Методическая статья

Демонстрация иннервации волосатой и гламурной кожи в 3D-паттерне с использованием нескольких флуоресцентных подходов к окрашиванию и очистке тканей

DOI:

10.3791/63807

⸱

20 мая 2022 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Acupuncture and Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Толщина тканевых срезов ограничивала морфологическое исследование иннервации кожи. Настоящий протокол описывает уникальную технику очистки тканей для визуализации кожных нервных волокон в толстых 300 мкм участках ткани под конфокальной микроскопией.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Иннервация кожи является важной частью периферической нервной системы. Хотя изучение кожных нервных волокон быстро прогрессировало, большая часть понимания их распределительных и химических характеристик исходит из обычного гистохимического и иммуногистохимического окрашивания тонких участков тканей. С развитием техники очистки тканей стало возможным просматривать кожные нервные волокна на более толстых участках ткани. Настоящий протокол описывает множественные флуоресцентные окрашивания на участках тканей толщиной 300 мкм от подошвенной и дорсальной кожи задних лап крыс, двух типичных волосистых и блестящих участков кожи. Здесь пептид, связанный с геном кальцитонина, маркирует сенсорные нервные волокна, в то время как фаллоидин и эндотелиальный гиалуроновый рецептор лимфатических сосудов 1 помечают кровеносные и лимфатические сосуды соответственно. Под конфокальным микроскопом меченые сенсорные нервные волокна полностью отслеживались на более длинной дистанции, бегая пучками в глубоком кожном слое и фристайлом в поверхностном слое. Эти нервные волокна проходили параллельно или окружали кровеносные сосуды, а лимфатические сосуды образовывали трехмерную (3D) сеть в волосатой и блестящей коже. Текущий протокол обеспечивает более эффективный подход к изучению иннервации кожи, чем существующие традиционные методы с точки зрения методологии.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Кожа, самый большой орган в организме, служащий ключевым интерфейсом к окружающей среде, плотно иннервируется многими нервными волокнами 1,2,3. Хотя иннервация кожи была широко изучена ранее с помощью различных гистологических методов, таких как окрашивание на цельных участках кожи и тканей 4,5,6, подробная эффективная демонстрация кожных нервных волокон по-прежнему является проблемой 7,8. Учитывая это, настоящий протокол разработал уникальную технику для более четкого отображения кожных нервных волокон в толстом срезе ткани.

Из-за ограничения по толщине срезов наблюдение за иннервированными нервными волокнами кожи недостаточно точно, чтобы точно изобразить взаимосвязь между нервными волокнами, связанными с геном кальцитонина (CGRP), и местными тканями и органами из полученной информации изображения. Появление технологии 3D очистки тканей обеспечивает осуществимый метод решения этой проблемы 9,10. Быстрое развитие подходов к очистке тканей предложило много инструментов для изучения тканевых структур, целых органов, нейронных проекций и целых животных в последнее время11. Прозрачная кожная ткань может быть изображена в гораздо более толстом срезе с помощью конфокальной микроскопии для получения данных для визуализации кожных нервных волокон.

В текущем исследовании подошвенная и спинная кожа задней лапы крысы была выбрана в качестве двух целевых участков волосатой и блестящей кожи 3,4,7. Чтобы проследить кожные нервные волокна на большем расстоянии, кожную ткань разрезали толщиной 300 мкм для иммуногистохимического и гистохимического окрашивания с последующей очисткой тканей. CGRP использовали для маркировки сенсорных нервных волокон12,13. Кроме того, для выделения кожных нервных волокон на тканевом фоне дополнительно использовали фаллоидин и эндотелиальный гиалуроновый рецептор лимфатических сосудов 1 (LYVE1) для маркировки кровеносных и лимфатических сосудов соответственно14,15.

