VWR | Номер для катания: 02-0131 | |
| Ламинин | Cedarlane | Номер для катания: 03-50/31 | |
| L-глютамин | Gibco | Номер для катания: A14867-01 | |
| Мышь рекомбинантный IL-15 | Gibco | Номер для катания: 22400-089 | |
| Мышиный рекомбинантный IL-2 | Gibco | Номер для катания: 21103-049 | |
| Фактор роста нервов (NGF) | Life Technologies | No для катания: 13257-019 | |
| Нейробазальная среда | PeproTech | : 450-51-10 | |
| PE анти-мышь GM-CSF | PeproTech | No для животных: 212-12 | |
| Пенициллин и Стрептомицин | PeproTech | Кошка No: 210-15 | |
| Pestles | Технология стволовых клеток | Кошка No: 19855 | |
| Фосфатный буферный физиологический раствор (PBS) | Biolegend | Кошка No: 108732 | Клон PK136 |
| RPMI 1640 media | Biolegend | Кошка No: 137606 | Клон 29A1.4 |
| TRPV1Cre | Biolegend | Кошка No: 505406 | Клон MP1-22E9 |
| Пинцет и инструменты для препарирования. | Biolegend | No для катания: 65-0865-14 | |
| U-образное дно 96-луночная пластина | Biolegend | No для катания: 101319 | |
| Viability Dye eFlour-780 | Becton Dickinson |
Ссылки
- Berta, T., Qadri, Y., Tan, P. H., Ji, R. R. Targeting dorsal root ganglia and primary sensory neurons for the treatment of chronic pain. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 21 (7), 695-703 (2017).
- Baral, P., et al.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