Эти подходы обеспечили простой метод, который может быть применен для демонстрации изображения кожных нервных волокон с высоким разрешением, а также для визуализации пространственной корреляции между нервными волокнами, кровеносными сосудами и лимфатическими сосудами в коже, что может предоставить гораздо больше информации для понимания гомеостаза нормальной кожи и изменения кожи в патологических условиях.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Настоящее исследование было одобрено Комитетом по этике Института иглоукалывания и прижигания Китайской академии китайских медицинских наук (регистрационный номер D2018-04-13-1). Все процедуры проводились в соответствии с Руководством Национальных институтов здравоохранения по уходу за лабораторными животными и их использованию (National Academy Press, Washington, D.C., 1996). В этом исследовании использовались три взрослых самца крыс (Sprague-Dawley, вес 230 ± 15 г). Все животные были размещены в 12-часовом цикле света / темноты с контролируемой температурой и влажностью и имели свободный доступ к пище и воде.

1. Перфузия и пробоподготовка

  1. Вводят 250 мг/кг раствора трибромэтанола (см. Таблицу материалов) внутрибрюшинно крысе, чтобы вызвать эвтаназию.
  2. Как только дыхание остановится, используйте хирургические ножницы из нержавеющей стали, чтобы открыть грудную полость крысы. Используйте иглы 20 г для перфузии через левый сердечный желудочек13 со скоростью 3 мл/мин со 100 мл 0,9% нормального физиологического раствора, а затем 250-300 мл 4% параформальдегида в 0,1 М фосфатного буфера (ПБ, рН 7,4) (Рисунок 1А,В).
  3. После перфузии используйте скальпель, чтобы удалить кожу спинки и подошвы с задней лапы.
    1. Для образцов, требующих замороженного сечения, постфиксируют ткани в 4% параформальдегиде в 0,1 М ПБ в течение 2 ч; затем криопротекция тканей в 25% сахарозы в 0,1 М ПБ в течение более 24 ч при 4 °C
    2. Для образцов с толстым сечением, требующим очистки тканей, постфиксируют ткани в 4% параформальдегиде в 1x фосфатно-буферном физиологическом растворе (1x PBS) в течение 2 ч; затем криопротекция тканей в 1x PBS при 4 °C (рисунок 1C–E).

2. Тройное флуоресцентное окрашивание CGRP, фаллоидином и LYVE1 с последующей очисткой тканей

ПРИМЕЧАНИЕ: Тройное флуоресцентное окрашивание с CGRP, фаллоидином и LYVE1 было применено для выявления нервных волокон, кровеносных сосудов и лимфатических сосудов в волосистой и блестящей коже на участках тканей толщиной 300 мкм после очистки тканей.

  1. Готовят 2% агарозы в 1x PBS путем нагревания в микро-печи в течение 2 мин до растворения агарозы (см. Таблицу материалов).
  2. После промывания вставить ткани кожи в 2% агарозу при 37 °C и поместить их внутрь ледяного ящика для охлаждения (рисунок 1F, G).
  3. Зафиксируйте навесные ткани на вибрационном микротоме ледяной водой и нарежьте их толщиной 500 мкм в поперечном направлении. Используйте следующие параметры для установки вибрационного слайсера и финишной нарезки: скорость 0,50 мм/с и амплитуда 1,5 мм (рисунок 1H-K).
  4. После нарезки удалите агарозу из срезов и храните их в шестилуночной пластине с 1x PBS (рН 7,4) (рисунок 1л).
  5. Инкубируют участки ткани в растворе 2% Тритона Х-100 в 1x PBS (TriX-PB) в течение ночи при 4 °C. Следующая процедура приведена на рисунке 2 .
  6. Поместите участки ткани в блокирующий буфер и вращайте на шейкере со скоростью 72 оборота в сутки при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Блокирующий буферный состав составляет 10% обычной ослиной сыворотки, 1% Triton-X 100 и 0,2% азида натрия в 1x PBS (см. Таблицу материалов).
  7. Переложить участки ткани в раствор, содержащий первичные антитела мышиного моноклонального анти-CGRP (1:500) и овечьего поликлонального анти-LYVE1 антитела (1:500) в буфере разведения в микроцентрифужной трубке (см. Таблицу материалов), и вращать на шейкере в течение 2 дней при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Буферный состав разведения составляет 1% обычной ослиной сыворотки, 0,2% Triton-X 100 и 0,2% азида натрия в 1x PBS.
  8. Дважды вымойте участки тканей с помощью промывочного буфера при комнатной температуре, затем держите их на шейкере в течение ночи при 4 °C в буфере для промывки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Моющий буферный состав составляет 0,2% Triton-X 100 в 0,1 М ПБ (рН 7,4).
  9. На следующий день перекладывают участки тканей в смешанный раствор, содержащий вторичные антитела ослиной антимышиной IgG H&L Alexa-Flour488 (1:500) и ослиной антиовечьей трубки IgG H&L Alexa-Flour405 (1:500), а также фаллоидин Alexa-Flour594 (1:1000) (см. Таблицу материалов) в микроцентрифужной трубке и вращают на шейкере со скоростью 72 об/мин в течение 5 ч при 4 °C.
  10. Промыть участки ткани в шестилуночной пластине с промывочным буфером в течение 1 ч, дважды, при комнатной температуре. Держите участки ткани в моющем буфере на шейкере в течение ночи при 4 °C.
  11. Перенесите срезы ткани в реагент очистки тканей (см. Таблицу материалов, его объем был в пять раз больше объема образца) и вращайте на шейкере со скоростью 60 об/мин осторожно в течение 1 ч при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После этого лечения участки тканей становятся четкими (рисунок 2B).
  12. Установите очищенные ткани на предметное стекло, обведите ткани распоркой и заклейте щель свежим реагентом для очистки тканей и обложек.

3. Тройное флуоресцентное окрашивание CGRP, фаллоидином и LYVE1 в соответствии с традиционным подходом

ПРИМЕЧАНИЕ: Для сравнения, такое же окрашивание проводилось на участках тканей толщиной 30 мкм по обычным методикам.

  1. Нарежьте участки ткани на 30 мкм на микротоме в поперечном направлении и установите их на слайд.
  2. Добавьте блокирующий раствор с 3% обычной ослиной сывороткой и 0,3% Тритоном Х-100 в 0,1 М ПБ и инкубируйте секции в течение 30 мин при комнатной температуре.
  3. Удаляют блокирующий раствор и инкубируют участки с раствором, содержащим первичные антитела мышиного моноклонального анти-CGRP (1:500) и овечьего поликлонального анти-LYVE1 антитела (1:500) в буфере разведения на ночь при 4 °C.
  4. На следующий день промыть участки тканей с 0,1 М ПБ (рН 7,4) трижды, добавить смешанный раствор, содержащий вторичные антитела ослиной антимышиной IgG H&L Alexa-Flour488 (1:500) и ослиной антиовечьей IgG H&L Alexa-Flour405 (1:500), а также фаллоидин Alexa-Flour594 (1:1000) и инкубировать в течение 1 ч при комнатной температуре.
  5. Перед микроскопическим наблюдением промыть срезы в 0,1 М ПБ (рН 7,4) три раза, затем покрыть их покровными пластинками в 50% глицерине.

4. Визуализация и анализ

  1. Наблюдайте за окрашенными образцами под флуоресцентным микроскопом, а затем делайте снимки с помощью конфокального микроскопа.
  2. Захватите 30 изображений (Z-стеков), каждое в кадрах по 10 мкм, из каждого участка толщиной 300 мкм и интегрируйте одно изображение в фокусе с помощью процессора изображений системы конфокальной микроскопии (см. Таблицу материалов).
    1. Выполните следующие шаги в программном обеспечении для обработки изображений конфокальной установки для трехмерного (3D) анализа: Set Start Focal Plane | Установка концевой | фокальной плоскости Установка размера шага | Выберите | «Узор глубины» | захвата изображений Серия Z.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Длины волн возбуждения и излучения синих флуоресцентных сигналов составляли 401 нм и 421 нм соответственно. Длины волн возбуждения и излучения зеленых флуоресцентных сигналов составляли 499 нм и 519 нм соответственно. Длины волн возбуждения и излучения красных флуоресцентных сигналов составляли 591 нм и 618 нм соответственно. 152 мкм - диаметр конфокального точечного отверстия (объектив 10x, NA: 0,4). Разрешение захвата изображения составило 1024 × 1024 пикселей.
  3. Для обычных образцов (этап 3) захватите 30 изображений (Z-стеки) в кадрах по 1 мкм из каждого участка толщиной 30 мкм и далее обработайте эти изображения, как указано выше (шаги 4.1-4.2).
  4. Демонстрация изображений в схеме 3D-реконструкции с помощью системы обработки изображений.
  5. Выполняйте 3D-реконструкции путем импорта конфокальных изображений Z-стека в Imaris 9.0 (программное обеспечение для визуализации клеток, см. Таблица материалов) и создавайте визуализацию поверхностей на основе интенсивности пятен: добавление новых поверхностей | Выберите исходный канал | Определите параметры в параметре «Гладкость» | Определите параметры в пороговом параметре абсолютной интенсивности | Классификация поверхностей | Отделка.
  6. Получение данных в области поверхности положительных нервных волокон с помощью программного обеспечения для визуализации клеток. Выберите | визуализированного изображения Статистические | Подробный | Конкретные значения | Объем.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

После тройного флуоресцентного окрашивания нервные волокна, кровеносные сосуды и лимфатические сосуды были четко помечены CGRP, фаллоидином и LYVE1, соответственно, в волосистой и блестящей коже (рисунок 3,4). При очищающем лечении CGRP-положительные нервные волокна, фаллоидин-положительные кровеносные сосуды и LYVE1-положительные лимфатические сосуды могут быть визуализированы на большей глубине, чтобы получить полную структурную информацию кожи (рисуно...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Настоящее исследование обеспечивает подробную демонстрацию кожных нервных волокон в волосистой и блестящей коже с использованием иммунофлуоресценции на более толстых участках тканей с очищающей обработкой и 3D-видом, чтобы лучше понять иннервацию кожи. Важное значение имеет время инкубации антител до 1-2 дней и ночной процесс очистки. Эти два ключевых шага непосредственно влияют на эффект иммунофлуоресцентного окрашивания толстых срезов. Еще одна проблема была поднята из-за выбора антител, не все из которых подходят для ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано Инновационным фондом Китайской академии медицинских наук (Код проекта No. CI2021A03404) и Национальный междисциплинарный инновационный фонд традиционной китайской медицины (код проекта No. ZYYCXTD-D-202202).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1x фосфатно-солевой буферSolarbio Life SciencesP1020pH 7,2-7,4, 0,01 моль
2,2,2-триброметанолSigma Life ScienceT48402-5G Конфокальная
флуоресцентная микроскопияOlympus CorporationFluoview FV1200
Donkey anti-mouse IgG H& L Alexa-Flour488Abcam plc.ab150105
Ослиный антиовечий IgG H& L Alexa-Flour405Abcam plc.ab175676
Трубка EPWuxi NEST Biotechnology Co.6150011,5 мл
Морозильная ступень скользящая микротомная системаLeica BiosystemsCM1860
Imaris SoftwareOxford Instrumentsv.9.0.1
IRIS стандартные ножницыWPI (World Precision Instruments Inc.)
iSpacerSunJin Lab co.IS005
Micro щипцы-StrRWDF11020-11
Мышиное моноклональное антитело против CGRPSanta cruz biotechnology, Inc.sc-57053
Нейтральный буферизованный формалинSolarbio Life SciencesG216110%
Нормальная ослиная сывороткаJackson ImmunoResearch Laboratories017-000-1210 мл
Перистальтический насосLong Precision Pump Co., LtdBT300-2J
Фаллоидин Alexa-Fluor 594Thermo Fisher ScientificA12381
RapiClear 1.52 решениеSunJin Lab co.RC15200110 мл
обычной агарозыGene Company LimitedG-10
SEMKEN 1 x 2 Щипцы для тканей зубов-StrRWDF13038-12
Овечьи поликлональные антитела против LYVE1R& D Systems, Inc.AF7939
Шестилуночная пластинаCorning Incorporated3335
Азид натрияSigma Life ScienceS200225 г
СахарозаSigma Life ScienceV900116500 г
Супер КлейHenkel AG & Co.Pattex 502
Хирургические ручкиRWDS32003-12
Triton X-100Solarbio Life Sciences9002-93-1100 мл
уретанаSigma Life ScienceU2500500 г
VANNAS пружинные ножницыRWDS1014-12
Вибрационный микротомLeica BiosystemsVT1200S
503242

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vidal Yucha, S. E., Tamamoto, K. A., Kaplan, D. L. The importance of the neuro-immuno-cutaneous system on human skin equivalent design. Cell Proliferation. 52 (6), 12677(2019).
  2. Wu, H., Williams, J., Nathans, J. Morphologic diversity of cutaneous sensory afferents revealed by genetically directed sparse labeling. Elife. 1, 00181(2012).
  3. Pomaville, M. B., Wright, K. M. Immunohistochemical and genetic labeling of hairy and glabrous skin innervation. Currents Protocols. 1 (5), 121(2021).
  4. Navarro, X., Verdú, E., Wendelscafer-Crabb, G., Kennedy, W. R. Innervation of cutaneous structures in the mouse hind paw: a confocal microscopy immunohistochemical study. Journal of Neuroscience Research. 41 (1), 111-120 (1995).
  5. Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology. Journal of Visualized Experiments. (88), e51749(2014).
  6. Yamazaki, T., Li, W., Mukouyama, Y. S. Whole-mount confocal microscopy for adult ear skin: a model system to study neuro-vascular branching morphogenesis and immune cell distribution. Journal of Visualized Experiments. (133), e57406(2018).
  7. Hendrix, S., Picker, B., Liezmann, C., Peters, E. M. Skin and hair follicle innervation in experimental models: a guide for the exact and reproducible evaluation of neuronal plasticity. Experimental Dermatology. 17 (3), 214-227 (2008).
  8. Salz, L., Driskell, R. R. Horizontal whole mount: a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-sections of skin. Journal of Visualized Experiments. (126), e56106(2017).
  9. Yokomizo, T., et al. Whole-mount three-dimensional imaging of internally localized immunostained cells within mouse embryos. Nature Protocols. 7 (3), 421-431 (2012).
  10. Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).
  11. Pende, M., et al. High-resolution ultramicroscopy of the developing and adult nervous system in optically cleared Drosophila melanogaster. Nature Communications. 9 (1), 4731(2018).
  12. Russell, F. A., King, R., Smillie, S. J., Kodji, X., Brain, S. D. Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).
  13. Wang, J., et al. Visualizing the calcitonin gene-related peptide immunoreactive innervation of the rat cranial dura mater with immunofluorescence and neural tracing. Journal of Visualized Experiments. (167), e61742(2021).
  14. Wulf, E., Deboben, A., Bautz, F. A., Faulstich, H., Wieland, T. Fluorescent phallotoxin, a tool for the visualization of cellular actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4498-4502 (1979).
  15. Banerji, S., et al. LYVE-1, a new homologue of the CD44 glycoprotein, is a lymph-specific receptor for hyaluronan. Journal of Cell Biology. 144 (4), 789-801 (1999).
  16. Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).
  17. Liang, H., et al. CUBIC protocol visualizes protein expression at single cell resolution in whole mount skin preparations. Journal of Visualized Experiments. (114), e54401(2016).
  18. Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).
  19. Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).
  20. Ashrafi, M., Baguneid, M., Bayat, A. The role of neuromediators and innervation in cutaneous wound healing. Acta Dermato-Venereologica. 96 (5), 587-594 (2016).
  21. Wang, J., et al. A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater. Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).
  22. Chazotte, B. Labeling cytoskeletal F-actin with rhodamine phalloidin or fluorescein phalloidin for imaging. Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2010).
  23. Breslin, J. W., et al. Lymphatic vessel network structure and physiology. Comprehensive Physiology. 9 (1), 207-299 (2018).
  24. Schwager, S., Detmar, M. Inflammation and lymphatic function. Frontiers in Immunology. 10, 308(2019).
  25. Hagan, I. M. Staining fission yeast filamentous actin with fluorescent phalloidin conjugates. Cold Spring Harbor Protocol. (6), (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Skin InnervationHairy SkinGlabrous SkinTissue ClearingFluorescent StainingConfocal MicroscopySensory Nerve FibersBlood VesselsLymphatic VesselsCGRP Staining

Похожие статьи